Aqui, apresentamos um protocolo otimizado e eficaz para a injeção intravenosa de células ou agentes farmacológicos em peixes-zebra adultos, resultando em enxerto celular aprimorado e aumento das taxas de sobrevivência do peixe-zebra tratado.
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Artigo de método
Injeção intravenosa otimizada em peixe-zebra adulto
Neste artigo
Resumo
Resumo
A injeção intravenosa (IV) é amplamente reconhecida como o método mais eficaz e comumente utilizado para alcançar a entrega sistêmica de substâncias em modelos de pesquisa em mamíferos. No entanto, sua aplicação em peixes-zebra adultos para administração de medicamentos, transplante de células-tronco e estudos regenerativos e de câncer tem sido limitada devido aos desafios impostos por seu pequeno tamanho corporal e vasos sanguíneos intrincados. Para superar essas limitações, técnicas alternativas de injeção, como injeção intracardíaca e retroorbital (RO), foram exploradas no passado para transplante de células-tronco em peixes-zebra adultos. No entanto, essas técnicas têm suas desvantagens, incluindo a necessidade de técnicas de injeção meticulosas ou aumento do risco de mortalidade.
Neste estudo, desenvolvemos um procedimento de injeção IV refinado e otimizado especificamente adaptado ao peixe-zebra adulto, abordando os desafios associados à sua anatomia única. Para demonstrar a eficácia desta técnica, realizamos injeções intravenosas bem-sucedidas de células inteiras da medula renal de peixes Tg (mpo: EGFP) e corante FITC-dextrano em peixes Casper adultos. A visualização subsequente de células injetadas e corantes usando um microscópio de fluorescência confirmou sua entrega e enxerto bem-sucedidos dentro do peixe-zebra. Além disso, demonstramos que, em comparação com as injeções intracardíacas e de RO, a injeção IV resultou em melhores taxas de sobrevivência e eficiência de enxerto em peixes-zebra tratados. Essa abordagem permite a entrega e localização precisas de substâncias e tem grande potencial para triagem de drogas e produtos químicos em larga escala usando peixe-zebra adulto. Além disso, a capacidade de rastrear visualmente as células e corantes injetados fornece informações valiosas sobre seu enxerto, migração e interações com os tecidos do hospedeiro, permitindo uma avaliação mais abrangente dos efeitos terapêuticos e processos biológicos em modelos de peixe-zebra.
Introdução
O peixe-zebra (Danio rerio) emergiu como um organismo modelo valioso na pesquisa biomédica, principalmente devido à sua semelhança genética com os humanos, com mais de 70% dos genes humanos tendo contrapartes do peixe-zebra 1,2. Essa semelhança genética, combinada com o tamanho compacto do peixe-zebra, o rápido ciclo de desenvolvimento e a capacidade de manipulação genética extensiva, o torna uma ferramenta poderosa para a exploração científica. Esses atributos são particularmente vantajosos para experimentos envolvendo transplante de células, entrega de medicamentos e rastreamento celular. Além disso, a clareza óptica de larvas transparentes e mutantes de pigmentação específicos, como o peixe-zebra Casper, permite a visualização precisa de células ou substâncias transplantadas, oferecendo uma alternativa mais eficiente e econômica aos modelos animais tradicionais.
O peixe-zebra é amplamente utilizado para desenvolver modelos de transplante de câncer e para realizar exames de drogas para doenças graves como glioma, melanoma, tumores pancreáticos e leucemia 3,4,5,6,7,8,9,10. Normalmente, esses modelos são iniciados no estágio larval para aproveitar o sistema imunológico imaturo das larvas e a transparência inerente, o que simplifica o processo de injeção e aumenta a viabilidade de estudos de curto prazo. No entanto, o uso de larvas limita a duração da avaliação do enxerto e das intervenções terapêuticas 7,11. A transição desses protocolos experimentais para o peixe-zebra adulto apresenta desafios como procedimentos de injeção mais complexos, eficiência de enxerto reduzida, taxas de mortalidade mais altas e maior variabilidade nas respostas individuais. Esses desafios destacam a necessidade crítica de melhorar as técnicas de injeção e entrega de substâncias, particularmente para estudos envolvendo peixes-zebra adultos que requerem períodos de observação prolongados.
Historicamente, as injeções intracardíacas12 e retroorbitais (RO)13 têm sido os principais métodos de administração de medicamentos e transplante de células em peixes-zebra adultos. A injeção intracardíaca, que envolve a injeção de substâncias diretamente no coração, garante a circulação sistêmica imediata de medicamentos, mas está associada a riscos significativos, incluindo lesão cardíaca potencial e alta mortalidade. Por outro lado, a injeção de RO, que fornece materiais para o seio venoso atrás do olho, também promove rápida distribuição sistêmica, mas pode ser estressante para os peixes e exige alta precisão na execução14. As injeções intravenosas, bem estabelecidas para a administração sistêmica de substâncias em camundongos e ratos, são cruciais para estudos farmacocinéticos, avaliações de eficácia de drogas e intervenções terapêuticas nesses modelos 15,16,17,18. Recentemente, as injeções intravenosas ganharam destaque na pesquisa do peixe-zebra, particularmente em estudos de respostas imunes inatas19,20 e lesão renal aguda21 em larvas de peixe-zebra. No entanto, sua aplicação em peixes-zebra adultos permanece limitada.
Neste estudo, desenvolvemos e otimizamos um procedimento de injeção intravenosa adaptado especificamente para peixes-zebra adultos, o que melhora significativamente as taxas de sobrevivência, precisão e eficiência de entrega. Demonstramos visualmente esse método e fornecemos um protocolo detalhado usando essa técnica refinada. Administramos com sucesso injeções intravenosas de células de medula renal total (WKM) de peixes Tg (mpo: EGFP) e corante FITC-dextrana em peixes Casper adultos, com confirmação de parto e enxerto avaliados por microscopia fluorescente. Nossos achados mostram que a técnica refinada de injeção IV é mais eficiente e consistente em comparação com os métodos tradicionais intracardíacos e RO. À medida que o uso do peixe-zebra na pesquisa científica continua a se expandir, a adoção dessa técnica aprimorada de injeção intravenosa provavelmente aumentará nossa compreensão da patogênese da doença e acelerará o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas.
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê do Uso de Animais de Laboratório e Pesquisa (CULATR) da Universidade de Hong Kong (HKU).
1. Preparação do material de injeção
- Prepare o meio de suspensão celular: 0,9x PBS + 5% de soro fetal bovino (FBS) + 1% de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep).
- Esterilize a seringa Hamilton e a agulha anexada (34 G, 10 mm de comprimento, capacidade de 10 μL, consulte a Tabela de Materiais) sob luz ultravioleta com comprimento de onda de 270-280 nm e exponha os itens por 2 h.
- Prepare cotonetes esterilizados, almofadas de espuma e lenços de papel.
- Prepare a mistura anestésica diluindo a tricaína com água de peixe esterilizada até uma concentração final de 0,2 mg / mL.
- Para o transplante de células WKM em peixes Casper , 2 dias antes do transplante, administrar uma dose de irradiação subletal de 25 Gy, dividida em duas sessões de 12,5 Gy cada, administradas no mesmo dia com intervalo de 7-8 h entre as doses. Para o processo de irradiação, coloque de 5 a 10 peixes adultos em uma placa de Petri de 100 mm contendo água de peixe e exponha-os em um irradiador gama.
NOTA: A dose foi determinada como subletal com base na análise de sobrevivência após a exposição do peixe Casper a vários níveis de irradiação de até 35 Gy, monitorados por 30 dias (Figura 1A). A duração exata da exposição deve ser calibrada de acordo com as configurações do irradiador. Nenhuma irradiação é necessária para procedimentos que envolvem apenas a administração de medicamentos. - Use um esterilizador a vapor de autoclave de laboratório para esterilizar a água dos peixes destinada a abrigar peixes tratados (consulte a Tabela de Materiais) para prevenir infecções e garantir um ambiente de recuperação seguro para os peixes após a injeção.
NOTA: O processo de esterilização é adaptado à unidade de autoclave específica usada e seguimos as diretrizes do fabricante para soluções líquidas de autoclavagem para preparar a água dos peixes. - Prepare o tampão de lavagem da agulha: vários tubos de etanol a 75% e água ultrapura em tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
- Prepare o tampão de transplante dissolvendo FITC-Dextran (Peso Molecular: 10.000) no meio de suspensão celular previamente preparado (0,9x PBS com 5% de FBS e 1% de Pen/Strep). Ajustar a concentração para 100 μg/ml.
NOTA: Este tampão será usado para as injeções, com um volume planejado de 2 μL por peixe.
2. Preparação da medula renal total para transplante
- Eutanasiar o número necessário de peixes Tg (mpo: EGFP) submergindo-os em uma solução de tricaína 0,4 mg / mL, garantindo que permaneçam na solução por pelo menos 10 minutos após a cessação do movimento opercular.
- Dissecar o peixe Tg(mpo: EGFP) para isolar e transferir a medula renal (KM) para o meio de suspensão celular dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, conforme descrito anteriormente22.
- Desagregar as células KM pipetando e filtrando a suspensão através de um filtro de células de nylon de 40 μm.
- Centrifugar a suspensão a 500 × g durante 8 min.
- Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 500 μl de meio de suspensão celular.
- Contar as células utilizando um contador automático com uma alíquota de 10 μL da suspensão celular.
- Centrifugar novamente a 500 × g durante 8 min.
- Ajuste a concentração celular para 150.000 células/μL usando o tampão de transplante.
3. Procedimento de injeção
- Lave bem a seringa Hamilton 3-4x com etanol a 75% antes da injeção. Enxágue a seringa 3-4x com água ultrapura para remover qualquer resíduo de etanol.
- Administre anestesia ao peixe-zebra imergindo-o na mistura anestésica até que esteja totalmente anestesiado, evidenciado pela diminuição do movimento e perda das respostas reflexas. Uma vez que os peixes estejam sedados, posicione-os com o lado dorsal voltado para cima e a cabeça voltada para a esquerda (Figura 1B). Coloque cuidadosamente os peixes em papel de seda limpo e úmido, o que ajudará a estabilizá-los para a injeção. Certifique-se de que o tecido esteja suficientemente úmido para evitar que o peixe seque, mas não tão úmido a ponto de causar escorregamento.
- Segure a seringa Hamilton com firmeza e incline a agulha a ~45° em relação ao vaso primário (a veia caudal) para direcioná-la de forma eficaz, minimizando os danos aos tecidos circundantes. Para o peixe-zebra Capser , aponte para uma seção do vaso que seja visível através de seu corpo translúcido para um posicionamento preciso da agulha (Figura 1B). Para peixes-zebra do tipo selvagem (Tubingen, TU) com pele pigmentada, procure vasos primários que estejam ao longo do eixo do corpo e posteriores ao ânus na região dos vasos primários (Figura 1B). Insira a agulha com cuidado e suavidade no recipiente designado, administre a injeção (2 μL) lentamente para minimizar o estresse, garantir a absorção ideal da substância e aplique uma leve pressão no local com um cotonete por 10 s para controlar qualquer sangramento após a injeção.
- Observe ao microscópio para confirmar a presença de sinais de GFP, garantindo a eficácia da injeção. Confirme se as células ou corantes aparecem como sinais verdes dentro do vaso (Figura 2A).
- Deixe o peixe se recuperar em água de peixe recém-esterilizada após a injeção por 10 minutos até a transferência para um tanque estático.
- Limpe a agulha conforme descrito anteriormente entre as injeções de diferentes reagentes.
- Para evitar a aglomeração de células, mova a suspensão da célula a cada 10 minutos para ressuspender as células.
- Manter um máximo de 15 peixes transplantados em um tanque de 4 L em condições estáticas de água durante o período de tratamento. Em alternativa, alojar os peixes transplantados individualmente em tanques estáticos de 1 L. Equipe o tanque com uma bomba de oxigênio e faça trocas diárias de água para minimizar o risco de infecção.
- Monitore e avalie a expressão de GFP por citometria de fluxo nos peixes aproximadamente 14 dias após o transplante para avaliar a taxa de enxerto. Registre a mortalidade diária dos peixes para calcular com precisão as taxas de sobrevivência. Realize ANOVA unidirecional para análise de enxerto e o teste Log-rank para a análise de sobrevivência.
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Resultados
Para avaliar a eficácia e precisão de diferentes métodos de injeção em peixes Casper adultos, foi realizada uma análise comparativa usando técnicas intracardíacas, RO e IV (Figura 2A). Quantidades variadas de células WKM de peixes Tg (mpo: EGFP) foram injetadas, cada uma misturada com corante FITC-dextrano nas concentrações de 1 × 105 e 3 × 105 células. O sucesso de cada método foi determinado por meio da avaliação microscópica imediata da presença do ...
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Discussão
Neste estudo, desenvolvemos um protocolo de injeção intravenosa adaptado para peixes-zebra adultos para aumentar a precisão e a consistência da entrega de células ou medicamentos. Um elemento crítico desse método é a capacidade de localizar e visualizar a veia primária, o que é crucial para a administração precisa de substâncias. Embora a cepa translúcida de peixe-zebra Casper seja recomendada para visibilidade ideal da embarcação, nosso protocolo é adaptável para uso com várias...
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Zebrafish Facility do Centro de Pesquisa em Medicina Comparada (CCMR) da Universidade de Hong Kong. Agradecemos à Sra. Jo Yiu Ling Wong pela assistência animal. Os trabalhos foram apoiados pelo Esquema de Pesquisa Baseada em Temas (T12-702/20-N), Projetos do Fundo de Pesquisa Médica e de Saúde nº 08192066 e nº 08193106, Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (NSFC)/Conselho de Bolsas de Pesquisa (RGC) Esquema de Pesquisa Conjunta 2021/22 N_HKU745/21, o Programa Nacional de P&D da China (2023YFA1800100) e o Centro de Oncologia e Imunologia sob a Iniciativa Health@InnoHK financiada pela Comissão de Inovação e Tecnologia, o Governo da RAE de Hong Kong, China (A.Y.H.L.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Autoclaves Esterilizador a Vapor | HIRAYAMA | HRG-140 | |
| Centrífuga 5424 | Eppendorf | ||
| Countess 3 Contador de Células Automatizado | Thermofisher | ||
| Countess II FL | Invitrogen | ||
| Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato sal (Tricaína) | Sigma-aldrich | MKCL9483 | |
| Falcon 40 µ m Cell Strainer | CORNING | Blue, Estéril, Embalado Individualmente, 50/Caixa | |
| FBS, Qualificado | Gibco | 26140079 | |
| FITC-Dextran (MW 10000) | MedChemExpress | 60842-46-8 | |
| Hamilton | HAMI207434 | 34 G, 10 mm de comprimento | |
| Micro seringa | Hamilton | 7635-01 | 10 µ Capacidade L, Modelo 701 RN |
| Nikon SMZ18 | |||
| PBS pH 7.4 (1x) | Gibco | 10010023 | |
| Penicilina-Estreptomicina (5,000 U/mL) | Gibco™ | 15070063 | 100x |
| Ponteiras de Pipeta | Eppendorf | epTIPS | |
| Pipeta de Canal Único | eppendorf | 05-403-151 | |
| Água Destilada UltraPure | Invitrogen | 10977015 |
Referências
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Reimpressões e permissões
