Para estudar a regulação do fluxo sanguíneo cerebral in vivo, os métodos farmacológicos tradicionais são invasivos, muitas vezes danificando o crânio, a dura-máter e as leptomeninges. Neste trabalho, desenvolvemos uma técnica minimamente invasiva que combina injeção de magna intracisternal (ICM) guiada por nanoinjetor com imagens de contraste de manchas a laser, preservando a integridade do crânio e das leptomeninges.
Artigo de método
Nanoinjeção de Cisterna Magna Emparelhada e Ensaio de Imagem de Contraste de Manchas a Laser para Estudar a Regulação do Fluxo Sanguíneo Cerebral In Vivo
Neste artigo
Resumo
Resumo
A regulação do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) é crucial para a manutenção das funções cognitivas, mas seus mecanismos subjacentes permanecem pouco compreendidos. Investigar os processos celulares e moleculares envolvidos nessa regulação requer uma abordagem farmacológica que permita a administração precisa de medicamentos no líquido cefalorraquidiano (LCR), ao mesmo tempo em que permite o monitoramento em tempo real da dinâmica do fluxo sanguíneo cerebral. Neste artigo, apresentamos um método para estudar a regulação do fluxo sanguíneo cerebral in vivo , combinando injeção de magna intracisternal (ICM) baseada em nanoinjetores com imagens de contraste de manchas a laser.
A técnica de injeção de ICM baseada em injetor de nanolitro permite a administração precisa de medicamentos em uma faixa dinâmica de nL/min a μL/min. Em nossos experimentos, essa abordagem reduziu significativamente o volume de injeção dos tradicionais 5-10 μL para apenas 1,5 μL, mantendo assim a pressão intracraniana normal. Quando combinado com imagens de contraste de manchas a laser, fomos capazes de monitorar a dinâmica do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) em tempo real antes, durante e após as injeções de ICM.
Usando esse método, avaliamos as alterações do FSC em resposta à injeção de ICM de três vasodilatadores diferentes: (S)-3,5-Dihidroxifenilglicina (DHPG), acetilcolina e adenosina. Embora todos os três vasodilatadores tenham aumentado o FSC basal, eles tiveram efeitos distintos na dinâmica do FSC. Por exemplo, o impacto da adenosina foi transitório, enquanto o DHPG e a acetilcolina produziram efeitos duradouros. Com suas vantagens exclusivas, este método representa uma adição valiosa à caixa de ferramentas do estudo da regulação do CBF de roedores in vivo.
Introdução
O fluxo sanguíneo cerebral (FSC) garante o fornecimento contínuo de oxigênio e nutrientes ao cérebro, removendo os resíduos metabólicos, essenciais para manter as funções cognitivas normais 1,2. Em condições homeostáticas, o FSC permanece relativamente estável, apesar das flutuações na pressão de perfusão, processo conhecido como autorregulação 3,4,5. Além da autorregulação, o FSC local pode ser ajustado dinamicamente em resposta à atividade neuronal próxima, fenômeno denominado acoplamento neurovascular 6,7. Tanto a autorregulação quanto o acoplamento neurovascular são regulados por um grupo de células - células endoteliais, células murais, astrócitos, fibroblastos e neurônios - conhecidos coletivamente como células unitárias neurovasculares 4,7. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares pelos quais esses diferentes tipos de células se coordenam para modular o CBF ainda são amplamente desconhecidos.
Os métodos para investigar a regulação do CBF são geralmente divididos em modelos in vitro e in vivo. Estudos in vitro, muitas vezes usando fatias cerebrais agudas, são tipicamente combinados com técnicas eletrofisiológicas ou farmacológicas para examinar como os neurônios e as células gliais regulam a dilatação ou constrição de vasos sanguíneos individuais 8,9,10. A principal limitação dos modelos in vitro é que eles não replicam condições in vivo, particularmente a ausência de pressão arterial fisiológica. Os modelos in vivo para estudar a regulação do CBF variam de abordagens em macroescala a microescala. Técnicas de macroescala, como tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética funcional (fMRI), não são invasivas, mas sofrem baixa resolução espacial e temporal 11,12,13,14.
O principal método em microescala para estudar CBF in vivo é a imagem de dois fótons, que fornece alta resolução espaço-temporal 9,15,16,17,18. No entanto, essa técnica requer a remoção do crânio e da dura-máter e, quando combinada com a manipulação farmacológica, torna-se ainda mais invasiva, podendo causar hemorragia, danificar o tecido cerebral e alterar a pressão intracraniana19. Portanto, é crucial ter um método de manipulação e monitoramento do FSC in vivo que atenda a critérios específicos: deve ser não invasivo (preservando a integridade do crânio, leptomeninges e vasos), fornecer alta resolução espaço-temporal e permitir a manipulação farmacológica precisa do FSC. Neste artigo, apresentamos um novo método que combina injeção de magna intracisternal (ICM) baseada em injetor de nanolitro e imagem de contraste de manchas a laser, atendendo a todos esses requisitos.
As abordagens farmacológicas tradicionais para estudar a regulação do CBF geralmente envolvem a remoção do crânio e das meninges para expor o tecido cerebral para a administração local do medicamento. Em contraste, a injeção de ICM evita esse dano administrando drogas diretamente no líquido cefalorraquidiano (LCR), permitindo que eles sigam o fluxo natural do LCR e, assim, imitem melhor as condições fisiológicas. Um desafio com a injeção de ICM é que ela geralmente requer grandes volumes de fluido - geralmente 5 μL ou mais em camundongos20. Dado que o volume total do LCR em camundongos adultos é de aproximadamente 36 μL, a injeção de 5 μL pode aumentar a pressão intracraniana e alterar a dinâmica do FSC. Nosso sistema de nanoinjetores, que usa pipetas de vidro, fornece fluido com controle preciso sobre o volume e a velocidade sem causar vazamento de LCR no local da injeção.
O uretano e a alfa-cloralose são usados em nosso estudo porque fornecem uma linha de base fisiológica mais estável do fluxo sanguíneo cerebral e preservam o acoplamento neurovascular (CNV) melhor do que as alternativas comumente usadas, como isoflurano ou cetamina/xilazina (KX). Usando este sistema, testamos três diferentes vasodilatadores - (S) -3,5-Dihidroxifenilglicina (DHPG), acetilcolina e adenosina, e confirmamos que ele permite a manipulação e monitoramento precisos da dinâmica do CBF in vivo.
Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia. Todos os experimentos aderiram ao Guia do National Institutes of Health para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. Seis camundongos C57BL/6 machos, com idades entre 10 e 14 semanas, foram utilizados para os experimentos. Os procedimentos cirúrgicos estão descritos na Figura 1A.
1. Preparação da cirurgia
- Posicione uma almofada de aquecimento na estrutura estereotáxica e pré-aqueça a 37 °C ~ 20 min antes da cirurgia. Prepare uretano fresco (750 mg / kg) e cloralose (50 mg / kg) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) para anestesia.
NOTA: Para a preparação da solução de alfa-cloralose em PBS, aquecemos a solução em banho-maria a 40 °C e a vórtice a cada 10-15 min até que estivesse totalmente dissolvida. As soluções de uretano e alfa-cloralose foram filtradas usando um filtro de seringa de 0,22 μm antes do uso. - Antes da cirurgia, reúna todas as ferramentas cirúrgicas necessárias, incluindo tesouras, fórceps, porta-microagulhas, hemostáticos, cotonetes, limpadores e suturas. Esterilize os instrumentos em autoclave (121 °C a 15 psi por 60 min).
- Prepare tubos capilares de vidro (diâmetro externo 1,14 mm, diâmetro interno 0,53 mm, 88,9 mm de comprimento). Use um extrator de vidro para criar pipetas de vidro para injeção21. A resistência preferida da pipeta é de aproximadamente 80 - 100 MΩ. Esterilize e armazene as pipetas de vidro em um recipiente limpo.
- Prepare um nanoinjetor com volume de injeção adequado (25 nL - 4,5 μL) e velocidade (6 nL/s - 644 nL/s).
- Prepare as seguintes soluções vasodilatadoras no líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF): (S)-3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG) a 5 mM, acetilcolina a 0,5 mM e adenosina a 10 mM.
- Prepare meloxicam (4,0 mg/kg) para alívio da dor durante a cirurgia. Administre meloxicam por via subcutânea aos ratinhos aproximadamente 30 minutos antes da cirurgia para garantir uma analgesia adequada.
2. Procedimento cirúrgico
- Pesar seis camundongos machos C57BL/6 (10-14 semanas de idade) e anestesiá-los por injeção intraperitoneal de uretano (750 mg/kg) e cloralose (50 mg/kg). Coloque os camundongos em uma câmara de anestesia com isoflurano a 1% para manter a anestesia. Este processo leva aproximadamente 40 min a 1 h.
NOTA: O isoflurano pode acelerar a indução da anestesia. - Remova cuidadosamente os camundongos da câmara de anestesia e avalie a profundidade da anestesia, confirmando a ausência do reflexo de pinça do dedo do pé. Usando um cotonete, aplique o creme depilatório na parte superior do crânio e na nuca para remover o pelo.
- Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento e reaplique conforme necessário durante todo o procedimento. Monitore regularmente durante o experimento e administre pomada adicional quando necessário.
- Posicione o mouse em decúbito ventral dentro da estrutura estereotáxica, garantindo ventilação adequada com ar medicinal a uma vazão de 1 a 2 L/min. Prenda o mouse com barras auriculares para fixação adequada e, em seguida, incline suavemente a cabeça para baixo para formar um ângulo de 120° com o corpo, expondo assim a cisterna magna.
NOTA: O isoflurano é usado exclusivamente para indução anestésica e não durante a fase de manutenção. - Desinfete a área cirúrgica usando pelo menos três aplicações alternadas de álcool 70% e um esfoliante cirúrgico (por exemplo, clorexidina ou iodopovidona) para garantir a esterilização adequada da pele.
- Localize a crista occipital sob um microscópio cirúrgico. Levante a pele sobrejacente com uma pinça e faça uma incisão na linha média de 1 cm. Controle qualquer sangramento com cotonetes.
- Exponha os músculos do pescoço e faça uma incisão cuidadosa e separe-os ao longo da linha média usando uma pinça. Empregue duas pinças curvas, uma em cada mão, para retrair suavemente os músculos e expor a dura-máter, que forma o limite externo da cisterna magna.
- Ajuste a posição da cabeça inclinando-a para baixo para formar um ângulo de 150° com o corpo para uma exposição ideal da cisterna magna.
- Faça uma incisão de 5 mm ao longo da sutura sagital, cobrindo os pontos lambda e bregma. Usando duas pinças curvas, puxe suavemente a pele para o lado e limpe a superfície do crânio com solução salina. Certifique-se de que nenhum cabelo permaneça no crânio exposto.
- Após a limpeza, aplique uma camada de gel de ultrassom com ~ 1 mm de espessura no crânio exposto usando cotonetes para manter a umidade na área. Como o gel de ultrassom pode conter bolhas de ar, certifique-se de que todas as bolhas de ar sejam removidas antes da imagem.
- Posicione o mouse sob a lente do sistema de imagem de contraste de manchas a laser. Ligue o sistema e o software que o acompanha. Certifique-se de que o cérebro do mouse esteja centralizado no campo de imagem e, em seguida, use a função de foco automático para obter o foco correto para a imagem. Se necessário, remova suavemente quaisquer pelos restantes ou bolhas de ar do campo de imagem com uma pinça.
3. Configuração de nanoinjeção
- Prenda a bomba ao braço manipulador estereotáxico e conecte o cabo ao controlador. Ligue o controlador e selecione a bomba alvo. No painel de controle, defina DIRECTION como INFUSE. Defina a velocidade para 2 μl por minuto e o volume para 4,5 μl.
NOTA: O sistema de nanoinjeção consiste em dois componentes principais: a bomba injetora e o controlador. Cada controlador pode operar duas bombas simultaneamente. Para injeção de ICM, usamos apenas uma bomba. - Após a conclusão do INFUSE , retire uma pipeta de vidro do recipiente e encha-a com óleo mineral incolor e inodoro usando uma agulha flexível MicroFil de 34 G ou um tipo semelhante de agulha. Certifique-se de que toda a pipeta de vidro esteja cheia de óleo.
- Desaparafuse a pinça da bomba, insira a pipeta de vidro e aperte a pinça. Certifique-se de que não haja bolhas de ar presentes dentro da pipeta de vidro.
- Altere a DIREÇÃO no painel de controle para RETIRADA. Defina a velocidade para 2 μ L/min e o volume para 4.5 μ L.
- Mova o braço estereotáxico para introduzir suavemente a pipeta na solução preparada e retire o volume desejado.
4. Injeção de vasodilatadores na cisterna magna e monitorização do FSC
- Certifique-se de que a bomba esteja firmemente fixada ao braço manipulador estereotáxico. Ajustar o ângulo do braço manipulador estereotáxico a 45° no plano ântero-posterior.
- Usando uma pinça curva sob o microscópio de dissecação, exponha cuidadosamente a cisterna magna. Limpe a área com solução salina para remover o sangue. Utilize o micromanipulador estereotáxico para posicionar a pipeta de vidro perto da dura-máter da cisterna magna.
- Assim que a pipeta de vidro tocar a dura-máter, manobre-a suavemente para passar para o centro da cisterna magna, evitando qualquer penetração no cerebelo ou medula. Certifique-se de que a ponta da pipeta de vidro esteja inserida a uma profundidade de 1-2 mm antes de soltar a pinça.
NOTA: Uma moldura estereotáxica digital é essencial para monitorar a profundidade da penetração da pipeta de vidro na cisterna magna. - Altere a DIREÇÃO no painel de controle para INFUSE. Defina a velocidade de injeção para 300 nL/min e o volume para 1,5 μL.
- Inicie o software para imagens de contraste de manchas a laser (LSCI) e ajuste o foco para obter a imagem mais nítida dos vasos sanguíneos. Certifique-se de que não haja cabelo ou bolhas de ar no campo de view.
- Defina o intervalo de imagem para 5 s no painel de controle LSCI. Registre o CBF basal por aproximadamente 10 min, garantindo que a linha de base permaneça estável. Se houver flutuações na linha de base, continue gravando por mais tempo até que a estabilidade seja alcançada.
- Após 10 minutos de gravação de linha de base estável, inicie a nanoinjeção e anote a hora de início da injeção no sistema de gravação LSCI. Quando a injeção estiver concluída, marque a hora de término e continue gravando por mais 20 minutos ou mais. Após a conclusão do experimento, perfusão transcardíaca dos camundongos com PBS e coleta tecidos cerebrais para análise histológica.
Resultados
Após a conclusão da cirurgia, prendemos o mouse em uma estrutura estereotáxica com leitura digital (Figura 1A,B). Para a medição do fluxo sanguíneo cerebral (FSC), separamos cuidadosamente a pele sobre o crânio após a incisão e aplicamos um gel de ultrassom transparente para manter a umidade na superfície do crânio (Figura 1C). Para facilitar a injeção intracisternal magna (ICM), dissecamos os músculos do pescoço ao redor da crista occipital para expor a cisterna magna. Em seguida, retiramos a solução alvo com pipeta de vidro e usamos o micromanipulador para guiar a pipeta de vidro para penetrar nas membranas da cisterna magna a uma profundidade de 1-2 mm (Figura 1D, E). O braço estereotáxico foi inclinado emum ângulo de 45o para auxiliar na inserção.
Em seguida, examinamos as alterações dinâmicas do FSC em resposta a três vasodilatadores diferentes: (S)-3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG), acetilcolina e adenosina 22,23,24,25. Inicialmente, registramos uma linha de base de 10 minutos antes de injetar 1,5 μL de cada vasodilatador na velocidade de 300 nL/min durante 5 min. Após a injeção, registramos mais 20 minutos de dados. Nossos resultados mostraram que os três vasodilatadores aumentaram o FSC, porém com dinâmicas distintas. O DHPG induziu um aumento acentuado no FSC, seguido por um declínio gradual após a injeção (Figura 2A,B). Em contraste, a acetilcolina provocou um aumento gradual no FSC ao longo do período de registro (Figura 2C, D). A adenosina também produziu um aumento transitório no FSC, que retornou ao nível basal aproximadamente 15-20 minutos após a injeção ( Figura 2E , F ).
Figura 1: Resumo dos procedimentos cirúrgicos. (A) Principais procedimentos cirúrgicos passo a passo para nanoinjeção + modelo LSCI. (B) Esquemas mostrando o sistema combinado de nanoinjeção + LSCI. O nanoinjetor é fixado de forma estável no braço estereotáxico e o braço é inclinado em 45ºpara facilitar a penetração da membrana atlanto-occipital na cisterna magna. (C) Vista de cima para baixo do crânio do camundongo sob o sistema LSCI. O crânio é coberto com gel de ultrassom. (D) Vista traseira mostrando a pipeta de vidro penetrando na magna cisternal. A pipeta de vidro foi preenchida com azul de Evans para facilitar a visualização. Use o quadro estereotáxico digital para este experimento para que a distância de penetração possa ser quantificada com precisão. (E) Esquemas mostrando a localização da ponta da pipeta de vidro na cisterna magna. A cabeça do camundongo foi inclinada em 30opara facilitar a injeção da magna cisternal. Abreviatura: LCSI = imagem de contraste de manchas a laser. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Aumento do fluxo sanguíneo cerebral após nanoinjeção de vasodilatadores. (A) Imagens representativas mostrando alterações no fluxo sanguíneo cerebral antes e depois da injeção de DHPG. A velocidade do sangue é codificada por cores. Azul representa baixa velocidade e vermelho representa alta velocidade. (B) Fluxo sanguíneo em tempo real na região marcada com uma linha vermelha, que indica a janela de tempo para a injeção de DHPG. (C) Imagens representativas mostrando alterações no fluxo sanguíneo cerebral antes e depois da injeção de ACh. A velocidade do sangue é codificada por cores. Azul e vermelho indicam velocidades baixas e altas, respectivamente. (D) Fluxo sanguíneo em tempo real na região marcada pela linha vermelha, que indica a janela de tempo para a injeção de ACh. (E) Imagens representativas mostrando alterações no fluxo sanguíneo cerebral antes e depois da injeção de adenosina. A velocidade do sangue é codificada por cores. Azul e vermelho indicam velocidades baixas e altas, respectivamente. (F) Fluxo sanguíneo em tempo real na região marcada pela linha vermelha, que indica a janela de tempo para injeção de adenosina. Abreviaturas: DHPG = (S)-3,5-Dihidroxifenilglicina; ACh = acetilcolina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussão
Apresentamos um novo método para investigar a regulação do fluxo sanguíneo cerebral (CBF) in vivo , combinando nanoinjeção magna cisternal precisa com imagem de contraste de manchas a laser (LSCI). Essa abordagem permite a administração precisa do medicamento no líquido cefalorraquidiano (LCR), ao mesmo tempo em que permite o monitoramento em tempo real do FSC, facilitando a avaliação da reatividade vascular cerebral.
A manipulação farmacológica e as técnicas de liberação de fármacos são fundamentais para o estudo do FSC e da reatividade vascular cerebral in vivo. Os métodos tradicionais de aplicação de drogas, como o uso de vasodilatadores ou constritores, muitas vezes requerem a remoção do crânio, o que pode danificar as leptomeninges e até mesmo o parênquima cerebral 9,10,18. Essas técnicas invasivas podem perturbar o microambiente cerebral, principalmente causando danos vasculares e hemorragias, falhando assim em replicar as condições fisiológicas reais. Em contraste, nosso método oferece quatro vantagens significativas.
Primeiro, nossa abordagem para aplicação de medicamentos é não invasiva e preserva as condições fisiológicas. Em segundo lugar, os métodos clássicos de injeção de ICM geralmente dependem de seringas ou cânulas, o que pode levar ao vazamento de drogas ou vestígios e LCR devido ao grande tamanho das pontas. Esses métodos tradicionais geralmente requerem grandes quantidades de medicamento ou traço - geralmente 5 μL ou mais, o que pode alterar a pressão intracraniana. Em contraste, nossa injeção de ICM guiada por nanoinjetor requer apenas um pequeno volume de apenas 1,5 μL ou menos. Além disso, a velocidade de injeção pode ser controlada com precisão em uma ampla faixa, de 1 nL/s a 100 nL/s. Normalmente usamos uma velocidade de 5 nL/s (300 nL/min), pois essa taxa não afeta a pressão intracraniana. Em terceiro lugar, ao contrário das injeções de drogas guiadas por pipeta no parênquima cerebral ou na perfusão de drogas na superfície cortical, nossa administração de drogas baseada em injeção cisternal magna segue o fluxo natural do LCR, imitando de perto as condições fisiológicas. Finalmente, como nosso método preserva a integridade do crânio e das meninges, podemos realizar medições no mesmo grupo de camundongos em diferentes momentos, permitindo comparações longitudinais - algo que não é viável com outros métodos de aplicação de drogas. Para estudos de sobrevivência e comparações longitudinais, técnicas assépticas rigorosas devem ser seguidas, incluindo preparação adequada da pele, uso de instrumentos e materiais estéreis e conformidade com as diretrizes institucionais de cuidados com os animais. Um período de recuperação de duas semanas deve ser permitido para a cicatrização de feridas.
O método de anestesia pode impactar significativamente o FSC. Por exemplo, a anestesia com cetamina-xilazina pode elevar o FSC em mais de 50% acima dos níveis basais, enquanto o isoflurano pode dobrar o nível basal de FSC. Em nossos experimentos, optamos pelo uretano e pela cloralose devido aos seus efeitos mínimos no sistema cardiovascular, o que ajuda a manter os níveis fisiológicos de FSC, como comumente utilizado no campo26,27. Além disso, pulamos a canulação intra-arterial para que a medição repetida da gasometria não seja invasiva, embora tais procedimentos possam ser combinados com nosso método26.
Nossa abordagem integra dois sistemas: o sistema de injeção ICM baseado em nanoinjeção28 e o sistema de imagem de contraste de manchas a laser (LSCI)29. Os experimentadores devem ser treinados em ambos os sistemas para realizar o procedimento com sucesso. Como o sistema LSCI ocupa todo o espaço acima da cabeça do mouse, inclinar o braço em 45 o não apenas facilitaa injeção de ICM, mas também garante a compatibilidade entre os dois sistemas. Essa configuração é fundamental para o sucesso do experimento.
Para iniciantes que usam a injeção de ICM guiada por nanoinjetor, é necessária uma prática extensiva para dominar a coordenação de separar os músculos com uma pinça em uma mão enquanto manobra o micromanipulador para guiar a pipeta de vidro com a outra. Uma boa luz laser e um microscópio estéreo de braço articulado são essenciais para uma visualização ideal durante o procedimento.
Usando esse método, avaliamos como os vasodilatadores clássicos, como DHPG, acetilcolina e adenosina, afetam o FSC. Como previsto, todos os três vasodilatadores aumentaram o FSC; no entanto, eles induziram dinâmicas diferentes. O DHPG causou um aumento acentuado no CBF, seguido por um decaimento lento, enquanto a acetilcolina provocou um aumento gradual. Em contraste, a adenosina produziu apenas um aumento transitório no FSC.
Este método deve também ser aplicável a modelos de ratos. No entanto, dado que a espessura do crânio do rato é de aproximadamente 0,5-1 mm, ele precisará ser diluído para imagens de contraste de manchas a laser. Além disso, embora o método atual possa ser adaptado para camundongos acordados com a cabeça fixa, ele requer treinamento extensivo para minimizar o movimento dos animais durante os experimentos. Usamos um número limitado de camundongos para demonstrar nosso método; portanto, nosso estudo é estatisticamente restrito e deve-se ter cautela ao tirar conclusões amplas de nossos achados.
Para medições consistentes e confiáveis do FSC, é importante que os experimentadores reconheçam que outros parâmetros fisiológicos, como temperatura corporal, pressão arterial e níveis de CO2 , desempenham um papel crítico na avaliação fisiológica abrangente e devem ser cuidadosamente considerados em estudos futuros. Em resumo, apresentamos um novo método in vivo para estudar a regulação do CBF em camundongos. Essa abordagem é precisa e minimamente invasiva, tornando-a adequada para investigar a dinâmica do FSC induzida por drogas.
Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do NIH (NS108763, NS127392, NS125788, NS125677).
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| (RS)-3,5-Dihidroxifenilglicina | Tocris | Cat. No. 0342 | |
| Cloreto de acetilcolina | Sigma | A6625-25G | |
| Adenosina | Sigma | A9251-25G | |
| Cotonete de álcool 70% Álcool isopropílico | Vitrex Medical A / S | 520213 | |
| AmScope SM-8T Series Braço articulado Zoom Microscópio estéreo | AmScope | SM-8TZ-144S-10M | |
| Aquasonic Clear Ultrasound Transmission Gel | AquasonicGel | PLI 03-50 | |
| Mouse Digital Instrumentos Estereotáxicos | Stoelting | 51730D | |
| Álcool etílico | Sigma | 459836-2L | |
| Fiber-Lite DC950 Iluminador | Dolan-Jenner industries | DC950H | |
| Substituição de vidro 1,14 MM | World Precision Instruments | 504949 | |
| Kimtech Science Toalhetes de Precisão Limpadores de Tecido | Kimberly Clark Professional | 5511 | |
| Laser Speckle Contrast Imager | instrumentos de mouro | MOORFLPI-2 | |
| Lasik Eye Spear (100 Por Caso) | hospeq | BV40815 | |
| AGULHA FLEXÍVEL MICROFIL Óleo | Sigma | ||
| M5904 | |||
| Mouse almofada de aquecimento | Fisher scientific | 50-195-4000 | |
| Nair Cocoa Butter Hair Remover Lotion | Amazon ASIN : | ||
| NANOLITRO 2020 INJETOR | World Precision Instruments | NANOLITER2020 | |
| P-2000 Sutter | Instrument | P-2000 | |
| Puritan® Cotonetes, Cabeça de Algodão, Haste de Madeira, | Puritan Medical | 806-WC | |
| Lubrificante Ocular Estéril | Medi-Vet | 11897 | |
| Uretano | Sigma | U2500 | |
| Cola de tecido Vetbond | World Precision Instruments | VETBOND | |
| α-Chloralose | Sigma | 23120 |
Referências
- Lassen, N. A., Ingvar, D. H., Skinhøj, E. Brain function and blood flow. Sci Am. 239 (4), 62-71 (1978).
- Leenders, K., et al. Cerebral blood flow, blood volume and oxygen utilization: normal values and effect of age. Brain. 113 (Pt 1), 27-47 (1990).
- Armstead, W. M. Cerebral blood flow autoregulation and dysautoregulation. Anesthesiolo Clin. 34 (3), 465-477 (2016).
- Claassen, J. A., Thijssen, D. H., Panerai, R. B., Faraci, F. M. Regulation of cerebral blood flow in humans: physiology and clinical implications of autoregulation. Physiol Rev. 101 (4), 1487-1559 (2021).
- Strandgaard, S., Paulson, O. Cerebral autoregulation. Stroke. 15 (3), 413-416 (1984).
- Iadecola, C. The neurovascular unit coming of age: a journey through neurovascular coupling in health and disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Girouard, H., Iadecola, C. Neurovascular coupling in the normal brain and in hypertension, stroke, and Alzheimer disease. J. Appl. Physiol. 100 (1), 328-335 (2006).
- Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes. Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).
- Zonta, M., et al. Neuron-to-astrocyte signaling is central to the dynamic control of brain microcirculation. Nat Neurosci. 6 (1), 43-50 (2003).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Grafton, S. T., et al. Functional anatomy of human procedural learning determined with regional cerebral blood flow and PET. J Neurosci. 12 (7), 2542-2548 (1992).
- Tillfors, M., et al. Cerebral blood flow in subjects with social phobia during stressful speaking tasks: a PET study. Am J Psychiatry. 158 (8), 1220-1226 (2001).
- Goense, J., Merkle, H., Logothetis, N. K. High-resolution fMRI reveals laminar differences in neurovascular coupling between positive and negative BOLD responses. Neuron. 76 (3), 629-639 (2012).
- Wang, J., et al. Perfusion functional MRI reveals cerebral blood flow pattern under psychological stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (49), 17804-17809 (2005).
- Takano, T., et al. Astrocyte-mediated control of cerebral blood flow. Nat Neurosci. 9 (2), 260-267 (2006).
- Holstein-Rønsbo, S., et al. Glymphatic influx and clearance are accelerated by neurovascular coupling. Nat Neurosci. 26 (6), 1042-1053 (2023).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Otsu, Y., et al. Calcium dynamics in astrocyte processes during neurovascular coupling. Nat Neurosci. 18 (2), 210-218 (2015).
- Cai, C., et al. Stimulation-induced increases in cerebral blood flow and local capillary vasoconstriction depend on conducted vascular responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (25), E5796-E5804 (2018).
- Xavier, A. L., et al. Cannula implantation into the cisterna magna of rodents. J Vis Exp. (135), e57378(2018).
- Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller. J Vis Exp. (20), e939(2008).
- Liu, X., et al. Epoxyeicosatrienoic acid-dependent cerebral vasodilation evoked by metabotropic glutamate receptor activation in vivo. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (2), H373-H381 (2011).
- Yamada, M., et al. Cholinergic dilation of cerebral blood vessels is abolished in M5 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (24), 14096-14101 (2001).
- O'Regan, M. Adenosine and the regulation of cerebral blood flow. Neurol Res. 27 (2), 175-181 (2005).
- Morii, S., Ngai, A., Ko, K. R., Winn, H. R. Role of adenosine in regulation of cerebral blood flow: effects of theophylline during normoxia and hypoxia. Am J Physiol. 253 (1 Pt 2), H165-H175 (1987).
- Park, L., et al. Aβ-induced vascular oxidative stress and attenuation of functional hyperemia in mouse somatosensory cortex. J Cereb Blood Flow Metab. 24 (3), 334-342 (2004).
- Park, L., et al. NADPH oxidase-derived reactive oxygen species mediate the cerebrovascular dysfunction induced by the amyloid β peptide. J. Neurosci. 25 (7), 1769-1777 (2005).
- Herz, J., et al. GABAergic neuronal IL-4R mediates T cell effect on memory. Neuron. 109 (22), 3609-3618.e9 (2021).
- Sun, Y. -Y., et al. Prophylactic edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
Reimpressões e permissões
