Artigo de método

Avanços em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos que expressam o receptor natural killer do antígeno quimérico derivado de células-tronco

DOI:

10.3791/67438

⸱

14 de fevereiro de 2025

 , 
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, University of California, San Diego, 2Sanford Stem Cell Institute, University of California, San Diego

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um método para diferenciar e expandir células assassinas naturais que expressam o receptor de antígeno quimérico derivado de iPSC humano (CAR) com morte aprimorada contra várias malignidades. Este protocolo demonstra a diferenciação e expansão de células CAR-NK derivadas de iPSC otimizadas para natural killer (NK) e a medição da atividade antitumoral contra várias linhagens de células tumorais.

Resumo

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As células natural killer (NK) são células imunes inatas que desempenham um papel crucial na defesa do corpo contra tumores e infecções virais. A geração de células NK derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) que expressam células NK emergiu como um caminho promissor para a imunoterapia contra o câncer "pronta para uso". Aqui, utilizamos uma construção CAR otimizada para células NK que inclui o domínio transmembrana de NKG2D, o domínio co-estimulatório 2B4 e o domínio de sinalização CD3ζ, que demonstrou estimular a atividade antitumoral mediada por células NK específicas do antígeno robusto. O uso de iPSCs para geração de células CAR NK oferece várias vantagens, incluindo expressão homogênea de CAR, escalabilidade, reprodutibilidade e potencial para aplicação clínica. Este protocolo passo a passo detalhado, desde a engenharia celular até a diferenciação, permite a geração de células NK que expressam CAR derivadas de iPSC otimizadas para células NK, fornecendo uma imunoterapia padronizada e direcionada ao câncer com atividade antitumoral aprimorada e destacando seu potencial como uma opção de tratamento promissora para várias malignidades.

Introdução

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As células NK, um tipo de linfócito dentro do sistema imunológico inato, são fundamentais na defesa inicial contra tumores e células infectadas por vírus 1,2,3. Ao contrário das células T, as células NK não requerem apresentação de antígeno por meio de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Em vez disso, as células NK têm um repertório de receptores ativadores e inibitórios que regulam sua atividade3. A atividade citotóxica mediada por células NK utiliza vários mecanismos, incluindo a liberação de perforina e granzimas, o envolvimento de receptores de morte e a produção de citocinas pró-inflamatórias, como IFN-γ e TNF-α. Este modo de ação único posiciona as células NK como um candidato atraente para a imunoterapia contra o câncer, particularmente no tratamento de cânceres sólidos, onde a evasão imunológica é um obstáculo significativo 1,2,3,4.

O carcinoma hepatocelular (CHC) é uma das formas mais comuns e mortais de câncer de fígado em todo o mundo5. As abordagens terapêuticas tradicionais, incluindo cirurgia, quimioterapia e radioterapia, geralmente fornecem benefícios clínicos limitados e resultam em altas taxas de recorrência 6,7. Avanços recentes na imunoterapia e terapia direcionada impactaram significativamente o tratamento do CHC 8,9. Inibidores de checkpoint imunológico, como nivolumabe e pembrolizumabe, mostraram resultados promissores ao aumentar a resposta das células imunes contra células cancerígenas10,11. Essas terapias levaram a melhores taxas de sobrevivência e melhor qualidade de vida para alguns pacientes. No entanto, também podem causar efeitos adversos relacionados ao sistema imunológico, o que pode limitar seu uso em certos pacientes12. Terapias direcionadas, como sorafenibe e lenvatinibe, inibem especificamente as vias que promovem o crescimento de células cancerígenas e a angiogênese13. Esses tratamentos têm eficácia conhecida para controlar a progressão da doença e prolongar a sobrevida 8,14. No entanto, a resistência às terapias direcionadas geralmente se desenvolve e os efeitos colaterais do tratamento são comuns15,16. Entre os caminhos promissores nas estratégias imunoterapêuticas contra o câncer, o advento das células CAR T do receptor de antígeno quimérico (CAR) revolucionou o tratamento do câncer, especialmente no tratamento de neoplasias hematológicas, como linfoma e mieloma múltiplo 17,18,19.

As células NK que expressam CAR, combinando a atividade citotóxica inata das células NK com o direcionamento preciso da tecnologia CAR, representam uma abordagem inovadora e potencialmente transformadora para tumores sólidos como o CHC 20,21,22,23,24. As células projetadas por CAR podem reconhecer e matar especificamente as células tumorais que expressam o antígeno alvo, poupando os tecidos normais, reduzindo assim o risco de efeitos fora do alvo associados às terapias convencionais25 , 26 , 27 . As células CAR-NK produzidas a partir de células NK isoladas do sangue periférico ou do sangue do cordão umbilical são tipicamente produzidas pela transdução de células NK com construções CAR que consistem em um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular, um domínio transmembrana e domínios de sinalização intracelular necessários para ativação e proliferação 28,29,30.

O desafio de projetar uma população estável e homogênea de células NK funcionalmente projetadas para tratamento clínico pode ser enfrentado empregando células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) 31 , 32 . A engenharia de iPSCs humanas com CARs otimizados para células NK fornece um sinal aprimorado de ativação e proliferação de células NK e fornece uma população inesgotável e homogênea de células NK que expressam CAR como uma "terapia pronta para uso" padronizada 20 , 33 . Neste protocolo, a modificação genética de iPSCs para gerar células NK derivadas de iPSC que expressam CAR envolve a integração de uma construção CAR otimizada para células NK que inclui domínios transmembrana e sinalização derivados de células NK (NKG2D-2B4-CD3ζ) e um scFv anti-glipicano-3 (GPC3) conforme descrito em nossos estudos anteriores23. As iPSCs geneticamente modificadas são então diferenciadas e expandidas usando um protocolo de diferenciação de células NK desenvolvido anteriormente34. Essas células NK derivadas de iPSC que expressam CAR projetadas têm a capacidade de reconhecer e eliminar HCC e outras células tumorais que expressam antígenos específicos associados a tumores, como o Glypican 3 (GPC3), que é superexpresso em CHC e outras malignidades 35,36,37,38.

A aplicação de células CAR-NK derivadas de iPSC para o tratamento de diversos tipos de câncer é uma promessa significativa 30,39,40; muitas dessas células CAR-NK derivadas de iPSC estão atualmente em ensaios clínicos 41,42,43. Para facilitar o avanço nesta área, este protocolo permite a produção eficiente de células CAR-NK derivadas de iPSC projetadas, desde a engenharia celular até a diferenciação em células NK maduras e expansão in vitro.

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Protocolo

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1. Método de cultura sem alimentador de iPSCs humanos

NOTA: Descongele as iPSCs humanas indiferenciadas congeladas e cultive-as com o uso de mTeSR 1-plus em placas pré-revestidas com Matrigel (doravante denominada matriz de membrana basal [BMM]), conforme descrito anteriormente 23,34. É muito importante garantir que os iPSCs não sejam diferenciados antes e depois da engenharia. As iPSCs recém-descongeladas devem ser cultivadas por cerca de 2-3 passagens para exibir morfologia de pluripotência consistente com as células-tronco pluripotentes humanas. As instruções a seguir são usadas para passar células de um poço de uma placa de 6 poços.

  1. Antes de passar pelos iPSCs, cubra a nova placa de 6 poços com 1x BMM (1 mL/poço) e incube em uma incubadora a 37 °C por 2-4 h antes de usar.
  2. Preparação de 1x BMM solubilizado.
    1. Descongele um frasco de estoque de 5 mL de BMM a 4 ° C durante a noite.
    2. Aliquota rapidamente o BMM usando pontas pré-resfriadas em tubos de microcentrífuga pré-resfriados.
    3. Conservar a -80 °C até 6 meses.
    4. Para preparar a solução de trabalho 1x BMM, ressuspenda uma alíquota BMM na proporção de 1:100 em um meio DMEM/F12 frio. A solução de trabalho 1x BMM pode ser armazenada a -4 °C por 2 semanas.
    5. Cubra a placa com volume suficiente para cobrir a superfície (por exemplo, use 1 mL por poço de placa de 6 poços).
    6. Incubar em incubadora a 37 °C durante 2-4 h antes de utilizar.
  3. Descongele um frasco para injetáveis de iPSCs congelados (normalmente 1 × 106 células/frasco) em banho-maria a 37 °C.
  4. Adicione gradualmente os iPSCs descongelados em um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de meio mTeSR Plus pré-aquecido, permitindo que as células se aclimatem adicionando-as gota a gota para minimizar o choque celular.
  5. Centrifugue as células a 300 × g por 5 min.
  6. Aspire o sobrenadante e lave as células uma vez com 5 mL de PBS.
  7. Ressuspenda as células em meio mTeSR Plus e plaquee-as a uma densidade de aproximadamente 200.000 células/3 mL/poço na placa pré-revestida de 6 poços BMM.
  8. Passagem iPSCs.
    1. Assim que as iPSCs atingirem 70-80% de confluência, aspire o meio e realize a passagem de célula única com TrypLE por 5 min a 37 ° C (1 mL / poço em placa de 6 poços).
    2. Após 5 min, adicione 3 mL de 1x PBS para interromper a reação de dissociação e lave as células uma vez com 3 mL de PBS.
    3. Centrifugue as células a 300 × g por 5 min. Após a lavagem, ressuspenda os iPSCs de célula única em meio mTeSR Plus e, em seguida, coloque na placa de 6 poços pré-revestida com BMM.
      NOTA: O volume total de mídia necessário é de 3 mL/poço em uma placa de 6 poços. O meio precisa ser trocado a cada 2-3 dias, e a etapa 1.8 deve ser repetida quando as células se tornarem 70-80% confluentes por pelo menos 1-2 passagens antes de projetar os iPSCs.
  9. Verifique regularmente a pluripotência das iPSCs. Manchar as iPSCs com TRA-1-81 conjugado com aloficocianina (APC) e anticorpo antígeno-4 embrionário específico em estágio conjugado PE-Cy7 (SSEA-4) por 30 min no gelo e, em seguida, analisá-las usando citometria de fluxo conforme descrito anteriormente23,41.
    NOTA: As iPSCs usadas neste experimento são adaptadas ao TrypLE. As iPSCs que não foram passadas anteriormente com TrypLE normalmente requerem de 8 a 10 passagens para se tornarem totalmente adaptadas ao TrypLE, o que garante a produção de corpos embrióides de spin (EBs) de alta qualidade.

2. Engenharia de iPSCs humanos para expressar CAR anti-GPC3 usando o vetor piggyBac

  1. Cubra uma nova placa de 6 poços com BMM e incube a 37 °C por pelo menos 1 h (pode ser mais longo, desde que o líquido não seque).
  2. Pré-aqueça o mTeSR Plus com 10 μM de inibidor da proteína quinase (ROCK) (Y-27632) (a partir de 1 mM de estoque preparado em água destilada estéril) a 37 °C.
  3. Ligue o sistema de nucleofecção. Selecione a unidade X e, em seguida, selecione os locais dos poços a serem transfectados. Escolha a solução P3 e insira manualmente o código (CA-137).
  4. Colha iPSCs a 70-80% de confluência com 1 mL de TrypLE e incube a 37 ° C por 5 min. Verifique ao microscópio para confirmar a dissociação.
  5. Pipete 4-6 vezes para obter uma suspensão de célula única, depois neutralize com 5 mL de PBS e pellet a 300 × g por 5 min.
  6. Lave suavemente as células mais uma vez para remover todos os vestígios de TrypLE.
  7. Ressuspenda em 1 mL de mTeSR Plus com Rock-Inhibitor e conte as células.
  8. Para criar iPSCs CAR anti-GPC3, use 1 × 106 células por transfecção em um tubo de microcentrífuga e gire a 300 × g por 5 min.
  9. Durante a rotação, combine o DNA do transposon que expressa CAR com o vetor de expressão da super transposase PiggyBac em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL na proporção de 3:1 (por exemplo, 3 μg de plasmídeo contendo o transposon para 1 μg de plasmídeo de transposase).
  10. Inclua um controle positivo de proteína fluorescente verde (GFP) (Tabela de Materiais) usando 0,5 μL de solução de 1 mg / mL e um controle negativo não transfectado para confirmar a expressão de GFP.
  11. Ressuspenda cuidadosamente o pellet celular em 20 μL de solução de nucleofector P3 à temperatura ambiente (RT) com o suplemento fornecido no kit de nucleofecção. Em seguida, adicione essa mistura a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo DNA de plasmídeo, resultando em um volume final de aproximadamente 22-25 μL.
    NOTA: Ressuspenda todos os iPSCs a serem transfectados na solução de nucleofector P3 antes de adicionar plasmídeos GPC3 CAR ou plasmídeo de controle GFP às células.
  12. Transfira a suspensão celular / DNA para uma tira de 20 μL de 16 poços. Certifique-se de que a amostra cubra o fundo da cubeta sem bolhas.
  13. Bata suavemente as tiras de 16 poços na bancada para remover quaisquer bolhas de ar e assentar as células na parte inferior.
  14. Coloque as tiras de 16 poços contendo iPSCs e mistura de DNA CAR no sistema de nucleofecção, selecione o programa CA-137, solução P3 e inicie o programa. Este programa terminará em 1 s e mostrará uma marca verde.
  15. Adicione 80 μL de mTeSR Plus pré-aquecido com meio inibidor de ROCK ao poço e transfira cuidadosamente as células para a placa de 6 poços revestida com BMM (volume final de 1 mL por poço).
  16. Verifique brevemente as células sob o microscópio de fluorescência após 4 h para qualquer expressão de GFP para confirmar a taxa de sucesso da transfecção.
  17. Rastreie iPSCs para expressão de GFP para avaliar a eficiência da transfecção 24 h após a transfecção usando citometria de fluxo23,41 para confirmar a expressão de GFP.
  18. Incubar durante 4 dias a 37 °C, mudando o meio conforme necessário antes de proceder à seleção do medicamento.
    NOTA: Cada nucleofecção requer 0,2-2 x 106 iPSCs por reação. Dependendo do número de reações, podem ser utilizadas placas de 24 poços ou placas de 6 poços.

3. Seleção clonal e confirmação de pluripotência de iPSCs GPC3-CAR

  1. Realize uma série de seleções de zeocina (1:10.000) nas iPSCs transfectadas para selecionar clonalmente as iPSCs que expressam GPC3-CAR.
  2. Para confirmar a eficiência da transfecção, medir a expressão de GFP usando um microscópio fluorescente e citometria de fluxo23,41.
    NOTA: A construção CAR é incorporada com uma tag FLAG44,45 com o objetivo de avaliar a expressão de CAR durante o estágio iPSC e após a diferenciação da célula NK.
  3. Manter as iPSCs CAR transfectadas sob seleção de medicamentos até que atinjam a expressão ideal do gene CAR e GFP.
  4. Para garantir a expressão homogênea de GFP e CAR, estenda a duração da seleção do medicamento por 2-3 semanas.
  5. Realize a classificação celular com base na expressão de GFP ou CAR usando citometria de fluxo para obter uma população homogênea de iPSCs selecionados clonalmente23.
  6. A construção CAR usada aqui contém um marcador de seleção de drogas zeocina. Selecione as células transfectadas do gene GPC3 CAR adicionando zeocina (50 μg/mL de zeocina) ao meio de cultura.
  7. Após a seleção da zeocina, dilua as iPSCs transfectadas com o gene GPC3 CAR e coloque-as em uma placa de 96 poços para obter aproximadamente uma célula por poço. Isso pode ser feito por meio de diluição em série ou usando um classificador de células.
    NOTA: Use a classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para isolar células transfectadas únicas com base na expressão de um marcador fluorescente ligado à construção CAR.
  8. Permita que as células individuais se expandam em colônias na placa de 96 poços.
  9. Alimente as células com meio de cultura fresco a cada 3-4 dias uma vez e monitore os poços quanto ao crescimento da colônia.
  10. Rastreie as colônias para expressão CAR. Isso pode ser feito por reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) ou Western blotting para verificar a presença da construção CAR23,47.
  11. Alternativamente, use citometria de fluxo23,41 para detectar a expressão superficial da proteína CAR.
    NOTA: Neste estudo, a expressão CAR foi quantificada pela expressão da tag FLAG usando citometria de fluxo.
  12. Além disso, realize o cariótipo para identificar quaisquer anormalidades cromossômicas.
    NOTA: Isso pode ser feito por organizações terceirizadas, como Wicell (wicell.org) ou Thermo Fisher Scientific (thermofisher.com).
  13. Uma vez que os clones positivos para CAR sejam identificados sem nenhuma anormalidade, expanda esses clones em vasos de cultura maiores, como placa de 6 poços e frasco T75.
  14. Criopreservar os iPSCs CAR expandidos clonalmente usando um meio de criopreservação em vários frascos para uso futuro.
    NOTA: Os seguintes pontos são recomendados nesta etapa: (i) Mantenha as condições ideais de cultura para iPSCs para evitar a diferenciação. (ii) Aguarde de 1 a 4 semanas para atingir uma população homogênea de expressão de CAR e GFP em iPSCs após a seleção do medicamento. (iii) Continuar a monitorar as células quanto à estabilidade da expressão de CAR e marcadores de pluripotência. (iv) Use controles apropriados durante as etapas de triagem e verificação. (v) Após a seleção e expansão clonal, verifique a pluripotência avaliando a expressão de TRA-1-81 e SSEA-4 nas iPSCs que expressam CAR.

4. Geração de células progenitoras hematopoiéticas a partir de iPSCs CAR projetadas por formação de corpo embrióide de spin (EB)

NOTA: Um protocolo de spin EB ou organoide hematopoiético é usado para produzir progenitores hematopoiéticos23,34. As células dentro dos EBs se diferenciam em células estromais para apoiar o desenvolvimento de linfócitos38, eliminando assim a necessidade de células estromais derivadas de xeno como OP9 23,34,48. Abaixo estão as instruções para coletar células de um único poço de uma placa de 6 poços para formação de EB.

  1. Passagem ~ 200.000 células/poço de placa pré-revestida com BMM de 6 poços 2 dias antes da formação do EB de spin. Certifique-se de atingir 70-80% de confluência no dia da configuração dos EBs de spin. Geralmente, 1 poço de uma placa de 6 poços é suficiente para duas placas de spin EB.
  2. Remover o meio de cultura e separar as células incubando com 1 ml de TrypLE Select pré-aquecido a 37 °C 5 min.
  3. Dissocie cuidadosamente os agregados celulares em uma única suspensão celular usando uma micropipeta de 1 mL e transfira as células para um tubo cônico de 15 mL. Adicione 3 mL de 1x PBS para interromper a reação de dissociação e lave as células uma vez com 3 mL de PBS.
  4. Ressuspenda as células em meio mTesR Plus e filtre através de um filtro de células de 70 μM para remover agregados.
  5. Gire as células para remover o sobrenadante e lave as células novamente com 5 mL de PBS. Em seguida, ressuspenda as células em 1 mL de meio STEMdiff APEL (meio de formação EB).
  6. Conte e dilua as células até a densidade apropriada usando o meio de formação EB contendo as seguintes citocinas (SCF: 40 ng / mL, BMP4: 20 ng / mL, VEGF: 20 ng / mL) mais 10 μM de inibidor de ROCK.
  7. Semeie 3000-10000 células/poço em 100 μL de meio (100.000 células/mL) nas placas de 96 poços.
    NOTA: O número de células usadas na formação de EB pode variar dependendo da linha iPSC. Recomenda-se testar entre 3.000 e 10.000 células por poço em placas de 96 poços.
  8. Usando uma pipeta multicanal, carregue a suspensão celular em placas de 96 poços a 100 μL / poço.
    NOTA: Para uma melhor formação de corpos embrióides (EBs), recomenda-se o uso de placas de 96 poços de fundo redondo de fixação ultrabaixa.
  9. Centrifugue a placa de 96 poços a 300 × g por 5 min e, em seguida, incube as placas a 37 ° C com 5% de CO2 por 6 dias.
    NOTA: Estudos preliminares descobriram que 6 dias são suficientes para dar origem a >30% de células CD34+ para as linhas CAR iPSC neste estudo.
  10. Verificar a qualidade do EB por citometriade fluxo 23,41.
    1. Prepare 4 mL de tripsina a 0,25% pré-aquecida com soro de frango a 0,4% (16 μL para 4 mL de tripsina) para dissociar EBs.
    2. Transfira 10-30 EBs para um tubo cônico de 15 mL.
    3. Adicione a solução de tripsina / soro de frango aos EBs e incube em banho-maria por 10 min, vórtice a cada 30 s para garantir a dissociação completa dos EBs.
    4. Pipetar os EBs tripsinizados. Misture para cima e para baixo várias vezes para dissociar completamente o EBS.
    5. Adicione 5 mL de 1x PBS para interromper o processo de tripsinização.
    6. Filtrar a solução celular através de um filtro de células de 70 μm num novo tubo cónico.
    7. Centrifugue as células a 300 x g por 5 min.
    8. Aspire o sobrenadante e ressuspenda em 3-5 ml de meio fresco.
    9. Contar as células, corar com marcadores típicos de EB, como CD34, CD31, CD43 e CD45, e analisar por citometria de fluxo 23,41 (Figura 3).
    10. Adicionar o volume recomendado de anticorpos de acordo com as instruções do fabricante a cada tubo contendo células individuais dissociadas de EB em 100 μL de tampão de fluxo e incubar em gelo por 30 min39,41.
    11. Após a incubação, lave as células duas vezes com tampão de fluxo, adicione a coloração azul SYTOX viva/morta e analise usando citometria de fluxo.
      NOTA: Normalmente, >30% de células CD34+ são obtidas da população total de corpos embrióides Spin dissociados no dia 6 usando as iPSCs usadas neste estudo, embora essa porcentagem possa variar dependendo da fonte de iPSC e das condições de cultura.

5. Diferenciação de células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC de Spin EBs

NOTA: Os EBs de spin que expressam GPC3 CAR podem ser transferidos para placas de 24 poços ou placas de 6 poços revestidas com gelatina a 2% ou sem revestimento. Para mudanças médias, placas de 6 poços são mais adequadas, enquanto o revestimento de gelatina a 2% aumenta a fixação dos EBs.

  1. Prepare placas de 6 poços revestidas de gelatina seguindo as etapas abaixo.
    1. Prepare uma solução de gelatina a 2% (p/v) dissolvendo a gelatina em água de cultura de tecidos.
    2. Esterilize a solução em autoclave a 121 °C, 15 psi durante 30 min.
    3. Cubra a superfície de cada poço com 5-10 μL de solução de gelatina por cm2 (~ 1 mL por poço de uma placa de 6 poços).
    4. Incubar as placas a 37 °C durante 2-4 h antes de utilizar. Após a incubação, aspire qualquer solução de gelatina restante antes de prosseguir com a transferência de EBs.
  2. Prepare o meio de diferenciação de células NK: Adicione 56,6% DMEM + GlutaMAX-I, 28,3% F12 + GlutaMAX-I, 15% de soro AB humano inativado por calor, 1% P / S, 2 mM L-glutamina, 1 μM β-mercaptoetanol, 5 ng / mL de selenito de sódio, 50 μM de etanolamina e 20 mg / L de ácido ascórbico. Conservar a 4 °C no escuro.
  3. Adicione 3 mL de meio de diferenciação NK contendo as seguintes citocinas a cada poço das placas de 6 poços revestidas com gelatina (IL-3: 5 ng/mL, SCF: 20 ng/mL, IL-7: 20 ng/mL e IL-15: 10 ng/mL).
  4. No dia 6, transfira Spin EBs diretamente para as placas de 6 poços revestidas com gelatina preparadas contendo meio de diferenciação NK seguindo as etapas abaixo.
    1. Transfira cuidadosamente os EBs de placas de 96 poços para um prato de 10 cm, usando uma pipeta sorológica de 10 mL para remover a maior parte do meio.
    2. Adicione 3 mL de meio de diferenciação NK contendo as citocinas acima a cada poço da placa de 6 poços revestida com gelatina.
    3. Distribua 16-20 EBs em cada poço da placa de 6 poços usando uma micropipeta de 1 mL.
      NOTA: Em média, os EBs de uma única placa de 96 poços podem ser usados para semear uma placa de 6 poços para a placa de diferenciação NK.
  5. Realize alterações médias a cada 5-7 dias. Após a primeira semana de diferenciação de células NK, exclua a IL-3 do meio.
    NOTA: Após 14 dias, o meio precisa ser trocado a cada 3-4 dias.
  6. Continue as mudanças médias por 3-4 semanas. Avaliar a expressão de marcadores de células NK (CD45+CD56+) por citometria de fluxo24,42 em células em suspensão.
  7. Quando >80% das células em suspensão expressam CD45+CD56+, colha as células passando-as por um filtro de 70 μm para remover quaisquer aglomerados.
  8. Co-cultura de células NK colhidas com 100 aAPCs irradiados com cinza34,48 e cultura em meio de expansão NK contendo IL-2 (100ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL).

6. Expansão de células NK derivadas de CAR iPSC anti-GPC3

NOTA: Normalmente, um rendimento de 2-20 × 106 células NK pode ser obtido de uma única placa de 6 poços, mesmo antes da expansão. Para facilitar a expansão das células NK para aplicações a jusante, as células apresentadoras de antígenos artificiais (aAPCs) são empregadas para gerar células NK >1 × 109 .

  1. Utilize células K562 projetadas expressando 41BBL e IL-21 ligada à membrana (41BBL-mbIL-21)48 como aAPCs para induzir a expansão das células NK.
  2. Antes de co-cultivar aAPCs com células NK, irradie aAPCs com 100 gray e preserve-os como estoques congelados.
  3. Colha as células em suspensão da placa de 6 poços e cultive as células NK em meio de expansão NK suplementado com 50 U / mL de IL-2 e IL-15 (10 ng / mL; a ser adicionado fresco) a uma densidade de 5 × 105 células / mL.
  4. Adicione aAPCs irradiados descongelados às células NK na proporção de 1:1.
  5. Reabasteça o meio de cultura a cada 3-4 dias, adicionando IL-2 e IL-15 frescos a uma concentração de 50 U / mL e 10 ng / mL, respectivamente.
  6. Garantir que as células NK derivadas de CAR iPSC mantenham a capacidade de expansão por um período de >3 meses, mantendo a viabilidade celular e a atividade citolítica.

7. Caracterização fenotípica e funcional de células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC

NOTA: A caracterização das células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC envolve uma avaliação abrangente de seu perfil fenotípico e atividade funcional.

  1. Avalie a expressão dos receptores de ativação NK, incluindo CD45, CD56, CD94, CD16, NKp30, NKp44, NKp46, NKG2D, DNAM, TRAIL e FasL, nas células NK derivadas de CAR iPSC anti-GPC3 por meio de citometriade fluxo 24,42 para determinar a atividade das células CAR NK e o status de maturação (Figura 4).
  2. Avaliar a atividade funcional in vitro de células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC usando ensaios de Caspase-3/7 baseados em citometria de fluxo, ensaios de liberação de grânulos CD107a, ensaios de liberação de citocinas IFN-γ e TNF-α contra vários alvos tumorais.
  3. Para o ensaio Caspase3/7, siga os passos abaixo.
    1. Contar as células-alvo e corá-las previamente com corante fluorescente de traçado celular a uma concentração final de 5 μM em PBS durante 15 min a 37 °C.
    2. Lave as células-alvo coradas em um meio de cultura completo antes da co-cultura com células NK derivadas de CAR iPSC em várias proporções efetor / alvo (E:T) a 37 ° C.
    3. Após 3 h e 30 min de co-cultura, adicionar o reagente de detecção verde Caspase-3/7 por mais 30 min de incubação, resultando em um tempo total de incubação de 4 h.
    4. Adicione 1 μL de solução de coloração de células mortas durante os 5 minutos finais de coloração e misture suavemente.
    5. Analisar as células coradas por citometria de fluxo23,41 (Figura 5).
  4. Implemente este protocolo para garantir uma compreensão abrangente das características fenotípicas e da atividade funcional das células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC, permitindo uma avaliação robusta de seu potencial terapêutico.
    NOTA: Normalmente, leva de 4 a 5 semanas para obter células CD45 + CD56 + >90% da diferenciação de células NK derivadas de GPC3 CAR iPSC baseadas em spin EB e condições de expansão NK usando linhas GPC3 CAR iPSC. Algumas linhagens de células iPSC podem exigir apenas 3 semanas e algumas linhagens podem demorar mais (cerca de 4-5 semanas).

8. Solução de problemas de itens e soluções

NOTA: A solução de problemas de diferenciação, expansão e teste funcional de células GPC3 CAR NK derivadas de iPSC usando o método de corpo embrióide de spin (EB) pode envolver várias etapas. Abaixo estão alguns problemas comuns que podem ser encontrados, juntamente com soluções sugeridas:

  1. Sintomas de formação inconsistente de EB
    1. Verifique se os EBs são muito pequenos ou muito grandes, com formas irregulares.
  2. Solução para a formação inconsistente de EB
    1. Ajuste a velocidade e a duração da centrífuga usada para formar EBs. Uma velocidade de cerca de 200-300 × g por 5-10 min é típica.
    2. Certifique-se de que as placas de fundo em U apropriadas ou placas de cultura de fixação ultrabaixa sejam usadas para facilitar a formação de EB.
    3. Confirme se as iPSCs são homogêneas e livres de células diferenciadas que podem afetar a formação de EB.
  3. Sintomas de má diferenciação de iPSCs em células NK
    1. Verifique se há baixa expressão de marcadores de células NK (por exemplo, CD56, NKp46).
    2. Verifique se há falha na formação de EBs ou EBs mal formados.
  4. Solução para má diferenciação de iPSCs em células NK
    1. Certifique-se de que as concentrações de fatores de crescimento essenciais (por exemplo, VEGF, BMP4, Y-27632, FLT3, IL-15, IL-7, SCF e IL-3) sejam ideais para a formação de EB e diferenciação de células NK. Ajuste as concentrações com base em estudos anteriores 23,34,41.
    2. Certifique-se de que a densidade de semeadura inicial das iPSCs seja apropriada. Normalmente, uma densidade de 8000-10.000 células/100 μL é recomendada para a formação de EB de spin.
    3. Verifique se o meio de diferenciação está formulado corretamente, incluindo os suplementos necessários (por exemplo, alternativas sem soro ou soro, outras citocinas).
    4. Reserve tempo suficiente para a formação de EB, no mínimo 6 dias a até 12 dias antes de mudar para o meio de diferenciação de células NK.
  5. Sintomas de má expansão das células NK
    1. Verifique se há rendimento celular limitado durante a expansão.
    2. Verifique se há viabilidade reduzida de células NK expandidas.
  6. Soluções para má expansão de células NK
    1. Aumentar a concentração de IL-15 e IL-2 durante a fase de expansão. Isso pode aumentar significativamente a proliferação de células NK.
    2. Considere o uso de células alimentadoras, como aAPCs irradiados, para melhorar a sobrevivência e a expansão das células NK.
    3. Monitore a densidade celular regularmente e passe as células antes que atinjam a superlotação para manter as condições ideais de crescimento.
  7. Sintomas de resultados de testes funcionais abaixo do ideal
    1. Verifique se há citotoxicidade reduzida contra as células-alvo.
    2. Verifique se há baixos níveis de secreção de citocinas (por exemplo, IFN-γ, TNF-α).
  8. Soluções para resultados de testes funcionais abaixo do ideal
    1. Otimize a relação alvo-efetor em ensaios de citotoxicidade. Comece com uma proporção de 10:1 e ajuste com base nos resultados.
    2. Certifique-se de que as células NK sejam adequadamente ativadas antes dos ensaios funcionais. Isso pode incluir pré-estimulação com citocinas ou cocultura com aAPCs irradiados.
    3. Verificar a sensibilidade da linhagem celular alvo à lise mediada por células NK. Use destinos confidenciais conhecidos como controles.
    4. Prolongar a duração dos ensaios funcionais para dar tempo suficiente à manifestação da atividade das células NK.
  9. Sintomas de níveis variáveis de expressão de CAR
    1. Verifique se há expressão de CAR inconsistente entre as células NK.
  10. Soluções para níveis variáveis de expressão CAR
    1. Verifique a eficiência do método de transfecção CAR (por exemplo, transdução viral, eletroporação). Ajuste as condições de MOI (multiplicidade de infecção) ou eletroporação, se necessário.
    2. Implemente marcadores de seleção apropriados para enriquecer as células CAR+ NK. Use a seleção de antibióticos ou a classificação de marcadores fluorescentes, conforme necessário.

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Resultados

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Diagrama esquemático da diferenciação e expansão de células NK derivadas de iPSC anti-GPC3-CAR
O diagrama esquemático ilustra a diferenciação in vitro de células NK projetadas anti-GPC3-CAR derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) e uma representação esquemática do vetor piggyBac carregando a construção GPC3 CAR. Inicialmente, as iPSCs não modificadas são transfectadas com um vetor piggyBac que codifica o GPC3 CAR (receptor de antígeno quimérico). Após a transfe...

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Discussão

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Este protocolo descreve uma abordagem padronizada e reprodutível para gerar células NK derivadas de iPSC que expressam CAR a partir de uma fonte celular consistente com o objetivo de facilitar a imunoterapia contra o câncer direcionada "pronta para uso". Vários estudos pré-clínicos e clínicos mostraram a eficácia da imunoterapia adotiva baseada em células NK no tratamento de cânceres, minimizando toxicidades, como doenças do enxerto contra o hospedeiro (GvHD) ou síndrome de liberação de ...

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Divulgações

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DSK é cofundador e consultor da Shoreline Biosciences e tem participação acionária na empresa. DSK também presta consultoria para Therabest e RedC Bio, pelas quais recebe renda e/ou patrimônio. Os termos desses acordos foram revisados e aprovados pela Universidade da Califórnia, San Diego, de acordo com suas políticas de conflito de interesses. Os demais autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

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Agradecemos a todos os membros do laboratório Kaufman por seu apoio, percepções científicas e discussões. Esses estudos foram apoiados pelos subsídios do NIH / NCI U01CA217885, P30CA023100 (suplemento administrativo) e pelo Sanford Stem Cell Institute da UCSD. JT: redação e revisão do manuscrito. DSK: revisou e editou o manuscrito.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
aAPC Laboratório Dean A. Lee N/A
meio de cultura a-MEM Fisher Scientific Cat#12634
APC anti-DYKDDDDK (FLAG Tag)BD Biosciences Cat#637308
APC-anti-humano TRA-1-81 ThermoFisher17-8883-42 
APC-CD16BD Biosciences Cat#302015
APC-CD43 BD BiosciencesCat# 560198 
APC-CD45 BD BiosciencesCat# 555485 
APC-GPC3BD Biosciences Cat#DB100B
APC-NKG2D BD BiosciencesCat# 558071 
Reagente de Detecção Verde Caspase-3/7 CellEvent Pescador térmicoCat#C10423
Kit de Proliferação de Células Violetas CellTrace Pescador térmicoCat#C34571Corante fluorescente de rastreamento celular 
Solução CryoStor Stem Cell Technologieshttps://www.stemcell.com/products/cryostor-cs10.htmlMeio de criopreservação
CTS NK XpanderGibcoA5019001
CTS NK-Xpander MediumLife TechnologiesCat#A5019001
DMEMGibco11965084
DMEM, glicose alta, suplemento GlutaMAX, piruvatoGibco10569010
Kit de Enriquecimento de Células NK Humanas EasySepStemCell Technologies, Inc. Cat#19055
EtanolaminaSigma AldrichE9508
Soro fetal bovino Fisher Scientific Cat# 10437010
FITC-CD94 BD BiosciencesCat#555888
Suplemento GlutaMAXGibco35050061
GolgiPlug BD BiosciencesCat#555029
GolgiStop BD BiosciencesCat#554724
Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX Suplemento Gibco31765035
Horse serum Fisher Scientific Cat#16050130
Soro Humano Humanas AB Sigma-AldrichCat#BP2525100
Lonza Cat# VPH-5012
Humano: Células HePG2ATCC Gato#HB-8065
Humano: Células HePG2-td-tomate-luc Dan S. Kaufman labN/A
Humano: células iPS Laboratório de Dan S. Kaufman N/A
Humano: Células SNU-449ATCCCat#CRL-2234
Humano: Células SNU-449-td-tomato-luc Dan S. Kaufman labN/A
IncuCyte Caspase-3/7 Green Apoptosis Assay Essenbiociência Cat#4440
Ácido L-AscórbicoSigma AldrichA5960
MP Biomedicals  Soro Humano, Tipo ABMP BiomedicalsICN2938249
mTeSR maisStemCell Technologies, Inc. 100-0276
NovoExpress software ACEA Biosciences 
PE/Cy7 anti-humano SSEA-4 Anticorpo Biolegend330420
PE-CD16 BD BiosciencesCat#560995 
PE-CD226BD Biosciences Cat#559789
PE-CD34 BD BiosciencesCat# 555822 
PE-CD45 BD BiosciencesCat# 555483 
PE-CD94 BD BiosciencesGato#555888 
PE-cy7-CD56 BioLegendCat# 318318 
Ligante PE-FAS BD BiosciencesCat#564261 
PE-NKp30BD BiosciencesCat# 558407
PE-NKp44 BD BiosciencesCat#558563 
PE-NKp46BD Biosciences Cat#331908
PE-NKp46 BD BiosciencesCat#557991 
Casaco buffy de sangue periféricoBanco de Sangue de San Diego (https://www. sandiegobloodbank.org/) N/A
PE-TRAIL BD BiosciencesCat#565499 
pKT2-mCAG-IRES-GFP-ZEO Laboratório Branden Moriarity N/A
pMAX-GFP plasmídeoLonzaN/AGFP controle positivo 
Prism 9Graphpad Versão 9
pSpCas9 GenScriptPX165
RBC Lysis Buffer (10x)BiolegendCat#420301
Recombinante humano bFGF basic R& D Systems Cat#4114-TC
BMP-4 humano recombinante PeproTechCat#120-05
Ligante FLT-3 humano recombinante PeproTechCat# 300-19 IL-15
humano recombinante PeproTechCat# 200-15
IL-2 humano recombinante PeproTechCat# 200-02
IL-3 humano recombinante PeproTechCat#200-03
IL-7 humano recombinante PeproTechCat# 200-07
Proteína Nodal Humana RecombinanteR& D Systems Cat#3218-ND-025
SCF humano recombinante PeproTechCat# 300-07
TGF Humano Recombinante-β 1PeproTechCat#100-21
VEGF humano recombinante PeproTechCat# 100-20
RPMI1640Gibco11875093
Selenito de sódioSigma Aldrich214485
STEMdiff APEL 2 MédioStemCell Technologies, Inc. 5270EB formação média
STEMdiff APEL2 Medium StemCell Technologies, Inc. Cat#05270
Super piggyBac Vetor de expressão de transposaseSBICat#PB210PA-1
SYTOX AADvanced Kit de coloração de células mortasThermoFisher ScientificS10274, S10349Kit de solução de coloração de células mortas
β-mercaptoetanolGibco21985023
Kit de Nucleofector de Células-Tronco https://www.agilent.com/en/product/research-flow-cytometry/flow-cytometry-software/novocyte-novoexpress-software-1320805

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