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Artigo de método

Engenharia de Células Assassinas Naturais do Receptor de Antígeno Quimérico Direcionadas a Infecções Fúngicas Usando o Sistema de Transposon da Bela Adormecida Não Viral

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DOI:

10.3791/67424

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4 de outubro de 2024

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1Medizinische Klinik und Poliklinik II und Lehrstuhl für Zelluläre Immuntherapie, Medizinische Klinik und Poliklinik II, Universitätsklinikum Würzburg, 2Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie IZI, Außenstelle Würzburg Zelluläre Immuntherapie

Neste artigo

Resumo

Descrevemos um protocolo de transfecção para a produção de células assassinas naturais do receptor de antígeno quimérico (CAR-NK) direcionadas a patógenos fúngicos usando o sistema de transposon não viral da Bela Adormecida. Para avaliar a ativação específica do antígeno, co-cultivamos as células modificadas com tubos germinativos de Aspergillus fumigatus e medimos a secreção de IFN-γ.

Resumo

As terapias celulares baseadas no receptor de antígeno quimérico (CAR) mostraram eficácia impressionante no tratamento de neoplasias hematológicas. Recentemente, essas terapias estão sendo desenvolvidas para doenças infecciosas, mas estudos direcionados a infecções fúngicas permanecem escassos. Para identificar alvos ideais e otimizar produtos celulares, desenvolvemos um método para projetar células quiméricas do receptor de antígeno natural killer (CAR-NK) e avaliamos sua resposta à estimulação por fungos. Este artigo descreve um método simples e robusto para gerar células CAR-NK adaptadas a alvos fúngicos usando o sistema de transposon não viral Sleeping Beauty. As células NK-92 são transfectadas com a transposase hiperativa SB100X vetorizada como DNA de minicírculo (MC) junto com um transposon CAR codificado por plasmídeo. A eficiência da transfecção é avaliada 1 semana depois usando análise de citometria de fluxo. Antes do teste funcional, as células que expressam o transgene são enriquecidas usando classificação de células ativadas por magnetismo e cultivadas por mais 1 semana. Para avaliar a ativação específica do antígeno, as células modificadas são co-cultivadas com tubos germinativos de Aspergillus fumigatus por pelo menos 6 h. Posteriormente, a concentração do interferon-gama secretado (IFN-γ) é medida usando um ensaio imunoenzimático.

Introdução

Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) é um fungo onipresente, com uma pessoa média inalando entre 100 e 1.000 conídios diariamente1. Em pacientes com imunodeficiências adquiridas ou congênitas, como aqueles submetidos a quimioterapia ou que sofrem de leucemia, A. fumigatus pode resultar em apsergilose invasiva grave. A cada ano, mais de 200.000 pessoas em todo o mundo contraem aspergilose. Apesar do uso de antimicóticos para prevenção e terapia com derivados azólicos, a taxa de mortalidade permanece entre 30% e 95%2,3. Além disso, o tratamento tem efeitos colaterais significativos, e 7% das culturas de A. fumigatus já são resistentes aos azóis4.

A terapia com células T modificadas pelo receptor de antígeno quimérico (CAR) tem mostrado sucesso clínico no tratamento de doenças malignas e alcançado resultados pré-clínicos promissores no combate a doenças infecciosas, como a aspergilose invasiva 5,6,7,8. Nossas células Af-CAR-T descritas anteriormente visando uma proteína na parede celular de hifas de A. fumigatus mostraram resultados promissores em modelos pré-clínicos6.

O risco reduzido de doença do enxerto contra o hospedeiro, síndrome de liberação de citocinas e neurotoxicidade torna as células CAR-NK uma alternativa valiosa às células CAR-T como um tratamento "pronto para uso" para infecções agudas9. Além disso, as células NK demonstraram desempenhar um papel crucial na resposta imune antifúngica. Quando estimuladas com A. fumigatus, as células NK secretam citocinas como IFN-ɣ e quimiocinas como CCL-3 e CCL-4 e liberam grânulos citotóxicos10,11.

A linhagem celular NK-92 é uma fonte popular de células NK para engenharia genética, oferecendo a vantagem de rápida proliferação e expansão em condições de cultura relativamente simples12. Vários estudos pré-clínicos demonstraram o potencial terapêutico das células NK-92 transduzidas por CAR no tratamento de tumores hematológicos e sólidos. Numerosos ensaios clínicos estão em andamento para investigar sua segurança, eficácia e uso potencial como terapia celular "pronta para uso"13.

Alcançar altas eficiências de transfecção e expressão de transgene estável em células NK é um desafio. Embora os métodos virais prometam alta eficiência, eles apresentam o risco de mutações de inserção com subsequente oncogênese 9,14. A última geração de vetores de transposon da Bela Adormecida (SB) oferece um sistema seguro, potente e economicamente viável para transferência estável de genes, superando as limitações dos métodos de entrega de genes virais e não viraistransitórios 15.

Portanto, este protocolo descreve uma nova metodologia para a geração de células Af-CAR-NK-92, que podem potencialmente servir como uma opção terapêutica "pronta para uso" para pacientes com aspergilose invasiva com risco de vida. A eficácia dessa abordagem é exemplificada pelo aumento da produção de IFN-ɣ após estimulação com hifas de A. fumigatus .

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Protocolo

Todas as experiências aqui descritas devem ser conduzidas em condições estéreis. Neste protocolo, mostramos duas condições: (I) Transfecção simulada sem DNA que servirá como controle e (II) Transfecção de CAR usando o Af-CAR6 descrito anteriormente. O plasmídeo Af-CAR contém uma sequência truncada do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFRt) a jusante do CAR, que será usada como marcador de transfecção (Figura Suplementar S1). Para cada condição, são necessárias 4 × 106 células NK-92.

1. Cultura das células NK-92

  1. Um ou dois dias antes da transfecção, prepare meio de cultura de células frescas com a seguinte composição: 75% (v/v) de meio alfa-MEM (com nucleosídeos) + 12,5% (v/v) de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS) + 12,5% (v/v) de soro de cavalo inativado pelo calor + 2 mM de L-glutamina.
  2. Ressuspenda pelo menos 107 células NK-92 a uma densidade celular de 5 × 105 células / mL.
  3. Adicione IL-2 à suspensão celular na concentração de 150 UI/mL.
  4. Cultivar as células numa incubadora humidificada a 37 °C com 5% de CO2.
    NOTA: A IL-2 pode ser usada em uma concentração final de 5 ng/mL.

2. Transfecção não viral

  1. Verifique a qualidade das células ao microscópio. Uma suspensão de aglomerados de células e um fundo claro indicam uma cultura de células saudável.
  2. Em uma placa de 6 poços, adicione 2 mL de meio de cultura de células por poço para cada condição. Coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2.
    NOTA: Os antibióticos podem reduzir a viabilidade celular após a transfecção. Mantenha o meio livre de antibióticos.
  3. Conte as células e verifique a viabilidade celular usando (por exemplo, coloração com azul de tripano).
  4. Transfira 8 × 106 células NK-92 para um tubo inferior cônico de 15 mL. Centrifugar a 200 × g durante 5 min com uma aceleração e desaceleração de 3. Use este programa para todas as etapas de centrifugação a seguir.
  5. Durante a centrifugação, prepare dois tubos de reação de 1,5 mL. Pipetar o ADN para Af-CAR (8 μg de Plasmid-DNA e 4 μg de SB100X Mini Circle, Quadro 1) para um dos tubos. Mantenha o segundo livre de DNA para ser um controle simulado.
  6. Quando a centrífuga estiver pronta, descarte suavemente o sobrenadante e encha o tubo que contém as células com até 15 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) pré-aquecida.
  7. Centrifugue (etapa 2.4).
  8. Durante a centrifugação, prepare um tubo do sistema de transfecção para cada condição, adicionando 3 mL de tampão eletrolítico em cada tubo. Coloque o primeiro tubo na estação de pipetas.
  9. Quando a centrífuga estiver pronta, descarte suavemente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão de ressuspensão (100 μL / 4 × 106 células).
    NOTA: Evite deixar as células em tampão de ressuspensão por mais de 15-30 min, pois isso reduz a viabilidade celular e a eficiência da transfecção.
  10. Adicione 100 μL da suspensão celular em cada um dos dois tubos de reação. Misture delicadamente.
    NOTA: Evite bolhas de ar durante a pipetagem, pois as bolhas de ar causam arco, o que leva à morte celular.
  11. Pipetar a mistura de células de ADN do primeiro tubo de reacção com a pipeta do sistema de transfecção e inserir a pipeta verticalmente no tubo colocado na estação de pipetas.
    NOTA: Certifique-se de que a ponta se encaixa corretamente.
  12. Defina o primeiro pulso em 1.650 V e o tempo de pulso para 20 ms e pressione Iniciar.
  13. Após a conclusão, ajuste o segundo pulso em 500 V e o tempo de pulso para 100 ms. Pressione Iniciar.
  14. Após a conclusão, remova lentamente a pipeta da estação de pipeta e transfira imediatamente as células para um poço da placa de cultura preparada contendo 2 mL de meio de cultura de células pré-aquecido (consulte a etapa 2.2). Mova suavemente a placa no sentido circular para garantir que as células sejam distribuídas uniformemente.
  15. Para a amostra simulada, retire 100 μL da suspensão celular do tubo de reação livre de DNA (consulte a etapa 2.9) e repita o mesmo procedimento da etapa 2.11 à etapa 2.14, usando um novo tubo e uma nova ponta de pipeta.
  16. Incubar a placa numa incubadora humidificada a 37 °C com 5% de CO2.
  17. Após 30 min de incubação, adicione IL-2 a uma concentração final de 150 UI/mL.

3. Verificação da eficiência da transfecção usando citometria de fluxo

  1. Após 1 semana de cultivo e divisão das células a cada dois dias, coloque 1-5 × 105 células de cada condição em um tubo de fundo redondo de poliestireno.
  2. Lave as células adicionando 1 mL de tampão (PBS + 0,5% (v/v) FBS + 2 mM EDTA); centrifugue e descarte o sobrenadante.
  3. Ressuspenda o pellet celular em 50 μL de tampão. Adicione 1 μL de 7-AAD para detectar as células mortas.
  4. Adicione 5 μL de anticorpo anti-tEGFR-Alexa fluor 647 para corar as células transfectadas.
  5. Incubar durante 20 min a 4 °C.
  6. Lave as células (consulte a etapa 3.2).
  7. Ressuspenda o pellet celular em 200 μL de tampão.
  8. Meça as amostras em um citômetro de fluxo.
    NOTA: Se a eficiência da transfecção não for satisfatória, prossiga com o enriquecimento das células que expressam transgenes.

4. Enriquecimento de células que expressam transgenes por classificação de células ativadas por magnetismo (MACS)

NOTA: Para obter os melhores resultados, inicie o protocolo com 8-10 × 106 células. Todas as etapas de centrifugação são conduzidas a 4 °C.

  1. Prepare o tampão conforme descrito na etapa 3.2. Diluir as células a uma concentração de 1-2 × 106/100 μL com o tampão em um tubo inferior cônico de 15 mL.
  2. Adicione 1 μL de biotina anti-EGFRt por 1-2 × 106 células e gire suavemente o tubo para garantir uma solução uniformemente distribuída.
  3. Incubar durante 25 min a 4 °C e, em seguida, encher o tubo com até 10 ml de tampão.
  4. Centrifuga. Descarte o sobrenadante.
  5. Adicione 8 μL / 1 × 106 células de tampão frio.
  6. Adicione 2 μL de esferas magnéticas anti-biotina por 1 × 106 células.
  7. Incubar durante 15 min a 4 °C.
  8. Lave enchendo até 10 mL com tampão.
  9. Centrifuga. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 500 μL de tampão.
  10. Coloque uma coluna LS no ímã MACS e lave com 3 mL de tampão.
  11. Assim que o buffer tiver migrado completamente pela coluna, adicione a suspensão da célula.
  12. Lave a coluna 3x, cada uma com 3 mL de tampão.
  13. Remova a coluna do ímã e coloque-a em um tubo inferior cônico limpo de 15 mL.
  14. Adicione 5 mL de tampão à coluna. Usando o êmbolo, lave as células positivas para EGFR o mais rápido possível.
  15. Cultive as células por alguns dias; Em seguida, verifique a eficiência por citometria de fluxo.

5. Testes funcionais

NOTA: Para o próximo experimento, prepare e use o seguinte meio: RPMI + 20% FBS.

  1. Dia 1 - Semeando conídios de Aspergillus fumigatus
    1. Preparar uma suspensão de conídios de A. fumigatus a uma concentração de 2,5 × 105 conídios/ml no meio.
    2. Em uma placa de cultura de 96 poços, pipetar 100 μL da suspensão de conídios por poço e incubar a 25 ° C por 16 h.
      NOTA: Após o período de incubação, os conídios germinarão (Figura 1).
  2. Dia 2 - Co-cultura com células CAR NK-92
    1. Lave as células Mock e Af-CAR NK-92 2x com o meio.
    2. Co-cultura com o fungo em uma proporção efetor-alvo de 2: 1, adicionando 5 × 104 células em 100 μL de meio por poço (Figura 2).
    3. Para controle positivo, adicione 1 ng de PMA e 100 ng de ionomicina por poço em 100 μL de meio. Use células no meio apenas como controle negativo.
    4. Incubar a placa a 37 °C numa incubadora de CO2 humidificada durante pelo menos 6 h.
    5. Centrifugue a placa a 300 × g durante 5 min.
    6. Colha 100 μL de cada poço; Evite tocar no fundo. Transferir os sobrenadantes para tubos de reacção.
      NOTA: Certifique-se de que apenas o sobrenadante esteja pipetado e não o fungo cultivado. Em caso de dúvida, adicione outra etapa de centrifugação.
    7. Execute o IFN-ɣ ELISA seguindo as instruções do fabricante ou armazene as amostras a -80 °C até o uso.

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Resultados

Todo o processo de geração de células Af-CAR NK-92, incluindo transfecção, recuperação, enriquecimento e expansão, leva aproximadamente 14 dias. Após a transfecção, as células são cultivadas e divididas a cada dois dias. A viabilidade celular pode diminuir durante a primeira divisão dois dias após a transfecção. Normalmente, as células se recuperam 4 dias após a transfecção e começam a proliferar, com um tempo de duplicação de 48 h.

Após a recuperação, as eficiências de transfecção são medidas...

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Discussão

O protocolo fornecido oferece um método simples e confiável para criar células CAR-NK que têm como alvo patógenos fúngicos usando o sistema de transposon não viral da Bela Adormecida. Esse método permite a inserção estável e permanente de grandes transgenes, o que possibilita a expansão das células para obter as quantidades necessárias para posterior análise 14,16.

Vários fatores-chave podem afetar o s...

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Divulgações

M.H.: Inventor em pedidos de patentes e patentes concedidas relacionadas à tecnologia CAR, licenciadas em parte para a indústria. Co-fundador e proprietário de capital T-CURX GmbH, Würzburg. Honorários dos palestrantes: BMS, Janssen, Kite/Gilead, Novartis. Apoio à pesquisa: BMS. M. B. relata apoio de viagem da empresa farmacêutica "Eli Lilly and company", que não está relacionado a este estudo. Os demais autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

O financiamento e o apoio ao projeto foram fornecidos pela Wilhelm Sander Stiftung, projeto 2020.017.1 para M.H., e J.L.; Deutsche Forschungsgemeinschaft (Centro de Pesquisa Colaborativa / Transregio 124 Fungos patogênicos e seu hospedeiro humano: Redes de interação-FungiNet; projeto A8 para M.H. e H.E.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de fundo cônico de 15 MLGreiner Bio-One188271PP, 17/120 MM, CELLSTAR, ESTÉRIL
Tubos de fundo cônico de 50 MLGreiner Bio-One227270PP, 30/115 MM, CELLSTAR, ESTÉRIL Placa
de cultura de células de 6 e 96 poçosCorning Inc. LifeSciences83-3736/ 83-3474TC Placas de poços múltiplos, fundos planos, tratadas para fixação celular ideal, esterilizadas por irradiação gama, 7-AAD não pirogênico
(7-aminoactinomicina D)BD Biosciences559925corante de ácido nucleico fácil de usar para a exclusão de células não viáveis em ensaios de citometria de fluxo
Anticorpo anti-EGFR humano Alexa Fluor 647Biolegend352918Clone AY13
MicroBeads Anti-Biotina UltraPureMiltenyi Biotec130-105-637UltraPure MicroBeads conjugado com anti-biotina monoclonal de camundongo anticorpos
Aspergillus fumigatusATCC46645
Pontas de Filtro da Biosfera (20 e 100 μ L) Sarstedt70.3030.365 / 70.3030.275
Dulbecco′ s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537  Modificado, sem cloreto de cálcio e cloreto de magnésio, líquido, filtrado estéril, adequado para cultura celular, endotoxina, testado
ELISA MAX Deluxe Set Human IFN-γBiolegend430104 Solução de
sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma-AldrichE7889para biologia molecular, 0.5  M em H2O, DNase, RNase, NICKase e protease, nenhuma detectada, 0,2 μ m filtrado.
FACS cleanBD Biosciences340345
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003
FACS Solução de enxágueBD Bioscience340346
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF7524filtrado estéril, adequado para cultura de células, inativado por calor antes do uso
Gibco, MEM α, nucleosídeosThermofisher Scientific22571020Vermelho de fenol, ribonucleosídeos, desoxirribonucleosídeos, bicarbonato de sódio
Soro de cavaloThermo Fisher Scientific16050122Filtrado estéril, inativado por calor antes do uso
IL-2 humano IS, grau de pesquisaMiltenyi Biotec130-097-742Grau de pesquisa. O ED50 é ≤ 0,3 ng/mL, correspondendo a uma atividade de ≥ 3 &vezes; 106 UI/mg.
IonomicinaSigma-AldrichI0634-1MGde Streptomyces conglobatus, usada como controle positivo para secreção de citocinas 
L-GlutaminaSigma-AldrichW368401Para cultura de células
MACS LS ColunaMiltenyi Biotec130-042-401  Colunas e êmbolos, embalados estéreis
NK-92DSMZACC 488
Neon Transfektionssystem 100  μ L-KitThermo Fisher ScientificMPK10096Resuspension Buffer R, Eletrolítico Buffer E2, 100 μ L Pontas de Neon, Tubos de Eletroporação de Neon
Phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA)Sigma-AldrichP1585-1MGusado como controle positivo para secreção de citocinas 
Tubo de fundo redondo de poliestireno, 5 mLBD BioscienceS-452400usado para citometria de fluxo
Tubo de reação, 1,5 MLGreiner Bio-One7,26,90,001PP, transparente, tampa anexada, com graduação injetada. Esterilizado antes do uso. 
RPMI 1640 Medium, GlutaMAXThermo Fisher Scientific72400021GlutaMax I,  Vermelho de fenol, HEPES,
TipOne 1000 filtrado estéril μ Ponta de Filtro Graduada L XLStarLabS1122-1730
Equipment
BD FACSCaliburBD Bioscience
CO2 Incubadora C60 Lavadora de microplacas Labotect
Heraeus Multifuge 3SRThermo Scientific
HydroFLEX Sistema de
NanoQuant Infinite M200 ProInvitrogen
Pipetas Separador MACS Quadro Eppendorf
Miltenyi Biotec
Transfecção de Néon Tecan

Referências

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