Desenvolvimento de um sistema de protoplastos de repolho para estudo da tolerância à hipóxia em brássicas

Resumo

Este protocolo descreve um sistema eficiente de protoplastos de mesofilo de repolho. Vários tratamentos deficientes em oxigênio foram testados, e o sistema mostrou uma alta ativação de genes responsivos à hipóxia, facilitando estudos dos mecanismos genéticos e moleculares de tolerância ao alagamento em vegetais de Brassicaceae .

Resumo

À medida que as mudanças climáticas trazem chuvas mais fortes, o repolho, um vegetal chave de Brassicaceae , enfrenta perdas significativas de rendimento devido ao estresse de hipóxia induzido por inundações. Para identificar mecanismos de tolerância a inundações em repolhos, é necessária uma plataforma versátil para estudos genéticos funcionais para superar a natureza recalcitrante de transformação dos repolhos. Neste estudo, foram desenvolvidos um sistema de expressão transitória de protoplastos de repolho e um protocolo de indução de hipóxia de protoplastos correspondente. Este protocolo alcançou um alto rendimento e integridade do isolamento de protoplastos de folhas de couve, com uma eficiência de transfecção superior a 40% usando condições enzimáticas otimizadas. Para aliviar a potencial influência hipóxica antes dos tratamentos, a solução W5 foi borbulhada com gás oxigênio para aumentar os níveis de oxigênio dissolvido. Vários produtos químicos para ajustar os níveis de oxigênio e tratamentos fisiológicos de eliminação de oxigênio foram testados, incluindo EC-Oxyrase, OxyFluor, sulfito de sódio e um pacote de absorvedor de oxigênio. Ensaios de dupla luciferase mostraram que os promotores dos genes de resposta respiratória anaeróbia BoADH1 e BoSUS1L foram ativados em protoplastos de repolho após tratamentos de hipóxia, com o maior nível de indução observado após o tratamento com o pacote absorvedor de oxigênio. Em resumo, o sistema de expressão transitória do protoplasto do repolho combinado com o tratamento da hipóxia demonstra uma plataforma eficiente e conveniente. Esta plataforma pode facilitar estudos da função gênica e mecanismos moleculares associados às respostas à hipóxia em repolhos.

Introdução

A mudança climática global exacerbou as inundações, que surgiram como uma questão cada vez mais crítica em todo o mundo. Nas últimas décadas, houve uma tendência de aumento na frequência de eventos de inundação, resultando em perdas substanciais de safra ^1,2. O repolho (Brassica oleracea var. capitata L.), uma hortaliça de significativa importância mundial, é suscetível aos efeitos adversos de chuvas intensas, necessitando do desenvolvimento de cultivares de repolho tolerantes a inundações para garantir uma produção sustentável diante de eventos climáticos extremos. Portanto, entender os mecanismos moleculares associados ao estresse de inundação em repolho é essencial para enfrentar esse desafio.

Para entender os mecanismos de regulação gênica em plantas sob condições submersas, linhagens transgênicas são amplamente utilizadas para estudos genéticos funcionais. No entanto, essa abordagem é limitada por altos custos, processos de transformação e subcultura demorados, bem como baixas eficiências de transformação em muitas espécies de culturas, necessitando do desenvolvimento de metodologias alternativas. Sistemas de expressão transiente baseados em protoplastos têm sido amplamente aplicados na pesquisa molecular de plantas como uma alternativa versátil e eficiente. Esses sistemas facilitam as investigações sobre a atividade do promotor, vias de sinalização em resposta a pistas ambientais, interações proteína-proteína ou proteína-DNA e localização subcelular³. O estabelecimento de sistemas de expressão transitória de protoplastos tem sido relatado não apenas em plantas modelo ^4,5, mas também em culturas economicamente importantes, como cana-de-açúcar⁶, cravo⁷, orquídeas Phalaenopsis ⁸ e berinjela⁹. Além disso, esses sistemas foram implementados com sucesso em plantas lenhosas, incluindo Camellia oleifera¹⁰e Populus trichocarpa¹¹. No entanto, os protocolos de aplicação de sistemas de protoplastos para estudar vegetais folhosos sob estresse de hipóxia induzida por submersão são limitados. Portanto, um protocolo integrado foi desenvolvido neste trabalho para os interessados em estudar as respostas à hipóxia em vegetais folhosos usando um sistema de expressão transitória de protoplastos de repolho.

Para realizar a resposta de hipóxia induzida por submersão no nível celular, várias metodologias de eliminação de oxigênio foram empregadas em estudos anteriores para simular ambientes hipóxicos. Isso inclui o uso de EC-Oxyrase, OxyFluor, sulfito de sódio e bolsas consumidoras de oxigênio. A EC-Oxirase é normalmente usada para tratamento anaeróbico em linhagens celulares humanas¹² e protoplastos Arabidopsis ¹³. O OxyFluor foi considerado eficaz na mitigação do fotobranqueamento causado por espécies reativas de oxigênio durante a imagem de fluorescência de células vivas^14,15. O sulfito de sódio tem sido empregado no tratamento anaeróbio de nematóides¹⁶ e, mais recentemente, em protoplastos de arroz, em conjunto com técnicas como ensaios de imunoprecipitação da cromatina (ChIP)¹⁷. Pacotes absorvedores de oxigênio, usados principalmente para cultura bacteriana anaeróbica¹⁸, também demonstraram eficácia na indução da ativação de promotores de ZmPORB1 em protoplastos de milho sob condições anaeróbias¹⁹.

O presente trabalho tem como objetivo estabelecer um pipeline robusto para isolamento e expressão transitória de protoplastos de repolho. Posteriormente, a eficácia de vários tratamentos de ajuste de oxigênio foi avaliada avaliando a atividade promotora de genes de resposta anaeróbica usando ensaios de luciferase dupla. Prevê-se que o protocolo desenvolvido neste estudo seja valioso para futuras pesquisas relacionadas ao estresse de submersão ou hipóxia em sistemas Brassica .

Protocolo

Duas cultivares comerciais de repolho (B. oleracea var. capitata) foram utilizadas neste estudo: 'Fuyudori' e '228'. Uma representação gráfica do fluxo de trabalho do protocolo é mostrada na Figura 1. Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de mudas de repolho

1. Semeie sementes de repolho 'Fuyudori' e '228' usando substrato de planta comercial em orifícios redondos quadrados (D 4,5 cm x H 4,5 cm) de bandejas de 48 poços (L 49 cm x W 28 cm x H 5 cm). Incorpore as sementes com aproximadamente 1 cm de profundidade no meio de cultivo.
2. Cultive mudas de repolho em uma sala de crescimento a 22 ° C com um ciclo claro-escuro de 16/8 h. Manter a intensidade luminosa de 100 μmol ^m-2·^s-1 (tubo fluorescente branco) durante a fase de luz.
3. Após 2-3 semanas de crescimento, use mudas de repolho no estágio de 2 folhas para posterior isolamento do protoplasto do mesofilo.
   NOTA: O tamanho sugerido das mudas de repolho é um estágio de 2 folhas, no qual a segunda folha verdadeira é totalmente expandida, mas a terceira folha verdadeira não é expandida e seu comprimento é menor que 1 cm (Figura 2A). Para sincronizar os estágios de desenvolvimento das mudas de repolho, as sementes de 'Fuyudori' precisam ser semeadas aproximadamente 2 dias antes das sementes de '228' devido às suas diferentes taxas de crescimento. Esse ajuste garante crescimento e maturidade uniformes entre as plantas de repolho no estágio desejado.

2. Isolamento de protoplastos de repolho

1. Prepare 12,5 mL de solução enzimática (Tabela 1) antes de cada isolamento do protoplasto.
   1. Pré-aqueça uma solução com 10 mM MES (pH 5,7) e 0,6 M de manitol a 55 °C. Continue aquecendo a solução a 55 °C por 10 min após adicionar 1,5% de Celulase R10 e 0,75% de Macerozyme R10.
   2. Depois que a solução enzimática esfriar até a temperatura ambiente (25 ° C), adicione 10 mM de CaCl₂ e 0,1% de albumina de soro bovino (BSA). Esterilizar o filtro da solução enzimática preparada para uma placa de Petri de 9 cm utilizando um filtro de seringa de 0,22 μm.
      NOTA: O pré-aquecimento da solução aumenta a solubilidade enzimática e inativa a protease. Os efeitos da digestão variam dependendo dos diferentes tipos de enzimas celulase. A combinação de Cellulase R10 e Macerozyme R10 é adequada para isolamento de protoplastos de repolho.
2. Colete as segundas folhas verdadeiras recém-expandidas de cinco a oito mudas de repolho e corte-as em tiras de 0,5-1,0 mm usando uma lâmina de barbear afiada. Transfira imediatamente as tiras de folhas para a solução enzimática recém-preparada.
   NOTA: Selecionar folhas saudáveis e designadas do repolho no estágio adequado é crucial. As segundas folhas verdadeiras recém-expandidas de mudas de repolho no estágio de 2 folhas fornecem a maior eficiência de isolamento de protoplastos. Plantas maduras demais, cotilédones ou folhas envelhecidas não são recomendados para isolamento de protoplastos. Cinco a doze folhas verdadeiras bem expandidas podem produzir protoplastos de repolho com sucesso em 12,5 mL de solução enzimática. O número de folhas necessárias para o isolamento do protoplasto depende da quantidade desejada de protoplastos necessários. Normalmente, os protoplastos obtidos de cinco a oito folhas são suficientes para procedimentos experimentais subsequentes.
3. Após infiltração a vácuo no escuro por 30 min (Figura 2B), mantenha as tiras de folhas de repolho imersas na solução enzimática (Figura 2C) no escuro em temperatura ambiente por mais 4-16 h.
   NOTA: O tempo de digestão enzimática pode variar entre as cultivares de repolho e deve ser otimizado de acordo com o genótipo específico. Por exemplo, 'Fuyudori' requer um tempo de digestão mais longo (16 h) em comparação com '228' (4 h) devido às folhas mais grossas de 'Fuyudori'.
4. Dilua a solução contendo protoplastos com um volume igual de solução W5, que consiste em 2 mM de MES (pH 5,7), 154 mM de NaCl, 125 mM de CaCl₂, 5 mM de KCl e 5 mM de glicose (consulte a Tabela 1 para preparação), para interromper a digestão enzimática.
5. Solte a suspensão do protoplasto girando suavemente ou usando um agitador orbital. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm para um tubo cónico de 50 ml.
   NOTA: Os protoplastos isolados são capazes de passar por um filtro de células de 70 μm, enquanto os restos vegetais não digeridos são retidos pelo filtro e posteriormente removidos da suspensão. Os filtros celulares podem ser reutilizados e mantidos em etanol a 75% após a lavagem, mas é necessário enxaguar totalmente os filtros celulares com solução W5 para remover o etanol residual antes do uso.
6. Centrifugar a solução de protoplastos com 150 x g durante 2 min a 4 °C e retirar cuidadosamente o sobrenadante. Lave suavemente os protoplastos peletizados adicionando 10 mL de solução W5 ao longo da parede do tubo cônico a uma taxa de fluxo aproximada de 1 mL · ^s-1. Centrifugar o tubo a 150 x g durante 2 min a 4 °C e repetir este procedimento de lavagem novamente para garantir a remoção completa da solução enzimática.
7. Ressuspenda os protoplastos na solução W5 e coloque-os no gelo por 30 min. Após a incubação do gelo, remova o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL de cada vez até que todo o sobrenadante seja removido.
8. Ressuspenda os protoplastos em uma solução MMG pré-resfriada com gelo composta de 4 mM de MES (pH 5,7), 0,4 M de manitol e 15 mM de MgCl₂ (consulte a Tabela 1 para preparação).
9. Meça a concentração de protoplastos com um hemocitômetro e ajuste a concentração final para 4 x 10⁵ protoplastos · ^mL-1 usando solução MMG.

3. Transfecção de protoplastos

1. Misture um volume total de 10 μL de plasmídeo (5-10 μg) (Arquivo Suplementar 1) com 100 μL de protoplastos (4 x 10⁴ protoplastos) e coloque no gelo por 10 min.
   NOTA: Para purificação de plasmídeo de grau de transfecção, um kit de plasmídeo disponível comercialmente é usado seguindo as instruções do fabricante. Aproximadamente 4 x 10⁴ protoplastos são normalmente empregados em um ensaio repórter de luciferase dupla. Para experimentos em larga escala, uma quantidade maior de protoplastos está disponível para transfecção. Especificamente, cerca de 2 x 10⁵ protoplastos transfectados com 10 μg de plasmídeo exibem uma eficiência de transfecção comprovada variando de 30% a 40%.
2. Adicione um volume igual (110 μL) de solução de PEG recém-preparada (consulte a Tabela 1 para preparação) contendo 40% de polietilenoglicol 4000 (PEG4000), 0,1 M de CaCl₂ e 0,2 M de manitol na solução de protoplasto e misture suavemente.
3. Incubar a mistura de protoplastos à temperatura ambiente no escuro durante 10 min, depois adicionar 440 μL de solução W5 para terminar a reacção.
4. Centrifugue os protoplastos transfectados a 150 x g por 2 min a 4 ° C e ressuspenda o pellet em 750 μL de solução W5 enriquecida com oxigênio. Transfira os protoplastos ressuspensos para uma placa de cultura de tecidos de 6 poços pré-revestida com 1% de BSA.
   NOTA: A solução W5 usada para incubação celular deve ser borbulhada com oxigênio usando um concentrador de oxigênio (~ 90% de oxigênio) conectado a uma pedra de ar por 5 min (Figura 2D). Após este processo de oxigenação, a concentração final de oxigênio dissolvido na solução W5 aumentou de 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 a 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, medido com um medidor de oxigênio dissolvido. O volume da solução W5 para ressuspensão do protoplasto transfectado depende do tipo de placa de cultura de células teciduais utilizada. Para placas de cultura de células de 12 ou 24 poços, é aconselhável reduzir o volume da solução W5 para mitigar o estresse por hipóxia durante a incubação devido à profundidade mais profunda dentro dos poços. Para o revestimento BSA, cada poço da placa de cultura recebeu 1 mL de solução BSA a 1%, que foi revestida por 10 s. A solução BSA foi então descartada de cada poço, e os poços foram posteriormente reabastecidos com solução W5. Este procedimento teve como objetivo criar uma superfície temporária não aderente usando BSA, evitando efetivamente que os protoplastos aderissem à superfície plástica da placa de cultura durante as etapas experimentais subsequentes.

4. Tratamento da hipóxia em protoplastos de repolho

1. Realizar tratamentos de hipóxia induzida química ou fisicamente imediatamente após a transfecção de protoplastos.
   NOTA: Recomenda-se que o tratamento da hipóxia seja aplicado imediatamente após a transfecção do protoplasto. A incubação prolongada de protoplastos pode diminuir a resposta subsequente à hipóxia.
   1. Para hipóxia quimicamente induzida em protoplastos de repolho, adicione OxyFluor, EC-Oxyrase e sulfito de sódio à solução de protoplasto W5.
      NOTA: Usando 0,6 unidades · ^mL-1 EC-oxirase, 0,6 unidades · ^mL-1 OxyFluor e 1 g · ^mL-1 sulfito de sódio em W5 foram as condições testadas capazes de induzir o promotor BoADH1 e BoSUS1L (Figura 3A) com baixo dano à integridade do protoplasto nas duas variedades de repolho examinadas.
   2. Para hipóxia induzida por bolsa que consome oxigênio, coloque dois pacotes de absorvedores de oxigênio em um frasco anaeróbico de 3,5 L para criar um ambiente hipóxico.
2. Colha protoplastos tratados com hipóxia centrifugando a 150 x g por 2 min a 4 ° C. Congelar os protoplastos coletados com nitrogênio líquido e armazená-los em um freezer a -80 °C para ensaios subsequentes.

5. Ensaio de luciferase dupla

1. Realize o ensaio repórter de luciferase dupla de acordo com as instruções do fabricante com pequenas modificações.
   1. Ressuspenda os protoplastos de repolho em 50 μL de tampão de lise passiva 1x e vórtice por 10 s.
   2. Incubar protoplastos interrompidos em gelo por 10 min e coletar o sobrenadante após centrifugação a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C.
   3. Adicione 20 μL de lisado celular a cada poço da microplaca. Dispense 100 μL de reagente II do ensaio de luciferase nos poços e meça a atividade da luciferase do vaga-lume usando um leitor de microplacas.
   4. Adicione 100 μL do reagente de ensaio disponível comercialmente a cada poço e meça a atividade da luciferase de Renilla usando um leitor de microplacas.

Resultados

Este trabalho desenvolveu com sucesso um sistema de expressão transitória utilizando protoplastos de repolho (consulte a Figura 1 para fluxo de trabalho). Os protoplastos foram isolados de folhas verdadeiras de repolho de 2 a 3 semanas de idade de tamanho apropriado (Figura 2A) das cultivares comerciais de repolho 'Fuyudori' e '228' usando digestão de celulase / macerozima e infiltração a vácuo escuro (Figura 2B, C). Para mitigar as condições hipóxicas experimentadas pelos protoplastos submersos durante a incubação, a solução W5 foi oxigenada usando um borbulhador de pedra de ar conectado a uma máquina de oxigênio (Figura 2D). Este processo elevou significativamente a concentração de oxigénio dissolvido na solução W5 de 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 a 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1 após 5 min de oxigênio borbulhando. Após o processo de isolamento, o rendimento dos protoplastos foi de 1,04 x 10⁷ para 'Fuyudori' e 4,00 x 10⁶ protoplastos · g ^{− 1} de peso fresco para '228' após um período de digestão durante a noite ( Figura 2E ). Posteriormente, o GFP foi utilizado como gene repórter para avaliar a eficiência de transformação do método de transfecção mediado por PEG, demonstrando que a eficiência de transfecção de protoplastos em repolho foi superior a 40% em ambas as cultivares (Figura 2F), confirmando assim a viabilidade deste sistema.

Além disso, construções promotoras de genes de resposta respiratória anaeróbica de repolho, vetores BoADH1p::Luc e BoSUS1Lp::Luc (Figura 3A), foram introduzidas em protoplastos de repolho como repórteres para avaliar os efeitos de indução hipóxica de vários tratamentos. Vários tratamentos de ajuste de oxigênio também foram aplicados a este sistema modelo de expressão transitória. Os resultados mostraram que todos os tratamentos de sequestro de oxigênio, com exceção do sulfito de sódio, induziram com sucesso uma resposta de hipóxia em protoplastos de repolho (Figura 3B). Especificamente, a atividade promotora do BoADH1 aumentou aproximadamente 2,6 vezes e 3,2 vezes em comparação com o controle após o tratamento com EC-Oxirase e OxyFluor, respectivamente, e, notavelmente, em mais de 7,0 vezes com o tratamento com pacote absorvedor de oxigênio (Figura 3B). Da mesma forma, a atividade do promotor BoSUS1L aumentou cerca de 1,7 vezes e 1,8 vezes com o tratamento com EC-Oxirase e OxyFluor, respectivamente, enquanto o tratamento com pacote absorvedor de oxigênio induziu um aumento substancial de mais de 5,6 vezes ( Figura 3B ). Esses resultados sugerem que o pacote absorvedor de oxigênio demonstra eficácia superior na criação de um ambiente hipóxico neste sistema experimental de protoplastos de repolho.

Figura 1: Representação gráfica do fluxo de trabalho de isolamento de protoplastos. Esta figura ilustra o processo passo a passo envolvido no isolamento de protoplastos do tecido foliar do repolho. O fluxo de trabalho é representado visualmente para fornecer uma compreensão clara do procedimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Isolamento de protoplastos do tecido foliar do repolho. (A) A aparência das variedades comerciais de repolho 'Fuyudori' e '228' no estágio de crescimento recomendado é mostrada. As segundas folhas verdadeiras recém-expandidas (indicadas pela ponta da seta) de repolhos no estágio de 2 folhas são selecionadas para isolamento de protoplastos. Barra de escala: 2 cm. (B) Uma bomba de vácuo e um dessecador são empregados para o processo de infiltração a vácuo de tiras de folhas de repolho, com uma infiltração de 30 min realizada antes da digestão enzimática. (C) A condição das tiras de folhas de repolho durante a digestão enzimática é descrita. A digestão completa do tecido foliar requer um total de 4-16 h. Barra de escala: 3 cm. (D) As fotos demonstram o uso de um concentrador de oxigênio conectado a uma pedra de ar para aumentar a concentração de oxigênio dissolvido na solução W5. Barra de escala: 5 cm. (E) Mais de 4,00 x 10⁶ protoplastos de mesofilo por grama de peso fresco (FW) foram obtidos das variedades de repolho 'Fuyudori' e '228' e foram observados ao microscópio. Barra de escala: 200 μm. (F) A eficiência de transfecção de protoplastos de ambos os genótipos de repolho, usando um repórter GFP expresso constitutivamente, mostra-se acima de 40%. Barra de escala: 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resposta à hipóxia de protoplastos de repolho em condições de deficiência de oxigênio. (A) As construções gênicas de resposta à hipóxia, promotores BoADH1 e BoSUS1L , são utilizadas como repórteres para avaliar a resposta à hipóxia em protoplastos de repolho 'Fuyudori'. (B) Um total de 5 μg de plasmídeos repórteres são transfectados em protoplastos de repolho 'Fuyudori', que são incubados em uma solução W5 borbulhada com oxigênio antes da exposição a tratamentos de hipóxia por 4 h. Os níveis de oxigênio são reduzidos durante a incubação pela adição de EC-oxirase (0,6 unidades · ^mL-1), OxyFluor (0,6 unidades · ^mL-1) e sulfito de sódio (1 g · ^mL-1) à solução W5. O tratamento do pacote absorvedor de oxigênio é realizado colocando duas bolsas absorvedoras de oxigênio em um frasco anaeróbico de 3,5 L. O grupo "CK" representa o grupo controle sem qualquer tratamento para hipóxia. Após o tratamento, os protoplastos são colhidos para um ensaio duplo de luciferase. Cada valor representa a média ± DP, com n = 4. Letras diferentes indicam diferenças significativas (P < 0,05) com base em uma ANOVA de uma via com teste post-hoc de LSD. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Preparação da solução enzimática, solução W5 e solução MMG. Clique aqui para baixar esta tabela.

Arquivo Suplementar 1: Detalhes do plasmídeo para transfecção de protoplasto. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Este protocolo apresenta um método simplificado para isolamento de protoplastos de duas cultivares comerciais de repolho. A eficácia deste método é avaliada principalmente por meio de dois parâmetros críticos de controle de qualidade: o rendimento de protoplastos viáveis e a eficiência da transfecção de protoplastos. A implementação deste protocolo resultou em um rendimento superior a 4,00 x 10⁶ protoplastos · g ^{− 1} · FW do tecido mesofilo de ambas as cultivares de repolho (Figura 2E,F). Esse rendimento é comparável ao relatado em outras espécies, incluindo berinjela, cravo, cana-de-açúcar e Camellia oleifera, onde os rendimentos de protoplastos variaram de 2,5 x 10⁶ a 1,4 x 10⁷ protoplastos · g ^{− 1} · FW 6,7,9,17. Esses resultados sugerem a aplicabilidade potencial do protocolo em diversas origens genéticas com B. oleracea.

O sucesso do protocolo depende de vários fatores críticos. O principal é a utilização de folhas especificadas de mudas de repolho saudáveis em um estágio de crescimento apropriado (Figura 2A). O uso de plantas mais velhas ou insalubres pode resultar em protoplastos de baixa qualidade. Também é crucial cortar cuidadosamente o tecido da folha em tiras de 0,5-1,0 mm e evitar esmagá-lo com uma lâmina cega. O processo de digestão enzimática, com duração entre 4-16 h, é outra etapa crítica. Períodos de digestão inferiores a 4 h podem levar a uma digestão incompleta, enquanto aqueles que excedem 16 h de digestão correm o risco de estresse celular. Notavelmente, genótipos com folhas mais grossas, como 'Fuyudori', podem se beneficiar de tempos de digestão prolongados para maximizar o rendimento do protoplasto. Em contraste, '228' exigiu apenas 4 h para uma digestão completa. Além disso, uma ampla gama de tempos de digestão pode fornecer maior flexibilidade no cronograma experimental. Por exemplo, uma digestão de 4 h permite que o isolamento do protoplasto e os ensaios transitórios subsequentes sejam concluídos em um único dia. Por outro lado, uma digestão de 16 h permite o início da digestão enzimática à noite e permite a conclusão das etapas subsequentes no dia seguinte, o que pode aumentar a conveniência ao aplicar este protocolo. Além disso, é crucial manusear os protoplastos com cuidado durante todo o processo de isolamento do protoplasto devido à sua fragilidade e suscetibilidade ao estresse mecânico.

Para simular condições anaeróbicas representativas do estresse de inundação, este protocolo utilizou agentes comuns de eliminação de oxigênio e bolsas consumidoras de oxigênio para criar ambientes hipóxicos. Para aumentar a eficácia do sistema, uma máquina de oxigênio é empregada para oxigenar a solução W5 (Figura 2D), com o objetivo de reduzir os sinais de resposta hipóxica de fundo em protoplastos de repolho durante o período de incubação pré-tratamento. Um processo de oxigenação de 5 minutos eleva significativamente o nível de oxigênio dissolvido de 7,84 mg· ^L-1 ± 0,05 mg· ^L-1 a 29,18 mg· ^L-1 ± 0,43 mg· ^L-1, indicando um efeito pronunciado no alívio de condições hipóxicas. Entre os métodos de sequestro de oxigênio usados neste estudo, os pacotes absorvedores de oxigênio exibiram desempenho superior, induzindo a maior atividade promotora em dois genes centrais de resposta anaeróbia (Figura 3). Além disso, este método oferece a vantagem adicional de escalabilidade, permitindo o tratamento simultâneo de várias amostras através do uso de bolsas consumidoras de oxigênio em um único frasco anaeróbico, em oposição à aplicação individual de agentes sequestradores de oxigênio em cada placa de cultura de células. Em resumo, os pacotes absorvedores de oxigênio fornecem uma plataforma conveniente e eficaz adequada para avaliar a resposta de protoplastos de repolho sob condições hipóxicas.

Embora este protocolo demonstre várias vantagens, é importante reconhecer suas limitações, particularmente a eficiência de transfecção relativamente modesta dos protoplastos de repolho. Embora essa eficiência não atinja os 90% relatados para Arabidopsis⁵, ela ainda se mostra suficiente para estudos subsequentes bem-sucedidos sobre a atividade do promotor (Figura 3), indicando um potencial significativo para análise funcional nesse sistema.

Dada a importância global do repolho como uma importante cultura vegetal, a integração deste protocolo com tratamentos de hipóxia e técnicas de análise genética promete obter mais informações sobre os mecanismos regulatórios do repolho sob condições de inundação. Tais insights podem potencialmente acelerar o desenvolvimento de variedades de repolho tolerantes a inundações, atendendo a uma necessidade crítica em face de condições climáticas extremas e crescentes eventos de inundação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido etanossulfônico 2-(N-morfolino) (MES)	PhytoTech Labs	M825	Para preparação de solução enzimática
228 sementes de repolho	Takii & Co., Ltd. (Kyoto, Japão)
Tubo cônico de 50 mL	SPL Life Sciences	50050	Para preparação de solução enzimática
Placa de cultura de tecidos de 6 poços	Alpha Plus	16106	Para incubação de protoplastos
70 μ filtro de células m	Sorfa	SCS701	Para filtração de protoplastos
Placa de Petri de 9 cm	Alpha Plus	16001	Para digestão enzimática
Jarra anaeróbica	HIMEDIA	Jarra anaeróbica 3,5 L	Para tratamento de hipóxia
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A7906	Para preparação de solução W5 e revestimento de placa de cultura
Cloreto de cálcio	J.T.Baker	131301	Para solução W5 e preparação de solução PEG
Celulase R10	Yakult		Para preparação de solução enzimática
Desiccator	Tarsons	402030	Para infiltração a vácuo
D-Glucose	Bioshop	GLU501	Para preparação de solução W5
Medidor de oxigênio dissolvido	Thermo Scientific	Orion Star A223	Para medição de oxigênio
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M1902	Para solução enzimática, solução PEG e preparação de solução MMG
Sistema de ensaio Reporter de Luciferase	Dupla Promega	E1960	repórter de luciferase
dupla EC-Oxyrase	Oxyrase Inc.	EC-0005	Para tratamento de hipóxia
Sementes de repolho Fuyudori	Kobayashi Seed Co., Ltd. (Kakogawashi, Japão)
Centrífuga refrigerada de alta velocidade	Hitachi	CR21GIII	Para colheita de protoplastos
Macerozyme R10	Yakult		Para preparação de solução enzimática
Cloreto de magnésio	Alfa Aesar	12315	Para preparação de solução MMG
Microcentrífuga	Hitachi	CT15RE	Para colheita de protoplasto
Microplate	Greiner	655075	Para ensaio repórter de luciferase dupla
Leitor de microplacas	Dispositivos moleculares	SpectraMax Mini	para Ensaio repórter de luciferase dupla
Millex 0,22 μ Filtro de seringa M	Merck	SLGP033RS	Para preparação de solução enzimática
Bomba de Vácuo Livre de Óleo	Rocker	Rocker 300	Para infiltração a vácuo
OxyFluor	Oxyrase Inc.	OF-0005	Para tratamento de hipóxia
Pacote de absorvedor de oxigênio	Mitsubishi Gas Chemical Company	AnaeroPack, MGCC1	Para tratamento de hipóxia
Concentrador de oxigênio	ULTIMATE PERFECT	AII-X	Para borbulhar oxigênio em solução W5
Substrato vegetal	Klasmann-Deilmann	Substrato Potgrond H	Para preparação de mudas de repolho
Kit Midi de plasmídeo	QIAGEN	12145	Para purificação de DNA de plasmídeo de grau de transfecção
Polietilenoglicol 4000	Fluka	81240	Para transfecção de protoplasto
Cloreto de potássio	J.T.Baker	304001	Para preparação de solução W5
Lâmina de barbear	Gillette		Para preparação de tiras de folhas de repolho
Cloreto de sódio	Bioshop	SOD002	Para preparação de solução W5
Sulfito de sódio	Sigma-Aldrich	S0505	Para tratamento de hipóxia
Banho-maria	Yihder	BU-240D	Para preparação de solução enzimática