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Artigo de método

Uma abordagem não viral para gerar células T receptoras de antígeno quimérico transitório usando mRNA para imunoterapia contra o câncer

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DOI:

10.3791/67548

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21 de fevereiro de 2025

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1ProMab Biotechnologies

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um procedimento detalhado para gerar células T do receptor de antígeno quimérico transitório (CAR) usando mRNA não integrante para imunoterapia contra o câncer e fornece métodos confiáveis para avaliar as células CAR-T e sua função citotóxica.

Resumo

A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) emergiu como um tratamento pioneiro contra o câncer, alcançando um sucesso sem precedentes no tratamento de certas malignidades hematológicas, como linfomas e leucemias. No entanto, à medida que mais pacientes com câncer recebem terapias com células CAR-T, malignidades primárias secundárias associadas ao tratamento estão sendo cada vez mais relatadas, em parte devido à inserção inesperada do transgene CAR, levantando sérias preocupações de segurança. Para resolver esse problema, descrevemos aqui uma abordagem não viral e não integradora para gerar células CAR-T transitórias usando mRNA. Eletroporamos células T com mRNA modificado que codifica um CAR específico do receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2) e geramos células CAR-T direcionadas a HER2 transitórias. O CAR foi eficientemente expresso na superfície das células T 1 dia após a eletroporação, aumentou no dia 2 e diminuiu drasticamente no dia 5. As células CAR-T transitórias exibiram citotoxicidade potente contra células de câncer de ovário SKOV-3 HER2-positivas e secretaram altos níveis de IFN-Υ. Este protocolo fornece um guia passo a passo para o desenvolvimento de células CAR-T transitórias em pequena escala sem integração permanente do transgene CAR, descrevendo procedimentos detalhados para preparação de mRNA CAR, ativação e transfecção de células T, avaliação da expressão de CAR e análise in vitro da função das células CAR-T. Este método é adequado para a geração transitória de células CAR-T em estudos pré-clínicos e clínicos.

Introdução

O câncer é uma ameaça cada vez mais importante à saúde humana, com uma estimativa anual de 23,6 milhões de novos casos diagnosticados e 10 milhões de mortes em todo o mundo1. O tratamento cirúrgico combinado com radiação e quimioterapia continua sendo o padrão-ouro de tratamento para vários tipos de cânceres localizados não invasivos e invasivos 2,3,4. Embora o tratamento sistemático tradicional tenha alcançado um tremendo sucesso no tratamento de cânceres em estágio inicial, ele é muito tóxico e tem efeito limitado sobre cânceres metastáticos e hematológicos5. Pacientes com esses cânceres passam por tratamentos frequentes e sofrem toxicidade significativa na esperança de estabilizar e retardar a progressão da doença. A terapia com células T do receptor de antígeno quimérico (CAR) surgiu recentemente como uma terapia direcionada revolucionária que demonstra eficácia potente para cânceres hematológicos de células B e oferece esperança a esses pacientes desesperados6.

As células CAR-T são linfócitos T modificados que expressam um CAR na superfície celular que reconhece especificamente antígenos associados a tumores (TAAs) e ativa as células sem exigir apresentação antigênica das principais proteínas do complexo de histocompatibilidade (MHCs)7. Após a ativação, as células CAR-T secretam um painel de citocinas e lisam as células tumorais independentemente dos MHCs, aumentando assim a destruição dos tumores, mesmo quando os MHCs são regulados negativamente ou perdidos devido ao microambiente tumoral imunossupressor 8,9. Os CARs consistem em pelo menos três domínios distintos - uma variante de fragmento de cadeia única extracelular (scFv) contendo as regiões variáveis de reconhecimento de antígenos de um anticorpo específico para TAA, um domínio transmembrana que ancora o CAR à superfície celular e um domínio intracelular que medeia o recrutamento de proteínas adaptadoras e sinalização a jusante10. Com base nas variações nos domínios intracelulares, as estruturas CAR evoluíram ao longo de cinco gerações até agora, com a primeira geração contendo apenas o domínio de ativação CD3ζ e as gerações subsequentes possuindo um ou mais domínios coestimulatórios extras de moléculas como 4-1BB e CD2811. Esses domínios intracelulares afetam os mecanismos de sinalização de células CAR-T, proliferação, sobrevivência e toxicidade, que juntos determinam a eficácia antitumoral clínica. O sucesso clínico da terapia com células CAR-T vem de células CAR-T de segunda geração que visam especificamente CD19, um biomarcador altamente expresso em células da linhagem B, para o tratamento de leucemias e linfomas de células B12,13. Até o momento, a Food and Drug Administration (FDA) aprovou seis terapias com células CAR-T de segunda geração direcionadas ao CD-19 ou ao antígeno de maturação de células B (BCMA) para malignidades hematológicas recidivantes ou refratárias, incluindo linfoma de grandes células B, linfoma de células do manto e mieloma múltiplo 6. As novas gerações de células CAR-T estão atualmente passando por estudos pré-clínicos e clínicos intensivos14,15.

A produção clínica de células CAR-T é um processo complexo, caro e demorado. Atualmente, os leucócitos utilizados para a preparação de células CAR-T são provenientes dos próprios pacientes para evitar reações alogênicas, embora as células CAR-T universais derivadas de doadores (ou prontas para uso) estejam em desenvolvimento ativo e avaliação clínica16. Após o isolamento dos leucócitos do sangue periférico do paciente por leucaférese, um fragmento de gene estranho que codifica o CAR é introduzido nas células T ativadas usando abordagens virais ou não virais 17,18,19. Retrovírus e lentivírus são os vetores virais mais comuns para a entrega do gene CAR, o que resulta na integração aleatória e permanente do DNA codificador de CAR no genoma da célula T20. Abordagens não virais, incluindo nanopartículas lipídicas de mRNA, sistemas de transposons e edição do genoma CRISPR/Cas9, são menos comuns21. Posteriormente, as células T que expressam CAR são expandidas ex vivo em grande escala e, em seguida, coletadas e reinfundidas de volta nos pacientes22,23. A fabricação de vetores virais que atendem aos rigorosos padrões de Boas Práticas de Fabricação (GMP) é muito difícil, complexa e cara, colocando um fardo significativo sobre fabricantes, agências reguladoras e pacientes, limitando assim sua aplicação clínica generalizada.

Apesar do sucesso empolgante da terapia CAR-T, há uma preocupação crescente com sua segurança. Dada a natureza aleatória da integração do transgene CAR no genoma da célula T durante a transdução viral ou de transposon, pode ocorrer interrupção de genes supressores de tumor ou ativação de oncogenes, levando à transformação maligna das células T24,25. Desde a aprovação do FDA do primeiro produto de terapia com células CAR-T em 2017, estudos de acompanhamento mostram que até 15% dos pacientes que recebem a terapia desenvolvem malignidades primárias secundárias (SPMs), como linfoma de células T (TCL), câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) e câncer de pele 26,27,28,29. Surpreendentemente, os transgenes CAR foram altamente detectados em alguns SPMs30,31, e alguns casos de TCL foram causados diretamente pela expansão anormal das células CAR-T 24,32,33, indicando um papel direto dos produtos CAR-T na indução de alguns SPMs. Outros estudos identificaram ainda inserções de transgenes CAR em genes críticos, como TET234, JAK135 e PBX236 nas células tumorais SPM. À luz do acúmulo de evidências de neoplasias malignas de células T após a terapia com células CAR-T, o FDA concluiu recentemente que um aviso na caixa destacando um sério risco de malignidade de células T é necessário para todas as terapias com células CAR-T direcionadas a CD19 e BCMA atualmente aprovadas37. No entanto, estudos de grande coorte que acompanham os efeitos a longo prazo do tratamento com CAR-T relatam uma incidência de SPMs variando de 3,8% a 15% entre os pacientes tratados 26,27,28,38,39. A incidência não é significativamente maior do que a observada em pacientes com câncer de sangue que recebem tratamento sistemático tradicional40,41, sugerindo um perfil relativamente seguro para a terapia com células CAR-T. No entanto, há uma necessidade urgente de desenvolver células CAR-T seguras e eficazes que minimizem o risco de SPMs por meio de abordagens mais econômicas.

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para uma abordagem não viral e não integradora para gerar células CAR-T. O objetivo é fornecer um guia direto e passo a passo para gerar células CAR-T eficazes e em pequena escala com expressão transitória de CAR, evitando assim a mutagênese insercional e minimizando o risco de SPMs. Mostramos que a eletroporação de células T com mRNA modificado que codifica um CAR específico para o TAA HER2 resultou em expressão robusta e transitória do anti-HER2 CAR na superfície da célula T. Ao expressar o CAR, as células T mataram potentemente as células tumorais HER2-positivas e secretaram um alto nível de IFN-Υ. O protocolo é descrito em quatro seções separadas, mas contínuas, que incluem preparação de mRNA CAR, ativação e eletroporação de células T, avaliação da expressão de CAR e análise da função das células CAR-T. Essa abordagem é adequada para desenvolver e produzir células CAR-T transitórias para pesquisas acadêmicas e terapias celulares clínicas.

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Protocolo

Os PBMCs usados aqui foram previamente isolados de sangue total do Stanford Hospital Blood Center de acordo com o protocolo aprovado pelo Institutional Review Board (IRB) (13942) usando o gradiente de densidade Ficoll-Paque descrito antesde 42. O consentimento informado dos participantes não foi aplicável, pois o sangue que usamos para coletar as PBMCs foi obtido comercialmente no Stanford Hospital Blood Center.

1. Preparação de mRNA CAR

  1. Preparação do modelo
    NOTA: Um plasmídeo linearizado ou um fragmento de PCR podem servir como modelo para sintetizar o mRNA CAR in vitro, desde que contenham um promotor 5' SP6 ou T7 adequado, uma região 5' não traduzida (UTR), um transgene CAR e um 3'UTR com uma cauda poli (A) apropriada. Neste estudo, usamos uma construção de DNA de plasmídeo CAR contendo um promotor SP6, uma beta-globina humana curta 5'UTR, um transgene CAR e um 3'UTR composto por duas beta-globina 3'UTRs em tandem seguidas por uma cauda poli (A) de 112 pb43. Os UTRs, a sequência de codificação e a cauda poli (A) afetam a estabilidade do RNA e a eficiência translacional43 , 44 , 45 . Foi demonstrado que uma cauda poli (A) de 120 pb aumenta o rendimento de proteína em cultura de células em comparação com caudas mais curtas43.
    1. Prepare o DNA do plasmídeo de construção CAR usando um kit de preparação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. O DNA de plasmídeo de alta qualidade é essencial para gerar um alto rendimento de mRNA CAR.
    2. Linearize o DNA do plasmídeo CAR com a enzima de restrição BglII. Escolha uma enzima de restrição que corte após a cauda poli (A), preferencialmente perto do final da cauda poli (A). Digerir 10 μg (ou 10.000 ng) do plasmídeo quantificado por um espectrofotómetro numa mistura de reacção de 100 μL contendo 10 U da enzima, 10 μL de tampão de digestão e água isenta de nuclease durante a noite a 37 °C.
      NOTA: Certifique-se de que a enzima de restrição não corte dentro do transgene CAR e seu promotor flanqueador, UTR e sequências de cauda poli (A). A linearização completa do plasmídeo CAR é necessária para uma transcrição eficiente do mRNA do CAR.
    3. Adicione 200 μg / mL de protease K e 0,5% p / v de SDS na mistura de digestão e incube a 50 ° C por 1 h.
    4. Purifique o DNA do plasmídeo CAR linearizado. Adicione um volume igual de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25:24:1, v/v) à reação de digestão. Vórtice vigorosamente por aproximadamente 15 s. Girar a amostra numa centrifugadora de bancada à velocidade máxima durante 5 minutos à temperatura ambiente (RT).
    5. Transfira a camada aquosa superior, que contém o DNA, para um novo tubo de microcentrífuga. Evite a transferência de qualquer uma das camadas intermediária e inferior, que contêm impurezas de proteínas e fenois. Realize uma segunda rodada de extração com clorofórmio para reduzir as impurezas.
    6. Adicione 1/10do volume de acetato de amônio 7,5 M ou acetato de sódio 3 M e misture delicadamente. Adicione 2,5 volumes de etanol para precipitar o DNA. Armazene a amostra a -20 °C por pelo menos 30 min.
    7. Girar a amostra à velocidade máxima durante 15 minutos a 4 °C para sedimentar o ADN. Remova o sobrenadante com cuidado. Adicione 500 μL de etanol a 70% para lavar o pellet de DNA.
    8. Girar novamente a amostra durante 2 min a 4 °C. Remova cuidadosamente o sobrenadante. Deixe uma pequena quantidade de solução no tubo.
    9. Repita a centrifugação por 2 min a 4°C. Remova cuidadosamente o sobrenadante restante. Seque ao ar o pellet de DNA em RT por cerca de 10 min em uma capa estéril até que nenhuma solução de etanol seja visível no fundo do tubo.
      NOTA: Evite secar demais o pellet de DNA, pois pode ser difícil dissolvê-lo.
    10. Adicione 20 μL de água livre de nuclease e pipete para cima e para baixo suavemente para dissolver o DNA. Centrifugue a amostra brevemente na velocidade máxima. Meça a concentração de DNA com um espectrofotômetro.
    11. Armazene a amostra em gelo para uso imediato ou a -20 ° C para uso futuro. Carregar 100 ng do ADN purificado num gel de agarose e verificar o tamanho e a integridade. O DNA deve aparecer como uma banda única e distinta do tamanho esperado. Nenhuma banda extra ou manchada deve ser observada.
      NOTA: A qualidade do DNA molde é crítica para a transcrição eficiente do mRNA. Evite usar DNA impuro, fragmentado e degradado como modelo para transcrição de mRNA.
  2. Transcrição in vitro (IVT)
    1. Sintetizar o mRNA CAR in vitro. Certifique-se de usar reagentes, tubos e pontas de pipeta livres de nuclease durante os procedimentos.
    2. Descongelar os reagentes listados na Tabela 1 para RT, exceto para a mistura de RNA polimerase SP6, que deve ser armazenada a -20 °C até o uso. Preparar a reacção de transcrição pela ordem indicada no quadro 1 à RT. Misturar suavemente e incubar a 37 °C durante, pelo menos, 2 h.
      NOTA: A reação pode ser ampliada ou reduzida com base na quantidade de mRNA necessária. A reação mostrada acima normalmente produz pelo menos 100 μg (ou 100.000 ng) de mRNA tampado ao usar DNA molde de alta qualidade. Uma incubação mais longa, ou seja, durante a noite, pode aumentar o rendimento do mRNA.
    3. Adicione 2 μL de DNase I livre de RNase à reação, misture suavemente e incube por 15 min a 37 ° C para degradar o DNA molde.
    4. Purifique o mRNA CAR transcrito usando um kit de limpeza de RNA (consulte a Tabela de Materiais). Siga as instruções do fabricante do kit para a purificação. Eluir o mRNA em água livre de nuclease.
      NOTA: O mRNA também pode ser purificado usando o método de extração de fenol-clorofórmio mostrado acima (etapa 1.1.4).
    5. Meça a concentração de mRNA com um espectrofotômetro. Carregue pelo menos 200 ng do mRNA em um gel de agarose e verifique seu tamanho e integridade. O mRNA deve aparecer como uma banda dominante do tamanho esperado, sem bandas adicionais ou manchadas. Armazene o mRNA a -80 °C até o uso.

2. Ativação e eletroporação de células T

  1. Suspenda 1 x 106 células mononucleares do sangue periférico humano criopreservadas (PBMCs) em 1 mL de meio CAR-T (meio AIM-V suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), penicilina/estreptomicina e 10 ng/ml de IL-2 recombinante humana). Ative as células T com um número igual de esferas CD3/CD28 do ativador T humano pré-lavadas (consulte a Tabela de Materiais). Cultive e expanda as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2 por vários dias.
    NOTA: A quantidade de PBMCs pode ser ampliada ou reduzida com base na quantidade de células T necessárias para experimentos subsequentes.
  2. Descongele o mRNA CAR preparado no gelo. Adicione 1 mL de meio CAR-T por alvéolo a dois poços de uma placa de 12 poços e equilibre o meio colocando a placa na incubadora a 37 °C.
  3. Transfira 5 células 106 T para um tubo estéril e remova as esferas colocando o tubo em um suporte magnético e pipetando cuidadosamente a suspensão da célula para um novo tubo.
  4. Centrifugue o tubo a 300 x g por 5 min em RT. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de PBS estéril.
  5. Centrifugue novamente o tubo. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 200 μL de tampão néon T (ver Tabela de Materiais).
  6. Pipetar 100 μL de células para um novo tubo e adicionar 5 μg (ou 5.000 ng) de mRNA CAR às células46. Suplementar o tampão de néon T até um total de 125 μL e misturar pipetando para cima e para baixo.
    NOTA: A quantidade de mRNA de CAR a ser transfectada por eletroporação pode ser aumentada em até 8 μg (ou 8.000 ng) por 1 x 106 células T sem afetar negativamente a viabilidade celular, e uma quantidade maior de mRNA pode levar ao aumento da expressão de CAR46.
  7. Adicione 25 μL de tampão Neon T às células restantes de 100 μL. Isso serve como controle negativo.
  8. Eletroporar as células T. Use a pipeta de néon para aspirar as células T/mistura de mRNA CAR ou as células T de controle negativo em uma ponta de néon de 100 μL e eletroporar as células com um pulso de 10 ms de 1800 V.
  9. Transferir imediatamente as células para o meio de cultura equilibrado na placa de 12 poços (preparada no passo 2.2) após a electroporação.
  10. Retorne a placa de volta à incubadora e expanda as células até que estejam prontas para uso. Para garantir um crescimento saudável e rápido das células T CAR, mantenha a densidade celular entre 1−3 x 106 células/mL com meio fresco até que seja necessário.

3. Avaliação da expressão de CAR

  1. Misture as células T CAR pipetando para cima e para baixo suavemente várias vezes em cada poço e transfira pelo menos 1 x 105 células para um tubo FACS de 5 mL.
  2. Adicione 3 mL de tampão de lavagem a frio (PBS contendo 2 mM EDTA e 0,5% p / v BSA) ao tubo. Centrifugar o tubo a 500 x g durante 5 min a RT. Retirar o sobrenadante cuidadosamente.
  3. Ressuspenda o pellet celular em 100 μL de tampão de lavagem. Adicione 2 μL do anticorpo anti-IgG F(ab')2 de cabra conjugado com reagente de detecção CAR (APC) (ver Tabela de Materiais) e 2 μL de um corante de viabilidade 7-AAD nas células suspensas.
    NOTA: O CAR também pode ser detectado usando um antígeno alvo devidamente marcado ou um anticorpo anti-marcação se o CAR contiver uma marca (ou seja, FLAG). Se um anticorpo não marcado for usado para detecção de CAR, a incubação com um anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado é necessária após a etapa 3.4.
  4. Misture a amostra agitando suavemente o tubo e incube no gelo por 30 min. Evite a luz durante a incubação. Lave as células com 3 mL de tampão de lavagem a frio e centrifugue o tubo a 500 x g por 5 min em RT.
  5. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 100 μL de tampão de lavagem. Analise as células usando um citômetro de fluxo imediatamente. Certifique-se de que o rótulo fluorescente do reagente de detecção e o corante de viabilidade sejam devidamente compensados usando controles positivos e negativos apropriados.
  6. Avalie a expressão de CAR usando a seguinte estratégia de gating: Gate nas células usando o gráfico FSC-A vs SSC-A; Gate nas células individuais usando o gráfico FSC-A vs FSC-H; Gate nas células vivas usando a coloração 7-AAD.
  7. Calcule a porcentagem de células T vivas que foram coradas pelo anticorpo anti-IgG F (ab ') 2 humano. Compare as células CAR-T com as células T de controle negativo, que devem ter coloração mínima.

4. Análise da função das células CAR-T

  1. Análise de citotoxicidade
    1. Certifique-se de que as células tumorais alvo expressem o antígeno em uma conformação que possa ser reconhecida pelo CAR. Para confirmar a expressão do antígeno, analise as células tumorais por citometria de fluxo usando o anticorpo original do qual o CAR foi derivado. Se o CAR não puder reconhecer as células tumorais, as células CAR-T não conseguirão matar as células tumorais.
    2. Prepare as células-alvo do tumor que expressam o antígeno do CAR na superfície celular. Tripsinize as células tumorais aderentes com solução de tripsina-EDTA a 0,05% por 1 min a 37 ° C e prepare a suspensão de célula única com meio de cultura apropriado a 1-4 x 105 células / mL.
      NOTA: As células tumorais devem ser bem aderentes para garantir uma análise precisa nas etapas subsequentes. Se as células tumorais aderirem mal, se desprenderem facilmente ou crescerem em suspensão, cubra os poços da placa usada na etapa seguinte com um anticorpo apropriado, polímero policatiônico ou material biológico, como fibronectina ou colágeno, para facilitar a fixação celular.
    3. Prepare uma placa eletrônica (consulte a tabela de materiais). Projete a configuração experimental. Adicione 50 μL de meio de cultura de células tumorais pré-aquecido em cada poço e coloque a placa E no instrumento de análise celular em tempo real (RTCA) para medir a impedância de fundo. Meça a impedância a 1 min por medição (ou varredura) para 3 varreduras.
      NOTA: A impedância de fundo é usada para definir o índice da célula como zero. Sem medição de impedância de fundo, os poços não podem ser comparados entre si, tornando os resultados não interpretáveis.
    4. Remova a placa E do instrumento RTCA e adicione 100 μL da suspensão de células tumorais a cada poço. Portanto, cada poço contém 1−4 x 104 células em 150 μL de volume total.
      NOTA: O número de células tumorais a serem semeadas em cada poço deve ser determinado antes do experimento. Semeie a placa E com uma variedade de números de células e, em seguida, monitore os índices de células nas próximas 24 a 48 horas. O número desejado de células mantém um aumento constante no índice celular por pelo menos 24 horas sem estabilizar. A semeadura excessiva de células pode acelerar a depleção de nutrientes e a acidificação do meio, resultando em platô precoce do índice celular. Além disso, poços replicados devem ser incluídos para cada grupo para identificar possíveis medições discrepantes.
    5. Equilibre a placa E em RT por 30 min. Esta etapa permite que as células tumorais se estabeleçam e adiram ao fundo dos poços.
      NOTA: Esta etapa é necessária para uma medição precisa do índice celular. Pular essa etapa geralmente causa variabilidade poço a poço nas medições do índice celular e adesão desigual de células tumorais dentro dos poços, resultando em aumento de ruído no ensaio.
    6. Coloque a placa E de volta no instrumento RTCA e monitore os índices das células por cerca de 24 h, com varreduras feitas a cada 5 a 15 minutos.
    7. No dia seguinte, prepare a suspensão de células CAR-T. Suspenda as células CAR-T (as células efetoras) da etapa 2.10 no meio RPMI 1640 mais 10% de FBS até uma concentração determinada pela célula tumoral (a célula-alvo) e a proporção desejada de células efetoras:alvo (E:T). Por exemplo, se a suspensão de células tumorais estava em uma densidade de 2 x 105 células/mL e uma proporção E:T de 10:1 é desejada, então as células CAR-T devem ser suspensas em 2 x 106 células/mL. Inclua controles adequados, como células tumorais isoladas (sem células efetoras) e células T de controle (células T eletroporadas sem mRNA ou com mRNA de controle).
      NOTA: Para obter os melhores resultados, use as células CAR-T 1-2 dias após a eletroporação, quando a expressão de CAR na superfície for alta. Para explorar a relação E:T ideal, uma faixa de proporções E:T (por exemplo, 3:1 a 20:1) pode ser testada. A menos que a frequência CAR-T seja muito baixa, ou seja, abaixo de 10%, uma relação E:T de 10:1 ou 20:1 é geralmente suficiente para atingir a morte quase completa das células tumorais.
    8. Pause a gravação do índice celular e remova a placa E do instrumento RTCA.
    9. Incline ligeiramente a placa, remova 50 μL de meio de cultura de cada poço com cuidado, sem tocar nas células tumorais, e adicione 100 μL das células CAR-T ou células T de controle em cada poço.
    10. Retorne a placa E ao instrumento RTCA e retome o monitoramento do índice celular por pelo menos 24 h com varreduras feitas a cada 5 a 15 minutos.
      NOTA: A duração do monitoramento do índice celular depende da rapidez com que as células CAR-T visam as células tumorais. Um período de incubação de 24 horas geralmente é suficiente para que as células CAR-T exerçam o máximo efeito citotóxico.
    11. Pare o monitoramento do índice celular, remova a placa E do instrumento RTCA e analise o resultado da citotoxicidade. Calcule a citotoxicidade como a porcentagem de células tumorais que foram mortas pelas células CAR-T. Calcule a citotoxicidade média das células CAR-T e das células T de controle usando o software RTCA. Para calcular a citotoxicidade manualmente, use a fórmula
      citotoxicidade = ((índice celular de células tumorais) − (índice celular de células tumorais mais células efetoras)) / (índice celular de células tumorais) × 100%.
  2. Análise de secreção de citocinas
    1. Para analisar as citocinas, como IFN-Υ secretadas pelas células CAR-T durante a análise de citotoxicidade, transfira o sobrenadante da placa E para uma placa de fundo redondo ou em forma de V de 96 poços.
      NOTA: Se for desejada uma análise de curso de tempo da secreção de citocinas, pause o monitoramento do índice celular na etapa 4.1.10, colete uma pequena porção do sobrenadante de cada poço, devolva a placa E de volta ao instrumento RTCA e retome o monitoramento.
    2. Centrifugue a placa de 96 poços a 300 x g por 5 min em RT. Transfira cuidadosamente os sobrenadantes para uma nova placa de 96 poços sem perturbar os pellets das células.
    3. Meça os níveis de citocinas nos sobrenadantes usando kits comerciais de ensaio imunoenzimático (ELISA) de acordo com as instruções do fabricante. Os sobrenadantes geralmente requerem diluição antes da medição, às vezes mais de 100 vezes, dependendo das citocinas que estão sendo analisadas.
    4. Analise os dados interpolando os valores de absorbância da amostra em relação a uma curva padrão gerada a partir de padrões diluídos em série. Prepare gráficos com barras de erro representando a média ± desvio padrão (DP) usando o software apropriado. Para comparar a diferença entre os tratamentos, um teste t de Student pode ser realizado. Um valor de p menor que 0,05 é geralmente considerado estatisticamente significativo.
      NOTA: Os pontos de dados que são discrepantes claros, provavelmente devido a erros experimentais, devem ser excluídos da análise.

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Resultados

Construímos um CAR direcionado a HER2 de segunda geração contendo um scFv derivado do anticorpo monoclonal de camundongo (mAb) anti-HER2 humanizado 4D547, uma região transmembrana e um domínio coestimulatório intracelular 4-1BB seguido pelo domínio de ativação CD3ζ (Figura 1A). A sequência de DNA que codifica o CAR continha um promotor 5 'SP6 para conduzir a transcrição do mRNA do CAR in vitro ( Figura 1B ). O mRNA do CAR tinha a...

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Discussão

Neste estudo, descrevemos uma abordagem não viral e não integradora detalhada para gerar células CAR-T transitórias e fornecemos procedimentos técnicos para avaliar a função das células CAR-T. Essa abordagem evita o uso de vetores retrovirais e lentivirais convencionais para entrega permanente e aleatória de transgenes CAR, em vez disso, aproveita a eletroporação para introduzir eficientemente o mRNA CAR modificado in vitro nas células T. Este método permite a expressão transitó...

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Divulgações

Os autores Liang Hu, Robert Berahovich, Yanwei Huang, Shiming Zhang, Jinying Sun, Xianghong Liu, Hua Zhou, Shirley, Xu, Haoqi Li e Vita Golubovskaya são funcionários da ProMab Biotechnologies. Lijun Wu é funcionário e acionista da ProMab Biotechnologies.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela ProMab Biotechnologies.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Corante de viabilidade 7-AAD Biolegend420404
ACEA Novocyte Citômetro de fluxoAgilentNovoCyte 3000
AIM-V meioGibco12055083
APC cabra anti-humano IgG F (ab ') 2 anticorpoJackson ImmunoResearch Laboratories109-136-097
BglII Enzima de RestriçãoNew England BioLabs (NEB)R0144L
3´-O-Me-m7G(5')pp(5')G RNA Cap Structure AnalógicoNEBS1411S
DMEM, alta glicoseGibco11965092
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 grânulosGibco11131D
E-Plate 96Agilent5232376001
EtanolSigma459844-4L
FBSLonza.comKit de Síntese de RNA HiScribe SP6 14-503F
New England BioLabs (NEB)E2070S
Proteína Recombinante Humana IL-2Gibco15140122
Marcadores de RNA do MilênioMonarca InvitrogenAM7150
(500 μ g)NEBT2050L
N1-Metilpseudo-UTPTrilinkN-1081-10
Instrumento de Transfecção de NéonInvitrogenMPK5000
Sistema de Transfecção de Néon 100-μ L KitInvitrogenMPK10096
Penicilina-Estreptomicina (10000 U/mL)Gibco14-503F
RPMI 1640 MédioGibco11875135
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenolGibco25300120
UltraPure Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1, v/v)Invitrogen15593049
xCELLigence Instrumento de Análise Celular em Tempo Real (RTCA)AgilentRTCA MP
ZymoPURE II Plasmid Midiprep KitZymo ResearchD4201
Kit de Limpeza de RNA

Referências

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