Relação Quantitativa Estrutura-Atividade, Predição de Atividade e Dinâmica Molecular de Inibidores da Transcriptase Reversa Não Nucleotídica

Summary

Este estudo utilizou estratégias in-silico para identificar a Etravirina Enumerada como um agente terapêutico promissor para o HIV. Nossas descobertas sobre interações e dinâmicas moleculares apóiam o design racional de novos NNRTIs como possíveis alternativas de tratamento do HIV.

Abstract

A crescente incidência de resistência aos medicamentos para o HIV-1 representa um desafio para a eficácia da terapia antirretroviral combinada, particularmente na África Austral. O desenvolvimento de resistência aos inibidores da transcriptase reversa não nucleotídica (ITRNNs) ameaça o sucesso a longo prazo da terapia antirretroviral. Em 2019, a resistência antimicrobiana foi responsável diretamente por cerca de 1,27 milhão de mortes em todo o mundo. Este estudo empregou uma abordagem in-silico para investigar drogas NNTRI e seus derivados. As técnicas utilizadas incluíram cálculos de teoria funcional de densidade, docking molecular, enumeração, análise quantitativa de relação estrutura-atividade (QSAR), simulação de dinâmica molecular (MDS) e mecânica molecular com métodos generalizados de Born e área de superfície. A análise se concentrou em vários derivados de pirimidina e seis medicamentos NNRTI, examinando suas interações com a proteína HIV-1 (código PDB 1HQU).

Um modelo QSAR foi desenvolvido para prever a atividade biológica dos seis NNRTIs sob investigação. Usando 94 derivados de pirimidina, o modelo QSAR alcançou um R² DE 0,822 e um Q² de 0,815, indicando um alto nível de precisão preditiva.

Os MDS foram conduzidos para avaliar a estabilidade de vários ligantes e suas alternativas recém-desenvolvidas, garantindo que eles permanecessem ligados ao sítio ativo da proteína durante um período de simulação de 200 nanossegundos. A etravirina exibiu flutuações de desvio quadrático médio (RMSD) de aproximadamente 4,5 Å, enquanto seus derivados enumerados mostraram flutuações de RMSD de 3,5 Å. Por meio de cálculos de docking molecular, MDS e energia livre, a Etravirine enumerada demonstrou o melhor desempenho, com um valor de atividade de 7,373 e um escore de docking de -10,517 kcal/mol. Além disso, a energia livre de ligação calculada para a Etravirina enumerada foi de -89,684 kcal / mol, superando outros ligantes sob investigação. A melhora significativa sugere que a Etravirina modificada tem um potencial promissor como um novo agente na terapia antirretroviral.

O menor valor de RMSD obtido, as interações aprimoradas de aminoácidos e a maior energia livre de ligação indicam que a Etravirina enumerada pode servir como uma alternativa viável para o tratamento do HIV/AIDS.

Introduction

Apesar dos avanços notáveis no tratamento, a grave ameaça à saúde global da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), causada pelo vírus da imunodeficiência humana-1 (HIV-1), continua sendo uma ameaça persistente¹. Medicamentos antirretrovirais conhecidos como inibidores da transcriptase reversa, ITRs, são usados para tratar a infecção pelo HIV. A transcriptase reversa, uma enzima polimerase viral do ácido desoxirribonucléico (DNA) essencial para a replicação do retrovírus, é inibida por inibidores da transcriptase reversa (ITRs). Os inibidores nucleosídeos da transcriptase reversa (ITRNs) e os inibidores da transcriptase reversa não nucleotídica (ITRNNs) são os principais ITRs².

A terapia antirretroviral altamente ativa (HAART), uma combinação de vários medicamentos antivirais, emergiu como a terapia padrão para o HIV, controlando efetivamente a disseminação da AIDS e transformando essa doença antes fatal em uma condição crônica administrável³. Os ITRNNs para HIV-1 são atualmente uma parte significativa do esquema HAART⁴. A resistência antimicrobiana (RAM) está entre as ameaças globais mais críticas à saúde, com uma estimativa de 1,27 milhões de mortes⁵. Como resultado, há uma necessidade urgente de solucionar problemas de RAM e identificar novos agentes antimicrobianos. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), a RAM atingiu níveis alarmantes em muitas partes do mundo.

Isso representa um grave risco para o alcance dos objetivos de desenvolvimento sustentável, pois prejudica a segurança alimentar, o crescimento econômico e a segurança da saúde, além de contribuir para as desigualdades sociais e econômicas⁶. A prevalência de vírus resistentes a medicamentos está aumentando, mesmo em medicamentos antirretrovirais projetados para combater o HIV. De acordo com estatísticas recentes, quase 30 milhões de pessoas em todo o mundo estavam fazendo terapia antirretroviral no final de 2022⁷.

A OMS realizou 30 pesquisas e descobriu que, em 21 dessas pesquisas, mais de 10% dos indivíduos que iniciaram sua terapia antirretroviral de primeira linha tinham resistência à nevirapina ou ao efavirenz⁸. Além disso, indivíduos com exposição prévia a medicamentos antirretrovirais têm até três vezes mais chances de ter resistência aos ITRNN do que aqueles sem exposição⁹. Estudos revelaram que um número considerável de crianças com menos de 18 meses de idade que foram diagnosticadas com HIV apresentou altas taxas de cepas resistentes a medicamentos^10,11. Surpreendentemente, quase metade deles tinha uma cepa resistente a - (NNRTI) antes mesmo de iniciar o tratamento. Esses achados ressaltam a necessidade de agilizar os estudos para projetar terapias inovadoras para o HIV.

O desenvolvimento de cepas resistentes a medicamentos e os efeitos colaterais indesejáveis do uso prolongado inevitavelmente representaram desafios para o uso clínico de NNRTIs¹². O início da terapia antirretroviral combinada (cART) prolonga a expectativa de vida das pessoas que vivem com HIV, apesar do potencial de efeitos colaterais adversos. Esses efeitos colaterais englobam o risco de desenvolver doenças não transmissíveis, incluindo lipodistrofia, hiperlipidemia, redução da densidade mineral óssea, glicemia elevada levando ao diabetes mellitus tipo 2, hipertensão, aumento do risco de acidente vascular cerebral e problemas relacionados à obesidade¹³. O diagnóstico precoce e o acesso imediato a cuidados médicos adequados na fase inicial da infecção pelo HIV oferecem vantagens consideráveis, tanto do ponto de vista clínico quanto público. O início oportuno da TARV e da profilaxia contra infecções oportunistas leva a uma redução notável na doença e mortalidade relacionadas ao HIV.

O uso de TARV também pode contribuir para um declínio no potencial de transmissão do HIV, reduzindo o nível de ácido ribonucléico circulante do HIV. Além disso, abordar o tratamento de outras doenças sexualmente transmissíveis e coinfecções também pode diminuir a probabilidade de novas infecções pelo HIV¹⁴. Os ITRNNs estão entre as classes de tratamento opcionais de inibidores que interagem com a RT ligando-se à região alostérica ou ao local do HIV. Esse tipo de inibição é comumente conhecido como inibidor não competitivo porque o NNRTI não se liga no sítio ativo do substrato, mas sim na parte externa. O efeito altera a conformação do local de ligação do substrato, impedindo a ligação do substrato padrão e levando ao término prematuro da cadeia. Devido à sua toxicidade reduzida em comparação com os NRTIs, estrutura simples, biodisponibilidade aprimorada em relação aos inibidores de protease e excelente seletividade, os NNRTIs tornaram-se os inibidores do HIV mais atraentes¹⁵. Portanto, a síntese e o desenho de novos ITRNNs são cruciais do ponto de vista farmacocinético^16,17.

Os ITRNNs são vitais no tratamento do HIV/AIDS devido à sua forte eficácia e baixa toxicidade. No entanto, os primeiros ITRNNs como Nevirapina, Delavirdina e Efavirenz encontram resistência de mutações virais no sítio de ligação dos^ITRNN18. Essas drogas, parte da família das diarilpirimidinas (DAPY), exibem atividade potente contra várias cepas de ITRNNs, incluindo aquelas resistentes aos ITRNNs precoces¹⁹, provavelmente devido à sua flexibilidade molecular e maior barreira de resistência contra o HIV-1 ^20,21. Apesar de seu sucesso, a alta taxa de mutação na RT do HIV-1 e a ausência de atividade intrínseca de revisão levaram a novos perfis de resistência em pacientes em uso de Etravirina e Rilpivirina^22,23. Essas mutações virais diferem umas das outras, assim como aquelas associadas aos primeiros medicamentos NNRTI²⁴. Mais de 50 classes estruturalmente diversas de compostos foram identificadas como NNRTIs. Notavelmente, seis ITRNNs obtiveram aprovação para o tratamento do HIV-1. Esses agentes aprovados abrangem Nevirapina (NVP), Delavirdina (DLV), Efavirenz (EFV), Etravirina (ETR), Rilpivirina (RPV) e Doravirina (DOR). A Figura 1 mostra as estruturas químicas desses seis medicamentos NNRTI aprovados²⁵.

Em um estudo recente²⁶, cálculos de DFT e docking molecular sugerem que a lovastatina e a sinvastatina mostram potencial como agentes anti-coronavírus. A triagem virtual identificou cinco novas moléculas candidatas aprovadas pela FDA semelhantes ao andaime de efavirenz, com afinidade de ligação superior na bolsa ativa da protease principal do COVID-19.

Soltan et ^al.27 realizaram um estudo semelhante sobre a identificação de novas moléculas para melhorar a capacidade de ligação à RT do HIV, empregando uma estratégia baseada em fragmentos com medicamentos aprovados pela FDA para projetar derivados químicos. Eles alavancaram especificamente as estruturas de delavirdina, efavirenz, etravirina e rilpivirina como andaimes fundamentais. A semelhança com drogas desses derivados foi avaliada por meio do Swiss-ADME, seguido pelo acoplamento em estruturas cristalinas relacionadas. O estudo concluiu com a seleção de compostos exibindo afinidades de ligação superiores em comparação com seus andaimes originais, observando particularmente uma melhoria mais pronunciada nos derivados projetados a partir dos NNRTIs de segunda geração, etravirina e rilpivirina. Por exemplo, os derivados RPV01 e RPV15 mostraram melhorias significativas nos valores de energia ancorados em relação à rilpivirina, indicando utilidade potencial no direcionamento das formas selvagem e mutante de RT do HIV.

Murugesan e colaboradores²⁸ realizaram pesquisas que propõem várias abordagens de química medicinal para aumentar a eficácia e minimizar a resistência no tratamento do HIV. O estudo empregou hibridização molecular, substituição bioisostérica e triagem de alto rendimento. Em seu estudo, eles conseguiram identificar novos andaimes NNRTI com alta potência contra cepas de HIV de tipo selvagem e resistência a medicamentos. Eles desenvolveram derivados DAPY que exibem excelente seletividade e baixa toxicidade, com alguns compostos mostrando inibição efetiva em concentrações nanomolares.

Ultimamente, o uso de ferramentas computacionais juntamente com a pesquisa in-silico ganhou popularidade devido à sua análise prática das características químicas quânticas de uma droga²⁹. Neste estudo, o design de medicamentos auxiliado por computador, a teoria funcional da densidade, a relação estrutura-atividade qualitativa e a dinâmica molecular foram aplicados para descobrir NNRTIs potentes.

Protocol

1. Detalhes computacionais - preparação de proteínas

1. Clique no ícone Janela na tela do monitor e clique em Todos os aplicativos. Role para baixo para navegar até a pasta Schrödinger, abra a pasta e clique no ícone Maestro mostrado na Figura 2B e selecione abrir conforme mostrado na Figura 2B para iniciar o software.
2. Recupere a estrutura de proteína de sua escolha navegando no botão da guia Arquivo no software. No menu curto que aparece, selecione Get PDB, como mostra a Figura 3A, e insira o código PDB de sua escolha na caixa de texto, como mostra a Figura 3B. Clique no botão de download e o arquivo PDB selecionado será exibido na janela do projeto.
3. Como alternativa, baixe a proteína de sua escolha para o computador local do Banco de Dados de Proteínas inserindo o código de identidade do banco de dados de proteínas (ID do PDB) na caixa de pesquisa e clique em download para baixar o arquivo PDB no computador local. Navegue até a guia Arquivo e selecione a opção Importar estruturas . Na interface Import , localize o arquivo PDB baixado conforme mostrado na Figura 3C e selecione o botão Import conforme indicado na Figura 3D.
   NOTA: A estrutura da proteína será aberta como uma estrutura 3D em uma janela separada, conforme mostrado na Figura 4.
4. Navegue até o canto superior direito do software, selecione a opção de tarefa e digite preparação de proteína na barra de pesquisa . Clique em Protein Preparation Workflow na tela do lado direito, conforme mostrado na Figura 5A.
5. Na janela Workflow de preparação de proteínas que aparece, escreva o nome do trabalho como o nome do arquivo a ser salvo e clique no botão verde Run no canto inferior direito, conforme mostrado na Figura 5B.
6. Monitore o trabalho enquanto ele é executado clicando no botão Jobs no canto superior direito, conforme mostrado na Figura 5C.
7. Selecione e clique com o botão direito do mouse na proteína preparada e selecione o ligante dividido, conforme mostrado na Figura 5D. Escolha dividir em ligantes, água e outros. Isso é para ter os componentes de proteína como entradas independentes no navegador do espaço de trabalho

2. Preparação do ligante

1. Baixe os compostos químicos desejados do banco de dados PubChem³⁰ digitando o nome do composto de sua escolha na barra de pesquisa . Percorra as estruturas e selecione estruturas tridimensionais (3D). Clique em Download na janela superior direita para baixar as coordenadas da estrutura como um arquivo de dados estruturados (SDF). Se uma estrutura 3D não estiver disponível, faça o download da estrutura 2D e use outras ferramentas para gerar uma estrutura 3D a partir de uma estrutura 2D.
2. Clique na guia File no Schrödinger e selecione Import Structures, como mostra a Figura 6A. Navegue até o local do arquivo onde as estruturas são salvas no formato de arquivo SDF para carregar os compostos a serem preparados.
3. Selecione Tarefa no canto superior direito do software Schrödinger. Digite LigPrep na barra de pesquisa e selecione LigPrep na janela direita à esquerda, como mostra a Figura 6B.
4. Selecione Usar estruturas de para selecionar arquivos da tabela Área de trabalho ou Projeto. Selecione as opções preferidas na janela LigPrep , salve o arquivo no computador local e clique em executar para enviar o trabalho para preparação do ligante, conforme mostrado na Figura 6C.

3. Geometria e Otimização de ligantes

1. Abra o software³¹ para otimização da geometria das estruturas baixadas. Navegue até a guia Arquivo (Figura 7A) e selecione Abrir para escolher o arquivo SDF baixado do banco de dados PubChem.
   NOTA: O arquivo será carregado na janela principal. Clique na outra janela roxa para visualizar os mesmos compostos químicos. Cada configuração implementada mostrará o resultado na janela roxa.
2. Navegue até a guia Calcular e selecione a guia Configuração de cálculo gaussiano. Navegue até a guia Job type mostrada na Figura 7B e escolha Optimization ou Opt+Freq.
   NOTA: Dependendo do número (tamanho) de átomos ou compostos, otimize primeiro, seguido pela frequência. Se o composto for menor, execute Opt+Freq. Quanto maior a molécula, mais tempo leva para realizar Opt + Freq em comparação com Otimização seguido de Frequência.
3. Navegue até a guia Método e selecione os métodos de química quântica e, em seguida, o funcional de densidade de correlação de troca híbrida global de Kohn-Sham de escolha, conjunto de bases, carga e spin de escolha nas setas suspensas em cada seção.
4. Navegue até o Título e especifique um nome para o composto sob investigação.
5. Navegue até a guia Link 0 e especifique o Limite de memória e os processadores compartilhados de sua escolha. Desmarque as caixas Caminho completo conforme mostrado na Figura 7C.
6. Clique no botão Edit na parte inferior para salvar o arquivo de entrada gaussiano, conforme mostrado na Figura 3C. Salve o arquivo no local preferencial com um nome de arquivo de sua escolha como um arquivo de trabalho gaussiano (gjf).
   NOTA: Depois de salvar o arquivo de entrada gaussiano, uma janela pop-up aparecerá mostrando o conteúdo do arquivo no Bloco de Notas. Edite o conteúdo do arquivo, incluindo opções como alterar a carga e a funcionalidade que não estavam disponíveis nas opções de configurações. O arquivo de trabalho gaussiano preparado será usado como o arquivo de entrada para envio para executar os cálculos de otimização e frequência por meio de um computador local.
   Posteriormente, a otimização geométrica dessas estruturas foi conduzida usando o conjunto de bases funcional MN15-L³² e 6-31++G(d,p)³³. No entanto, caso surjam problemas na execução do processo de otimização e frequência, pode-se enviar o trabalho com a ajuda de um HPC.

4. Geração de grade de receptores

1. Navegue até Tarefas e selecione a geração de grade do receptor³⁴. A interface de geração da grade do receptor mostrada na Figura 8A identifica o sítio ativo da proteína onde o ligante do cristal central está ligado. Clique em Pick para identificar o ligante e verificar se um ligante cocristalizado está presente na notificação pop-up superior mostrada na Figura 8B.
2. Selecione os ligantes e/ou resíduos da área de trabalho e os compostos de interesse selecionados mostrarão um destaque azul na área de trabalho.
3. Selecione a guia de configurações no painel de geração da grade do receptor para definir o tamanho da caixa da grade. O tamanho padrão da caixa de grade é 10 Å x 10Å x 10Å. Modifique as dimensões da caixa na guia Caixa de grade inserindo os valores desejados diretamente ou redimensionando manualmente a caixa na área de trabalho.
   NOTA: Como alternativa, defina parâmetros adicionais na guia Avançado , conforme mostrado na Figura 8C , se necessário. Revise todas as configurações para garantir a precisão.
4. Clique em Executar para iniciar a geração da grade. Depois de concluído, salve os arquivos de grade gerados para simulações de encaixe subsequentes. Uma mensagem de notificação será exibida quando o trabalho for concluído, conforme mostrado na Figura 8D.

5. Acoplamento molecular

1. Carregue a proteína e os ligantes preparados navegando até Tarefas, Docking³⁵ e Ligand Docking (glid docking), conforme mostrado na Figura 9A.
2. Carregue o arquivo de grade da etapa 4.1 acima e selecione os ligantes da área de trabalho usando o ligante Use da opção na Figura 9B.
3. Escolha o método de precisão de encaixe preferido na guia de configurações mostrada na Figura 9 C (a precisão de encaixe padrão é Precisão Padrão (SP)).
4. Defina o campo de força para OPLS4 para modelagem precisa de interações moleculares. Defina restrições (por exemplo, ligações de hidrogênio) na guia Restrições .
5. Revise todas as configurações e salve o trabalho ou arquivo de encaixe. Clique em EXECUTAR para iniciar o processo de encaixe.
6. Uma notificação indica que o trabalho foi concluído e a Tabela de Projetos é aberta para resultados de encaixe. Examine as poses, pontuações e interações de ligação.

6. Geração de modelos 2D-QSAR

1. Vá para a página da web do hub da comunidade KNIME e procure por AutoQsar na barra de pesquisa . Selecione a segunda entrada AutoQsar que aparece mostrada na Figura 10A.
2. Clique no ícone download workflow e selecione download workflow no menu pop-up mostrado na Figura 10B. Salve o fluxo de trabalho no computador local.
3. Certifique-se de que o KNIME³⁶ esteja instalado e abra-o no computador local. Compile uma planilha com os sorrisos canônicos, nome da estrutura, valores de atividade/IC₅₀ (em micromolar) e -log(atividade/IC) ou qualquer descritor químico de sua escolha. Salve o arquivo em um formato CSV (valores separados por vírgula) no computador local.
4. Navegue até Arquivo e importe o fluxo de trabalho do AutoQSAR³⁷. Na janela pop-up, clique em Import KNIME Workflow para selecionar o fluxo de trabalho do AutoQSAR baixado, como mostra a Figura 10C e selecione Open | Seguinte | Terminar.
5. O fluxo de trabalho do AutoQsar será exibido na janela do KNIME Explorer no canto superior esquerdo. Clique duas vezes no fluxo de trabalho para trazê-lo para a janela principal.
6. Clique duas vezes no ícone do leitor molecular (para MAE) e, na guia Configurações , clique em Adicionar arquivo(s) para adicionar a planilha com os dados ou parâmetros de entrada de dados.
7. Selecione a guia Política de memória e clique em Gravar tabelas no disco | ESTÁ BEM.
8. Clique com o botão direito do mouse no botão Extrair propriedades e selecione Configurar, como mostra a Figura 10D.
9. Selecione e filtre as propriedades moleculares ou químicas de sua escolha da janela de exclusão para a janela Incluir . Clique em Aplicar.
10. Clique com o botão direito do mouse em AutoQSAR Build Model e clique em Configurar. Insira onome do modelo Q SAR na caixa de diálogo pop-up.
11. Cliqueno botão de ajuste e selecione a propriedade a ser ajustada entre as incluídas. Escolha o valor aleatório do conjunto de treinamento (por exemplo, 85%:15%) e vários modelos a serem mantidos. Clique em Aplicar.
12. Clique com o botão direito do mouse no Molecule Reader inferior e selecione Configurar. Carregue os ligantes de teste de um arquivo CSV Excel preparado contendo os ligantes a serem testados.
13. Clique com o botão direito do mouse em Extrair propriedades e defina as configurações de acordo com sua escolha.
14. Clique com o botão direito do mouse no Molecule Reader superior e selecione executar.
    NOTA: Um ponto laranja indica que o processo foi iniciado e uma luz verde mostrará a execução bem-sucedida do processo. A próxima etapa continuará até que todos os nós tenham sido executados com sucesso.
15. . Execute o segundo Leitor de Moléculas para ligantes de teste.
16. Salve a pasta zip com os resultados do conjunto de teste e treinamento após a execução bem-sucedida de todos os nós.
    NOTA: Selecione o modelo de melhor desempenho com base nos resultados da validação cruzada, como SD – desvio padrão, R2 – correlação do conjunto de treinamento entre os valores de atividade reais e previstos e Q2 – correlação da atividade real e prevista do conjunto de teste.
17. Avalie o desempenho do fluxo de trabalho avaliando o desempenho do modelo usando um marcador ou nós estatísticos.
18. Para interpretar os resultados, identifique os descritores principais ou principais usando a importância do recurso. Visualize os resultados como um gráfico de dispersão ou gráfico de barras para determinar a relação entre desempenho e descritor. Salve o fluxo de trabalho e exporte os dados de resultado, previsões e visualizações como um gráfico de dispersão e/ou arquivos CSV.

7. Enumeração

1. Navegue até Task e procure Ligand Designer, como mostra a Figura 11A.
2. Selecione um par da proteína encaixada e do complexo ligante no navegador do espaço de trabalho. Clique em Analisar área de trabalho na janela Designer de ligante. Para gerar e avaliar novos ligantes, selecione Varredura de isósteros na lista de fluxos de trabalho que aparecem, conforme mostrado na Figura 11B implica o método de crescimento que estende o ligante adicionando fragmentos às partes existentes da molécula.
3. Depois de definir a opção denumeração e, clique em enumerar na janela de notificação de varredura de isostero exibida. Repita a etapa 6.2 para a mesma proteína e um ligante diferente até que todos os ligantes tenham executado o mesmo processo. Examine os ligantes enumerados na Tabela de Projetos.
4. Salve as estruturas exportando os ligantes projetados.
   NOTA: O método de enumeração gerou um conjunto de pontuações de encaixe quando a simulação foi concluída.
5. Selecione individualmente os compostos enumerados com as pontuações de encaixe mais negativas e reencaixe-os usando o procedimento de encaixe descrito na seção 4.

8. HOMO e LUMO

1. Abra o software e carregue o ligante otimizado no formato de arquivo de trabalho gaussiano.
2. Navegue até as ferramentas e selecione o editor MO em pontos vermelhos e verdes, conforme mostrado na Figura 12A.
   NOTA: O método de enumeração gerou um conjunto de pontuações de encaixe quando a simulação foi concluída.
3. No painel do editor MO em método, carregue o arquivo FChk clicando em carregar Mos do arquivo Chk ou FChk existente, conforme mostrado na Figura 12B.
4. Clique na guia visualizar | atualizar. Aguarde ~10 s para que a superfície atual apareça, conforme mostrado na Figura 12D.
5. Clique em uma das duas caixas de seleção ao lado das figuras amarelas destacadas para selecionar a superfície HOMO ou LUMO³⁸ para exibir na janela ao lado.
6. Clique com o botão direito do mouse no fundo roxo e selecione Arquivo. Clique em salvar o arquivo de imagem para salvar a imagem da superfície atual, como mostrado na Figura 12E.
7. Clique com o botão direito do mouse no fundo roxo e selecione Exibir. Escolha o formato de exibição para alterar o plano de fundo na guia Geral , a transparência da superfície na guia Superfície , o tamanho e a cor da fonte na guia Texto, a qualidade da imagem e o layout preferido da superfície na guia Molecule, conforme mostrado na Figura 12F.
8. Como alternativa, gere um arquivo de cubo e carregue o arquivo FChk no GaussView. Navegue até a guia Resultados e escolha Superfícies/Contornos. Clique nas ações do cubo e carregue o cubo. Clique em Ações de superfície e escolha uma nova superfície. Repita a etapa 8.7 para editar a superfície.
   NOTA: Quanto menor a lacuna de energia entre o HOMO e o LUMO³⁹ (a diferença entre LUMO e HOMO), mais reativa deve ser a molécula. Calcule a lacuna de energia (_lacuna E) usando a Eq 1 para cada molécula.
   

9. Simulação de dinâmica molecular - Preparação e minimização do sistema

1. Certifique-se de que o Schrodinger Suite foi instalado no computador local e carregue as estruturas complexas proteína-ligante no espaço de trabalho⁴⁰.
2. Clique no botão Tarefa e escolha Desmond System Builder⁴¹. No painel do integrador de sistemas , selecione a guia Solvatação e escolha o modelo de solvente predefinido conforme mostrado na Figura 13A, a forma da caixa conforme mostrado na Figura 13B e o método de cálculo do tamanho da caixa conforme mostrado na Figura 13C⁴², que se adequam ao complexo proteína-ligante.
3. Selecione a guia íons e clique em recalcular para neutralizar o sistema adicionando contra-íons e definindo a concentração de sal desejada.
4. Escolha o OPLS^43,44 de sua escolha como campo de força.
5. Nomeie o trabalho adequadamente e salve-o no computador local. Clique em executar para enviar o trabalho para preparação.
   NOTA: Certifique-se de que o nome do trabalho esteja salvo. Use um nome detalhado.
6. Equilíbrio e produção
7. Exibir o projeto na área de trabalho Após a preparação do sistema. Selecione o complexo proteína-ligante no Navegador do espaço de trabalho, navegue pela tarefa e escolha dinâmica molecular (Desmond).
8. Carregue o complexo ligante-proteína da área de trabalho no painel de dinâmica molecular. Selecione a linha do tempo de simulação desejada na guia de simulação . Selecione NPT como a classe de ensemble⁴⁵.
9. Nomeie o trabalho adequadamente e escreva o trabalho. Clique em Fechar para sair da janela de dinâmica molecular.
10. Envie o trabalho escrito para preparação de dinâmica molecular por meio de um terminal local. Após a conclusão, abra o trabalho concluído e continue o tempo de simulação a partir da linha de tempo de simulação inicial definida até o tempo de simulação desejado⁴⁵, por exemplo, 100 ns, 200 ns.
    NOTA: Repita a etapa 9 para os outros complexos proteína-ligante.
    1. Abra o trabalho concluído no software Schrödinger Maestro e mescle os diferentes períodos de simulação se trabalhos separados foram executados. Navegue até o botão TAREFA e selecione o diagrama de interação de simulação. Carregue os arquivos mesclados ou o arquivo único para visualizar a trajetória.
11. Gere um relatório que inclua as visualizações e outros resultados de saída detalhados.

10. Mecânica molecular com Born generalizado e área superficial (MM-GBSA)

1. Abra o arquivo de trajetória e reproduza a trajetória. Visualize onde o complexo proteína-ligante está equilibrado e observe o número de quadros. Envie o trabalho por meio do terminal para processamento.
2. Repita a seção 9 (preparar a simulação de dinâmica molecular de proteína) para o outro complexo proteína-ligante.
3. Categorize/visualize o conteúdo do arquivo de saída para analisar os resultados gerados. Leia a média ΔG para obter a energia livre de ligação do complexo proteína-ligante.
4. Baixe o arquivo CSV para visualizar as contribuições de diferentes moléculas intramoleculares.
5. Para calcular a energia de ligação livre do complexo, observe os vários parâmetros termodinâmicos e de dessolvatação, incluindo a energia de ligação (_ligação ΔG), modelo de solvatação columbica (ligação ΔG_Coulumb ), termo de solvatação apolar (ligação_{ΔG Lipo} ), correção de ligação de hidrogênio (_{ligação ΔG} ligação Hbond), ligação covalente (ligação_ΔG Covalente), correção de empacotamento π-π (ΔG_ligar Empacotamento), energia de solvatação eletrostática Nascida Generalizada (_ligação ΔG sol GB) e interação de van der Waals (ligação ΔG_vdW ).
   1. Derive a ligação ΔG final calculando a média dos valores_{de ligação} ΔG determinados para cada instantâneo na simulação MD, conforme mostrado na Eq 2.

Results

Geração de grade de receptores e docking molecular

A ferramenta de geração de grade de receptores do Maestro foi usada para caracterizar adequadamente o local de ligação para o acoplamento subsequente. O ligante cocristalizado foi usado para definir a grade. A configuração de deslizamento de precisão SP para acoplamento molecular foi usada. A ferramenta LigPrep em Schrödinger Maestro foi usada para preparar os ligantes para acoplamento usando o campo de força OPLS4. Para simulações de dinâmica molecular, o campo de força OPLS4 foi usado em Desmond. Os campos de força são fundamentais para as simulações moleculares clássicas, e sua precisão é crítica para a qualidade das simulações de ligação proteína-ligante na descoberta de medicamentos. Para OPLS4, a atribuição de carga e parâmetro foi concluída usando o Schrödinger Maestro. A aplicação dos parâmetros OPLS4 resultou em melhorias significativas nas comparações energéticas e geométricas em comparação com os parâmetros padrão de OPLS2005.

Isso implicou o acoplamento de ligantes específicos conhecidos por terem afinidade com a proteína-alvo do HIV-1, permitindo uma análise completa das interações entre as moléculas do ligante e os resíduos do receptor. A Tabela 1 representa um resumo da classificação de compostos para modelagem QSAR.

Ao acoplar o HBY561, o protocolo de encaixe foi avaliado comparando o ligante reencaixado com o encontrado no sítio ativo da proteína cristalina 1HQU. As estruturas HBY561 acopladas e cristalizadas são fornecidas no Arquivo Suplementar 1 (Figura Suplementar S1 e Figura Suplementar S2). Para avaliar a semelhança entre poses encaixadas e estruturas de referência, um valor de desvio quadrático médio (RMSD) inferior a 2,0 Å é amplamente considerado como um critério para resultados de encaixe confiáveis. Esse limite indica que a estrutura prevista se alinha estreitamente com os dados experimentais. Neste estudo, os ligantes demonstraram um RMSD de 1,27 Å ao comparar a estrutura de referência com a pose encaixada, conforme ilustrado em vermelho na Figura Suplementar S3. Isso mostrou que o protocolo de acoplamento era suficiente para este trabalho e, como resultado, todos os ligantes foram encaixados usando as mesmas configurações. Examinando os escores de docking apresentados na Tabela 2, Efavirenz e Etravirine mostraram os escores mais favoráveis em -10,432 eV e -9,647 eV em relação ao escore de docking do ligante cocristalizado HBY561 (-9,242 eV). A Figura Suplementar4 do Arquivo Suplementar 1 mostra os diagramas de interação do ligante entre a proteína original do HIV-1 e o ligante Crystal, Etavirina e Efavirenz.

Ligações de hidrogênio, empilhamento de π-π e interações hidrofóbicas são as principais forças que contribuem para a ligação. Um exemplo específico de ligação de hidrogênio surgiu entre HBY561 e a proteína designada 1HQU, envolvendo explicitamente o resíduo de aminoácido LYS101. Esse padrão de ligação refletiu as observações feitas com os ligantes Efavirenz e Etravirine, conforme mostrado na Figura 14.

Além disso, as interações hidrofóbicas foram essenciais para a ligação em vários locais de proteínas envolvendo HBY561, Etavirina e Efavirenz, além das forças intermoleculares, ligações de hidrogênio e empilhamento de π-π. π-π empilhamento foi observado entre TYR318 e o anel aromático em Efavirenz. Tanto a ligação de hidrogênio quanto o empilhamento de π-π foram essenciais para manter as conexões de ligação entre os ligantes e a proteína. Os diagramas de interação de ligantes de HBY_561, Nevirapina, Doravirina, Efavirenz e Etravirina são apresentados no Arquivo Suplementar 1-SupplementalFigureS5.

Essas forças intermoleculares influenciam as interações proteína-ligante e são cruciais para o desenvolvimento de medicamentos que reduzem a RAM no HIV-1. Seu papel no aumento da afinidade, especificidade e mecanismo de ação de ligação auxilia no desenvolvimento de medicamentos que podem efetivamente direcionar e inibir o vírus, abordando assim a crescente preocupação com a resistência antimicrobiana no contexto do tratamento do HIV-1.

Preparação do conjunto de dados 2D-QSAR

As fases de treinamento e teste envolveram 94 compostos. Esses compostos foram categorizados em quatro classes, cada uma representando ligantes associados à proteína específica testada. O processo de treinamento utilizou o fluxo de trabalho KNIME AutoQSAR com atividade, HOMO e LUMO foram selecionados como os três descritores para esta investigação.

Geração 2D-QSAR

Todas as 94 moléculas tiveram seus valores de atividade determinados por meio de dados experimentais (Tabela Suplementar S1). Os resultados gerados a partir do modelo QSAR podem ser encontrados na Tabela 3. Os compostos de classe 1 na Tabela Suplementar S2 foram usados para modelagem QSAR, mostrando os grupos Ar adicionados e seus respectivos valores de atividade. Os resultados das quatro classes indicam que foram alcançados os maiores escores de 0,8223, R² de 0,815 e Q ² de 0,8182, correspondendo à Classe 1. Isso se alinha com os critérios anteriores de apontar para R² próximo a 1 e Q² maior que 0,7⁴⁶. Consequentemente, selecionamos a classe 1 para o treinamento de nosso modelo QSAR. Embora os modelos para as classes 3 e 4 tenham demonstrado um excelente valor de correlação R² de 0,8172 e 0,6673, respectivamente, eles não corresponderam ao desempenho da Classe 1.

A correlação cruzada foi conduzida para validar ainda mais a estabilidade do modelo QSAR proposto de acordo com o critério de que a diferença entre o escore Q² 0,8223 e R² deve ser menor ou igual a 0,3⁴⁷. Nosso modelo proposto para a classe 1 tem uma diferença de 0,0038. O gráfico de dispersão que descreve a atividade observada versus a atividade prevista é fornecido na Figura 15.

Lacuna de energia HOMO-LUMO

A determinação da lacuna de energia entre o orbital molecular desocupado mais baixo e o orbital molecular ocupado mais alto, comumente conhecida como lacuna de energia HOMO-LUMO, desempenha um papel crucial na caracterização da reatividade química e estabilidade cinética de uma molécula no contexto dos seis compostos NNRTI. Os orbitais moleculares de fronteira desempenham um papel fundamental na facilitação das interações de transferência de carga com o local de ligação da proteína do HIV. A confirmação da energia mínima foi assegurada examinando as frequências vibracionais e confirmando a ausência de frequências negativas ou imaginárias; posteriormente, os valores de HOMO e LUMO foram obtidos para cada energia mínima. Um valor HOMO mais alto significa a proficiência de uma molécula como doadora de elétrons, enquanto um valor mais baixo sugere que ela atua como um aceptor de elétrons fraco. A Figura Suplementar S6 representa as HOMO_LUMO lacunas de energia para os seis ITRNNs otimizados. Além disso, uma lacuna de energia reduzida entre os níveis de energia HOMO e LUMO influencia fortemente as interações de transferência de carga intermolecular que ocorrem entre as moléculas estudadas devido à forte capacidade de aceitação de elétrons e bioatividade das moléculas⁴⁸.

A tendência dos valores de gap energético, conforme apresentado na Tabela 4, segue uma ordem decrescente: Efavirenz > Etravirina > HBY-561 > Nevirapina > Delavirdina > Doravirina > Rilpivirina. A lacuna energética substancial observada para Efavirenz e Etravirine significa que as análises dos escores de docking revelam uma correlação entre a bioatividade e a lacuna HOMO-LUMO. Notavelmente, o potencial antiviral aumenta com maiores valores de gap HOMO-LUMO. Indica não apenas a estabilidade dos compostos, mas também seu potencial para formar interações estáveis com o receptor. A lacuna HOMO-LUMO desempenha um papel significativo na compreensão da bioatividade das moléculas, particularmente no contexto do design de medicamentos para o HIV-1.

Enumeração

Várias ferramentas foram criadas para a enumeração de bibliotecas virtuais. As ferramentas usadas para enumeração incluem Schrödinger. Ele se baseia no método de salto de núcleo, onde as bibliotecas são criadas substituindo um ou vários anexos em uma estrutura de núcleo por fragmentos de compostos reagentes⁴⁹. A ferramenta de enumeração no Maestro v13.1 foi usada para adicionar grupos laterais personalizados ou átomos a cada um dos seis NNRTIs. Os novos compostos também foram usados para prever atividades. Houve uma melhora nos valores de atividade esperados das moléculas enumeradas em comparação com as moléculas de NNRTI inicialmente otimizadas, como pode ser visto na Tabela 5.

A melhoria mostrada nos valores de atividade dos ligantes enumerados deveu-se ao processo de enumeração realizado à medida que o grupo R personalizado adicionado influenciou as forças de interação do novo composto proposto e da proteína original. Os compostos enumerados foram preparados para a mecânica quântica, otimizando essas moléculas e calculando suas frequências vibracionais. Suas lacunas de energia foram calculadas e comparadas com as lacunas de energia dos NNRTIs. A observação geral, conforme mostrado na Tabela 6, indica que os compostos enumerados são mais estáveis do que seus equivalentes otimizados.

Na Tabela 6, observou-se que o gap de energia dos compostos enumerados em comparação com os compostos otimizados apresentou tendência semelhante. Isso indica que as propriedades químicas das moléculas enumeradas permaneceram inalteradas, independentemente de qualquer rotação conformacional. Assim, eles foram capazes de manter importantes forças intermoleculares com os resíduos de aminoácidos da proteína.

Antes de realizar o processo de enumeração para os NNRTIs, conforme descrito na seção 6 do protocolo, os resultados de saída observados tiveram suas pontuações iniciais de encaixe do processo de enumeração, representadas na Tabela 7 na coluna de pontuação de encaixe enumerada. Conforme explicado na seção 4 do protocolo, o processo de docking molecular foi realizado para validar a pontuação de docking proposta para os compostos enumerados. Pôde-se observar que, após o reencaixe dos compostos enumerados, os novos escores de encaixe melhoraram, conforme mostrado na coluna 'ligantes enumerados reencaixados'. As pontuações reencaixadas para os compostos enumerados foram comparadas com as pontuações de encaixe dos NNRTIs originais representados na coluna 'pontuação de encaixe original' na Tabela 7. Pôde-se observar que, para os compostos enumerados, os escores de docking para HBY_561, Etravirina, Efavirenz e Doravirina foram melhores do que os de seus compostos otimizados equivalentes. No entanto, a Delavirdina possui a mesma pontuação de encaixe que a Delavirdina enumerada e otimizada.

Dinâmica molecular

Três ligações de hidrogênio são formadas por HBY 561 com LYS101, os átomos de N altamente eletronegativos e o OH. O ligante cristalino, ou terceira molécula, estabelece duas ligações de hidrogênio simultaneamente com enxofre e hidrogênio e uma terceira ligação de hidrogênio com GLU138. É importante ressaltar que o empilhamento π-π e as interações hidrofóbicas contribuem significativamente para as forças intermoleculares envolvidas. Além disso, a presença de ligações de hidrogênio adicionais é crucial para a dinâmica molecular, particularmente refletida nos gráficos de desvio quadrático médio (RMSD) resultantes. Ao todo, observa-se que três ligações de hidrogênio são formadas por Efavirenz com o átomo de nitrogênio muito eletronegativo, o átomo de oxigênio no outro anel não aromático e o anel benzênico e TYR318 entre o ligante N altamente eletronegativo no anel central. Uma segunda ligação de hidrogênio entre N do anel e o OH e LY101 é vista. A etravirina mostra três ligações de hidrogênio com LYS101. A doravirina forma uma ligação de hidrogênio com GLU138. A nevirapina mostra duas ligações de hidrogênio com LY101.

Neste caso, a interação do resíduo de aminoácidos compartilhada por todos os ligantes é LYS101. Embora suas estruturas sejam diferentes, todos eles interagem com o mesmo resíduo de aminoácido. Simulações de MD foram realizadas com os parâmetros listados na seção 2.8 do protocolo para verificar quão bem ou mal cada ligante (NNRTI e o NNRTI listado) se liga ao sítio ativo de 1HQU. A interação do ligante representada na Figura 16 indica ligações de hidrogênio robustas entre o aminoácido LY101 da proteína e as moléculas HBY 561, Nevirapina, Efavirenz e Etravirina. Como pode ser visto na comparação na Tabela 7, essas fortes interações são responsáveis pelas altas pontuações de encaixe de cada composto.

Para avaliar a eficácia de ligação de cada ligante, incluindo NNRTI e NNRTI enumerado no sítio ativo de 1HQU, foram realizadas simulações de dinâmica molecular (MDS). Especificamente, os quatro compostos enumerados que demonstraram melhores pontuações de encaixe do que os combos otimizados originais foram selecionados. Esses compostos escolhidos foram submetidos à MDS como método de validação para examinar e observar a reação de cada molécula com a proteína HIV-1 durante um período específico, considerando as interações interatômicas na presença de um ligante.

Antes de iniciar o MDS para os glicanos recentemente enumerados, era essencial confirmar a adequação do protocolo de simulação para o nosso sistema. Para conseguir isso, a etapa inicial envolveu a execução do MDS da proteína livre 1HQU. Nenhum ligante estava presente no sítio ativo da proteína (Figura 17A e Figura Suplementar S7). Até ~ 60 ns, há flutuações consideráveis na estrutura da proteína, produzindo deslocamentos Cα RMSD de até 4,5 Å; depois disso, a proteína parece se estabilizar com uma flutuação RMSD de ~ 3,5 Å até 200 ns. Essa estabilização nos convenceu de que o protocolo MD seria apropriado para nossos complexos proteína-ligante, que serão analisados na seção a seguir.

O MDS de 200 ns de Etravirina e Etravirina enumerada (Figura 17B, C) mostrou flutuações de desvio quadrático médio (RMSD) de Etravirina perto de 5,0 Å e equilíbrio de 4,5 Å. A Etravirina enumerada apresentou flutuações de RMSD de 4,5 Å e equilíbrio de 3,5 Å. Essa estabilização indica que a Etravirina enumerada pode ser um potencial ligante de ITRNN para o tratamento do HIV/AIDS. Uma trajetória com um RMSD inferior a 5 Å significa um efeito de ligação robusto entre a proteína e o ligante do sítio ativo. Esta observação foi realizada para todos os compostos mencionados anteriormente, exceto Nevirapina e Doravirina, entre os compostos enumerados (Arquivo Suplementar 1: Figura Suplementar S8, Figura Suplementar S9, Figura Suplementar S10 e Figura Suplementar S11).

A Figura 18 e a Figura 19 analisam ainda mais a ligação entre a Etravirina, a Etavirina enumerada, e a proteína. Os dados analisados incluem um histograma dos contatos Interação, ligante-proteína e proteína-ligante. O histograma de contatos de interação para cada ligante respectivo ligado à proteína está diretamente relacionado às forças de interação correspondentes entre os resíduos do aminoácido da proteína e o ligante. A alta abundância de LYS101 é muito distinta para Etravirine e enumerada Etravirine, e uma faixa laranja espessa visível foi observada. Uma faixa laranja clara fracamente discernível posicionada na extremidade inferior da carta Etravirine enumerada foi observada em correlação com TYR181. Esta correspondência indica a existência de duas forças intermoleculares de atração entre GLU138. Esta observação positiva para os ligantes e suas formas enumeradas foram comparadas para analisar um ligante melhor como um potencial composto NNRTI. Com base nos resultados fornecidos, a Etravirina enumerada possui potencial para ser utilizada no tratamento do HIV/AIDS.

Mecânica molecular com cálculos generalizados de Born e área superficial (MM-GBSA)

Neste estudo, a principal fonte de entrada energética para a ligação de energia livre, ΔG_ligação, foi a contribuição da interação van der Waals, ΔG_VdW. A Etravirina Enumerada tem um ΔG_VdW mais alto de -66,146 kcal/mol do que sua contraparte NNRTI conhecida com um ΔG_VdW de -64,669 kcal/mol. O maior valor de_{ΔG Hbond} de -2,541 kcal/mol enumerado Etravirina indica a contribuição significativa das forças de atração do hidrogênio entre o ligante e a proteína. As contribuições do ΔG_Coulomb e ΔG_Covalente para a etravirina enumerada (-17,976 e 2,807 kcal/mol) foram muito maiores do que as da contraparte NNRTI conhecida, que teve -11,196 e 2,491, respectivamente.

Os resultados observados durante a ligação da Etravirina e da Etravirina enumerada com a proteína 1HQU são um tanto consistentes. A etravirina enumerada foi considerada melhor do que sua contraparte, a etravirina, devido a duas ligações de hidrogênio adicionais. O estudo também revelou que a Etravirina enumerada foi preferida para ligação ao bolso identificado. A_ligação ΔG mais negativa (-89,684 kcal/mol) para a Etravirina enumerada em comparação com a da Etravirina (-80,551 kcal/mol) mostra que a Etravirina enumerada é um bom inibidor da RT do HIV-1.

Figura 1: Estruturas químicas de seis inibidores da transcriptase reversa não nucleotídica aprovados pela Food and Drug Administration dos Estados Unidos para o vírus da imunodeficiência humana-1. NVP = Nevirapina; DLV = Delavirdina; EFV = Efavirenz; ETV = Etravirina; RPV = Rilpivirina; DOR = Doravirina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Abrindo o aplicativo Maestro Schrödinger no Windows no computador local. (A) Navegando para o Aplicativo Maestro Schrödinger no computador local. (B) Como abrir e executar o aplicativo Maestro Schrödinger no computador local. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Importando uma estrutura de arquivo PDB do computador local para a janela do projeto em Schrödinger. (A) Função de estrutura de importação no Maestro Schrödinger. (B) Caixa de texto ID do PDB. (C) Arquivo PDB baixado no computador local. (D) Botão Importar para permitir que o arquivo de ID do PDB inserido seja importado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Estrutura do arquivo PDB importado para a janela do projeto Schrödinger. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Fluxo de trabalho de preparação de proteínas. (A) Interface de pesquisa do fluxo de trabalho de preparação de proteínas. (B) Salvar o nome do arquivo de trabalho e iniciar o processo de preparação de proteínas. (C) Janela de monitoramento para trabalhos em execução. (D) Quebrar o ligante em seus componentes individuais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Fluxo de trabalho de preparação de ligantes. (A) Importação de estruturas do computador local para a janela do projeto Schrödinger de preparação de proteínas. (B) Processo de preparação de busca de ligantes. (C) Janela de fluxo de trabalho de preparação de ligantes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Geometria e fluxo de trabalho de otimização. (A) Janela de menu GaussView para otimização da geometria. (b) Tipos de trabalho disponíveis na guia Calcular do GaussView. (C) Opções disponíveis na guia Link0 no GaussView. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 8: Geração de glide de deslizamento e fluxo de trabalho de encaixe molecular. (A) Interface de fluxo de trabalho de geração de grade de receptores. (B) Notificação pop-up para selecionar um átomo dentro do ligante. (C) Configurações avançadas do receptor. (D) Notificação de conclusão do trabalho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Acoplamento do ligante deslizante. (A) Interface para pesquisa de acoplamento de ligante de deslizamento. (B) Interface de encaixe do ligante. (C) Configurações de precisão para Glide Docking. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10: Fluxo de trabalho de preparação do KNIME QSAR. (A) Pesquisando o nó AutoQSAR na página do hub da comunidade KNIME. (B) Baixar para obter o nó AutoQSAR KNIME. (C) Importando o fluxo de trabalho AutoQSAR KNIME baixado. (D) Definições de configuração para ligantes ao construir um modelo QSAR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 11: Enumeração de ligantes usando o Ligand Designer no Maestro Schrödinger. (A) Procurando opções do Ligand Designer em Schrödinger. (B) Lista de fluxos de trabalho para conduzir o processo de enumeração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 12: Fluxo de trabalho de geração de HOMO-LUMO. (A) Para acessar as opções do editor molecular na guia Ferramentas no GaussView. (B) Carregando um arquivo Chk ou FChk existente para gerar orbitais moleculares de fronteira. (C) Ilustração dos orbitais de fronteira HOMO e LUMO em GaussView. (D) Visualize a janela para exibir os orbitais de fronteira HOMO e LUMO. (E) Salvando os orbitais fronteiriços do HOMO e LUMO. (F) Interface de formato de exibição no GaussView. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 13: Fluxo de trabalho de preparação, configuração, preparação e execução da dinâmica molecular. (A) Desmond System Builder: Opções de solvatação para determinar modelos de água rígida. (B) Opções de limite do Desmond System Builder para determinar a forma da caixa. (c) Desmond System Builder: Método para calcular o tamanho da caixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 14: Diagramas de interação de ligantes entre 1HQU e 3 ligantes acoplados superiores. Forças de interação entre a proteína (1HQU) e (A) o ligante cristalino (HBY561), (B) Efavirenz e (C) Etravirina. Essas forças influenciam as interações proteína-ligante e são cruciais para o desenvolvimento de medicamentos que reduzem a resistência antimicrobiana no HIV-1. Seu papel no aumento da afinidade, especificidade e mecanismo de ação de ligação auxilia no desenvolvimento de medicamentos que podem efetivamente direcionar e inibir o vírus, abordando assim a crescente preocupação com a resistência antimicrobiana no contexto do tratamento do HIV-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 15: Um gráfico de dispersão mostra a atividade observada versus a atividade prevista para a classe 1 do modelo QSAR. O gráfico representa o ajuste entre a classe 1 como o conjunto de treinamento e os compostos NNRTI como o conjunto de teste para fornecer um valor de atividade preditiva. Abreviaturas: NNRTI = inibidores da transcriptase reversa não nucleotídica; QSAR = relação quantitativa estrutura-atividade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 16: Diagramas de interação do ligante. As forças de interação entre a proteína e (A) enumeraram o ligante de cristal HBY_561, (B) enumeraram Nevirapina, (C) enumeraram Doravirina, (D) enumeraram Efavirenz e (E) enumeraram Etravirina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 17: Diagrama de interação de simulação de dinâmica molecular da proteína livre Etravirina e Etravirina Enumerada. (A) Diagrama de interação dinâmica molecular da proteína livre. (B) Diagrama de interação dinâmica molecular da Etravirina. (C) Diagrama de interação dinâmica molecular da etavirina enumerada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 18: Histograma de contatos de interação entre a etravirina e a proteína. (A) Linha do tempo dos contatos proteína-ligante para a etravirina. (B) A linha do tempo das interações proteína-ligante ao longo do tempo, incluindo ligações H, contatos hidrofóbicos, iônicos e de ponte de água. (C) Um esquema mostrando interações detalhadas entre átomos de ligante e resíduos de proteínas. Somente as interações que ocorrem mais de 30% do tempo de simulação (0,00 a 200 ns) são exibidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 19: Histograma de contatos de interação entre a Etravirina enumerada e a proteína. (A) Linha do tempo dos contatos proteína-ligante para a etavirina enumerada. (B) A linha do tempo das interações proteína-ligante ao longo do tempo, incluindo ligações H, contatos hidrofóbicos, iônicos e de ponte de água. (C) Um esquema mostrando interações detalhadas entre átomos de ligante e resíduos de proteínas. Somente as interações que ocorrem mais de 30% do tempo de simulação (0,00 a 200 ns) são exibidas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Classe	Alvo de proteína	Gama composta	Número total de compostos selecionados
1	NL4-3 HIV-1 do tipo selvagem	(8a1-8e5 – EC50 (nM)a)	25
2	IIIB WT HIV-1	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
3	Cepa resistente a NNRTI RES056	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
4	Cepa ROD HIV-2	13a1-13d6 - EC50 (nM)a	23
Total de compostos selecionados para modelagem QSAR			94

Tabela 1: Resumo dos critérios de classificação de compostos para modelagem QSAR. Um conjunto de dados de 94 compostos de diidrofuro [3,4-d] pirimidina foi sintetizado por Kang e colegas⁵⁰ para direcionar várias cepas de HIV, a saber, NL4-3 HIV-1 de tipo selvagem, IIIB WT HIV-1, RES056 cepa resistente a NNRTI e cepa ROD HIV-2. Esses derivados de pirimidina foram agrupados em quatro classes de acordo com sua proteína-alvo para preparação para realizar nosso treinamento QSAR. A tabela resume como essas moléculas foram agrupadas em quatro classes de acordo com seus valores experimentais de EC₅₀ , que representam a potência de um fármaco, operacionalizada como a concentração na qual o fármaco exerce 50% de seu efeito máximo. Abreviaturas: NNRTI = inibidores da transcriptase reversa não nucleotídica; QSAR = relação quantitativa estrutura-atividade.

Nome da proteína	Ligante	Pontuação de encaixe
1HQU	Efavirenz	-10.432
	Etravirina	-9.647
	HBY_561	-9.242
	Doravirina	-9.04
	Nevirapina	-8.825
	Rilpivirina	-7.722
	Delavirdina	-6.519

Tabela 2: Pontuações de encaixe de seis ITRNNs otimizados e da proteína HIV-1. As pontuações de encaixe são para os seis NNRTIs sob investigação. A pontuação mais negativa indica boa eficácia de ligação entre o ligante e a proteína. Efavirenz e Etravirina mostraram as pontuações mais favoráveis em -10,432 eV e -9,647 eV em relação à pontuação de docking do ligante cocristalizado HBY561 (-9,242). Os ligantes potenciais foram aqueles com uma pontuação de encaixe mais negativa, menor que -9,242 eV.

Classe de Medicamentos	Ajuste de atividade em 85 por cento	Coluna1	Coluna 2	Coluna 3	Coluna 4	Coluna 5
	Pontuação	SD	R2	RMSE	Pergunta2	Q2 MW (hipótese nula)
1	0.8223	0.3268	0.815	0.2479	0.8185	0.1462
2	0.5671	0.2996	0.5067	0.1996	0.2264	0.4736
3	0.8172	0.3692	0.8114	0.1536	0.9065	-1.1532
4	0.6673	0.367	0.6436	0.1709	0.8852	0.1445
*DP – desvio padrão,
R2 – correlação do conjunto de treinamento entre os valores de atividade reais e previstos,
Q2 – correlação de atividade real e prevista do conjunto de testes.
RMSE - Raiz do Erro Quadrático Médio

Tabela 3: Parâmetros estatísticos do modelo 2D-QSAR. A tabela apresenta o desvio padrão, a correlação do conjunto de treinamento entre os valores de atividade real e prevista (R²) e a pontuação alta de correlação de atividade real e prevista do conjunto de teste para cada classe (Q²). A pontuação mais alta (R²) representa a classe.

LIGANTE	HOMO	LUMO	Diferença E
Efavirenz	-0.2242	-0.06943	0.15477
Etravirina	-0.21408	-0.08141	0.13267
Nevirapina	-0.20602	-0.07759	0.12843
HBY_561	-0.19687	-0.0748	0.12207
Delavirdina	-0.19651	-0.07958	0.11693
Doravirina	-0.22413	-0.10916	0.11497
Rilpivirina	-0.21343	-0.11216	0.10127

Tabela 4: Lacuna de energia HOMO-LUMO dos NNRTIs otimizados. A tabela mostra os resultados das lacunas de energia HOMO-LUMO obtidas após a otimização dos seis NNRTIs.

Ligante	Ligantes otimizados	Ligantes enumerados
Doravirina	7.229	7.374
Rilpivirina	7.302	7.279
Etravirina	7.229	7.374
Efavirenz	7.229	7.323
Delavirdina	7.302	7.302
Nevirapina	7.229	6.988
HBY_561	7.229	7.323

Tabela 5: Pontuações de atividade previstas de NNRTIs otimizados versus NNRTIs enumerados correspondentes. A tabela compara as pontuações de atividade preditiva entre ligantes otimizados e enumerados. Quanto mais altos os escores de atividade, melhor o composto como um potencial fármaco principal.

LIGANTE	Lacuna de energia após a otimização	Lacuna de energia após a enumeração	Diferença de lacuna entre compostos otimizados e enumerados
Doravirina	0.115	0.126	0.011
Rilpivirina	0.101	0.127	0.030
Etravirina	0.133	0.126	0.010
Efavirenz	0.155	0.126	0.030
Delavirdina	0.117	0.126	0.010
Nevirapina	0.128	0.126	0.002
HBY_561	0.122	0.126	0.004

Tabela 6: Comparação das lacunas de energia previstas dos NNRTIs enumerados e a lacuna de energia original dos NNRTIs otimizados. A tabela mostra uma comparação da lacuna de energia HOMO-LUMO entre os ligantes otimizados e enumerados e as diferenças de lacuna de energia entre eles.

Ligante enumerado	Regra de 5 propriedades	Coluna1	Coluna 2	Coluna 3	Coluna 4	Coluna 5	Adicionado grupo lateral	Pontuação de encaixe enumerada	Partitura original do encaixe	Ligantes enumerados reencaixados
	AlogP	PSA	HBD	HBA	MW	MPO
Doravirina	2.4	125.9	2	8	441.8	0.49	Hidroxila	-8.894	-9.04	-9.739
Etravirina	4.4	140.9	3	8	451.3	0.37	Hidroxila	-10.258	-9.647	-10.517
Efavirenz	3.7	64.3	2	3	330.7	0.75	Amina	-10.284	-10.432	-11.025
Nevirapina	2.6	58.1	1	4	284.3	0.73	Fluoreto	-9.112	-8.825	-9.445
HBY_561	2.4	93.9	2	6	358.5	0.66	Amida	-9.596	-9.242	-10.1
AlogP - (logaritmo calculado do coeficiente de partição octanol-água).
PSA - (Área de Superfície Polar)
HBD - (Doadores de Ligações de Hidrogênio)
HBA - (Aceitadores de Ligações de Hidrogênio)
MW - (Peso molecular)
MPO - (Otimização Multiparâmetro)

Tabela 7: Comparação da pontuação de encaixe entre os NNRTIs originais e enumerados. A tabela mostra a comparação entre as pontuações de encaixe enumeradas, que são as pontuações de encaixe após a enumeração. As pontuações de encaixe originais são as pontuações de encaixe dos NNRTIs otimizados. As pontuações enumeradas reencaixadas são as pontuações de encaixe dos ligantes que foram enumerados. Como o processo de enumeração fornece uma pontuação de encaixe preditiva, os ligantes tiveram que ser reencaixados com o mesmo método que os ligantes otimizados. Os grupos adicionados são aqueles adicionados aos ligantes durante o processo de enumeração.

Ligante	Ligação ΔG	ΔGCoulomb	ΔGCovalente	ΔGHbond	ΔGLipo	Pacote ΔG	Resolução ΔG	ΔGVdW
Etravirina	-80.551	-11.196	2.491	-1.509	-27.447	-4.826	26.605	-64.669
Etravirina enumerada	-89.684	-17.976	2.807	-2.541	-27.652	-4.211	26.034	-66.146
HBY561	-79.664	-12.261	0.994	-0.521	-26.052	-1.278	18.624	-59.169
HBY561 enumerado	-82.719	-13.443	1.534	-0.603	-27.053	-1.210	20.600	-62.544
Efavirenz	-71.372	-12.984	1.151	-0.834	-25.353	-1.379	14.472	-46.44
Efavirenz enumerado	-79.125	-18.602	1.753	-2.159	-25.409	-1.198	16.619	-50.129

Tabela 8: Resíduos MMGBSA de ligantes selecionados em 1HQU. A tabela representa a Mecânica Molecular com Nascidos Generalizados e cálculos de área superficial, que mostram uma energia livre de ligação média (ΔGbind) do complexo proteína-ligante. A tabela mostra uma comparação entre os ligantes originalmente otimizados que mostram boas pontuações de encaixe em relação aos ligantes de cristal e suas contrapartes enumeradas. O composto escolhido com uma pontuação de acoplamento mais alta e uma boa flutuação RMSD de simulação dinâmica molecular no equilíbrio também deve satisfazer os cálculos de MMGBSA, mostrando aenergia livre de ligação mais negativa de (ligação ΔG). Nesse caso, a Etravirina enumerada satisfaz ambos os parâmetros computacionais.

Arquivo Suplementar 1: Outros rXts obtidos neste estudo. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

O método DFT²⁶ foi utilizado para analisar as propriedades eletrônicas e a estabilidade de vários derivados da pirimidina, o que não ocorre em estudos semelhantes. O uso de DFT permite uma compreensão mais profunda das interações moleculares no nível quântico, aprimorando o processo de design de NNRTIs. Neste estudo, selecionamos seis ITRNNs com valores de atividade desconhecidos. Recuperamos suas estruturas moleculares do banco de dados PubChem e conduzimos a otimização geométrica usando o conjunto de bases funcionais Minnesota 15 Local (MN15-L)³² e 6-31++G (d,p)² no pacote de software de mecânica quântica Gaussian 16 revisão C01³³ . Para configurar os arquivos de entrada de simulação, usamos o GaussView 6.0²⁶. As estruturas quânticas foram então encaixadas no sítio ativo da proteína HIV-1.

O estudo utilizou uma abordagem QSAR⁵¹, que é adaptada para prever a atividade biológica dos NNRTIs com base em sua estrutura química. Este modelo é gerado usando um conjunto de dados de 94 derivados de diidrofuro[3,4-d] pirimidina, permitindo a identificação dos principais grupos funcionais que influenciam a atividade antiviral. A incorporação de um modelo QSAR robusto é um avanço crucial, pois ajuda a filtrar compostos no início do processo de design, aumentando a eficácia da descoberta de medicamentos.

As atividades previstas dos novos compostos foram consideradas e os escores de docking foram validados. A técnica avançada de docking molecular explorou as interações de ligação entre NNRTIs e a enzima transcriptase reversa do HIV-1. Isso foi complementado por simulações de dinâmica molecular por um período prolongado (200 ns), fornecendo informações sobre a estabilidade e o comportamento dos complexos droga-proteína em condições fisiológicas. A dinâmica molecular⁵² validou os achados dos estudos de docking. Ao simular o comportamento dos complexos fármaco-enzima ao longo do tempo, podemos avaliar a estabilidade dinâmica e as interações que podem não ser capturadas em estudos de docking estático⁵³. Essa abordagem fornece uma avaliação mais realista de como os NNRTIs podem funcionar em sistemas biológicos. As simulações mostraram que a Etravirina produziu flutuações de RMSD de aproximadamente 4,5 Å, enquanto a Etravirina enumerada deu flutuações de RMSD de 3,5 Å. Houve várias semelhanças entre a Etravirina e a Etravirina enumerada, com o composto enumerado possuindo interações aprimoradas de aminoácidos dentro do sítio ativo da proteína. O menor RMSD, as interações aprimoradas de aminoácidos e a maior energia livre de ligação sugerem que a Etravirina enumerada pode servir como uma alternativa viável para o tratamento do HIV/AIDS.

O uso de técnicas de enumeração⁵⁴ para gerar estereoisômeros e realizar varredura isostere é um aspecto notável desta pesquisa. Este método permite que os pesquisadores explorem um espaço químico mais amplo para potenciais NNRTIs, modificando sistematicamente as estruturas existentes, o que pode levar à descoberta de compostos com maior eficácia e resistência reduzida.

A pesquisa integra a análise HOMO-LUMO derivada de cálculos da mecânica quântica para avaliar a reatividade e estabilidade dos compostos. Esse aspecto é frequentemente negligenciado em estudos semelhantes⁵⁵, mas fornece informações valiosas sobre propriedades eletrônicas que podem influenciar a atividade biológica

O uso do método MMGBSA neste estudo para estimar as energias livres de ligação dos NNRTIs enumerados como potenciais inibidores da transcriptase reversa (RT) do HIV-1 apresenta um novo aspecto que aumenta a importância e o impacto potencial deste trabalho no desenvolvimento do tratamento do HIV.

A aplicação do MMGBSA neste estudo fornece uma estimativa mais precisa das energias livres de ligação para a Etravirina enumerada em comparação com sua contraparte. Ao calcular os valores de energia livre de ligação, o estudo avalia quantitativamente a afinidade de ligação da etavirina enumerada, que foi consideravelmente maior (9,133 kcal / mol) do que a da etavirina padrão. Esse nível de detalhe nos cálculos de energia de ligação permite uma compreensão mais sutil de como as modificações estruturais podem influenciar a eficácia dos NNRTIs, o que muitas vezes falta em estudos semelhantes que podem depender apenas de avaliações qualitativas.

O valor_covalente ΔG relatado de 1,477 kcal / mol indica ainda a força da interação para o composto enumerado. A abordagem comparativa é inovadora, pois não apenas identifica um candidato promissor, mas também o situa no contexto mais amplo das terapias existentes, fornecendo uma referência para o desenvolvimento futuro de NNRTI.

A comparação mostrada na Tabela 8 também indica que a Etravirina enumerada pode ser um composto potencial para ser usado como uma TARV alternativa, pois sua energia livre de ligação de (ligação_ΔG) é a mais alta em comparação com Etravirina, HBY56, Etavirina e suas contrapartes enumeradas.

Os resultados do nosso estudo podem impactar significativamente o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos para a infecção pelo HIV. Além disso, essa abordagem pode permitir identificar o candidato anti-HIV mais promissor. Essas descobertas podem abrir caminho para o design racional de novos ITRNs do HIV-1.

A incorporação do MMGBSA em conjunto com outros métodos computacionais (como docking molecular, modelagem QSAR e simulações de dinâmica molecular) aumenta a robustez dos resultados. Essa abordagem integrada permite uma avaliação abrangente dos compostos, desde a otimização estrutural até o comportamento dinâmico em um contexto biológico. Essa metodologia é relativamente nova na pesquisa do NNRTI, onde os estudos geralmente se concentram em métodos isolados sem uma visão holística do processo de design do medicamento. A pesquisa destaca vários resultados promissores e uma compreensão aprimorada das interações moleculares entre os NNRTIs e a enzima transcriptase reversa, que podem informar futuros esforços de design de medicamentos.

Enquanto outros estudos no campo do desenvolvimento de NNRTI geralmente se concentram em métodos computacionais únicos ou análises básicas de encaixe, esta pesquisa se destaca por combinar cálculos químicos quânticos com dinâmica molecular e modelagem QSAR, empregando uma abordagem de enumeração sistemática que expande o espaço químico potencial para NNRTIs e utilizando um in-silico abrangente estrutura que não apenas prevê afinidades de ligação, mas também avalia a estabilidade e a dinâmica das interações droga-enzima.

No geral, a novidade desta pesquisa reside em sua abordagem multifacetada, alavancando técnicas computacionais avançadas para enfrentar os desafios da resistência aos medicamentos no tratamento do HIV, abrindo caminho para o desenvolvimento de ITRNs mais eficazes. As descobertas ressaltam o potencial para o desenvolvimento de ITRNNs mais eficazes que podem superar as limitações das terapias atuais.

Algumas aplicações futuras da abordagem descrita neste protocolo incluem o seguinte.

Integração com aprendizado de máquina

Estudos futuros podem integrar o MMGBSA com algoritmos de aprendizado de máquina para melhorar o poder preditivo das estimativas de energia livre obrigatórias. Ao treinar modelos em grandes conjuntos de dados, os pesquisadores podem aumentar a precisão e a confiabilidade das previsões, permitindo uma melhor identificação de candidatos promissores ao NNRTI.

Aplicação no design de medicamentos baseado em fragmentos

O MMGBSA pode ser efetivamente utilizado no projeto de medicamentos baseados em fragmentos, onde pequenos fragmentos moleculares são otimizados para melhorar a afinidade de ligação. Essa abordagem pode levar à identificação de novos ITRNNs com maior potência e seletividade contra o HIV-1.

Exploração dos mecanismos de resistência aos medicamentos

A técnica pode ser aplicada para estudar as interações de ligação de NNRTIs com cepas mutantes de HIV-1. Ao comparar as energias livres de ligação dos NNRTIs com as variantes do tipo selvagem e resistentes, os pesquisadores podem obter informações sobre os mecanismos de resistência aos medicamentos e informar o projeto de inibidores de próxima geração.

Avaliação das propriedades farmacocinéticas

O MMGBSA também pode ser empregado para avaliar as propriedades farmacocinéticas dos ITRNNs, como solubilidade e permeabilidade. Ao entender como essas propriedades se correlacionam com a afinidade de ligação, os pesquisadores podem otimizar os candidatos a medicamentos para melhores perfis terapêuticos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
GaussView	GaussView		V6.1.1
KNIME	KNIME		V4.7.1
Schrödinger Maestro V13.6	SCHRÖDINGER INC.		Ano de lançamento da licença 2023-2