Artigo de método

Identificação de locais de integração de lentivírus funcionalmente relevantes em uma biblioteca de células de mutagênese insercional

DOI:

10.3791/67552

⸱

10 de janeiro de 2025

 ,  , 
1Institute of Genomics, School of Medicine, Huaqiao University, 2State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Xiamen University

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A mutagênese insercional é uma ferramenta essencial na genética direta para identificar elementos genômicos funcionais. Aqui, descrevemos a Tela baseada em inserção para elementos funcionais e transcritos (InSET), um método para detectar locais de integração de lentivírus dentro de uma biblioteca de células de mutagênese de inserção baseada em lentivírus.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A extensão das sequências funcionais dentro do genoma humano é um tópico crucial, mas debatido, na biologia. Embora as triagens genéticas reversas de alto rendimento tenham feito progressos na exploração disso, elas geralmente limitam seu escopo a elementos genômicos conhecidos e podem introduzir efeitos não específicos. Isso ressalta a necessidade urgente de novas ferramentas de genômica funcional que permitam uma compreensão mais profunda e imparcial da funcionalidade do genoma. Este protocolo apresenta a Tela baseada em Inserção para Elementos e Transcrições Funcionais (InSET), um método para identificar locais de integração de lentivírus dentro de uma biblioteca de células de mutagênese de inserção baseada em lentivírus. O InSET facilita a captura de locais de integração lentiviral em todo o genoma, com sequenciamento de última geração usado para detectar e quantificar sequências de flanqueamento. O design do InSET permite a análise das variações de abundância do local de integração em telas fenotípicas em larga escala, estabelecendo-o como uma ferramenta robusta para genética avançada e para identificar elementos genômicos funcionais. Um dos principais benefícios do InSET é sua capacidade de revelar elementos genômicos não identificados anteriormente, incluindo novos éxons funcionais de RNAs codificadores e não codificantes de proteínas, independentemente de anotação prévia. No geral, o InSET tem um valor significativo no estudo da intrincada complexidade do genoma humano e do transcriptoma, onde muitos elementos genômicos aguardam caracterização funcional.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A genômica funcional continua sendo um campo crucial e desafiador, mesmo na era pós-genoma, com uma parcela significativa de regiões genômicas ainda sem caracterização funcional. Uma das principais razões para esses desafios está na natureza intrincada do genoma humano e do transcriptoma, que são caracterizados por transcrição generalizada e splicing alternativo universal em regiões codificantes e não codificantes de proteínas1,2,3,4,5. Essa complexidade foi amplamente destacada por meio de estudos de enriquecimento direcionados a RNA6,7,8,9. É cada vez mais reconhecido que vários novos elementos genômicos permanecem não mapeados e funcionalmente não anotados10,11,12, além dos segmentos bem anotados do genoma humano.

Nos últimos anos, foram observados avanços nas ferramentas de genética reversa, como interferência de RNA (RNAi) e sistemas CRISPR/CAS13,14,15,16,17,18,19,20,21. No entanto, esses métodos têm desvantagens notáveis, incluindo efeitos não específicos e altos custos associados à geração de bibliotecas complexas de RNAs de grampo curto (shRNAs) ou RNAs de guia único (sgRNAs)22,23,24,25. Além disso, esses métodos se concentram predominantemente em elementos genômicos anotados. Em contraste, a genética avançada tem a vantagem de identificar novos elementos genômicos funcionais não anotados. Dada a complexidade do genoma humano e do transcriptoma, bem como o vasto número de novos elementos genômicos, essa capacidade da genética direta é de importância significativa.

As bibliotecas de células genéticas avançadas são frequentemente geradas por meio de integração retroviral aleatória, tornando a detecção eficiente de locais de integração de todo o genoma crucial para um ensaio genético avançado. A detecção desses locais de integração normalmente envolve ferramentas de caminhada do genoma26. Embora tenha havido avanços significativos nessas ferramentas, poucas são otimizadas para aplicações de sequenciamento de próxima geração (NGS) e posteriormente aplicadas em estudos de mutagênese insercional. A mutagênese insercional em linhagens celulares geralmente utiliza métodos como PCR inverso (I-PCR) ou PCR mediada por amplificação linear (LAM-PCR) para detectar locais de integração27,28,29. Esses métodos, no entanto, geralmente requerem etapas de digestão ou ligadura da enzima de restrição, o que pode reduzir a eficiência e introduzir vieses nos resultados.

Para melhorar a detecção eficiente de locais de integração de todo o genoma em telas genéticas avançadas, um método chamado método de Tela Baseada em Inserção para Elementos Funcionais e Transcrições (InSET) foi introduzido aqui. Ao integrar a caminhada do genoma com o NGS, o InSET permite a identificação de alto rendimento de locais de integração de lentivírus em bibliotecas de mutagênese de inserção baseadas em lentivírus. Comparado aos métodos existentes27,28,29, o InSET é relativamente direto e simples, eliminando as etapas de digestão ou ligadura da enzima de restrição, tornando-o mais conveniente e acessível. Além disso, embora a triagem genética direta existente em células de mamíferos seja limitada a muito poucas linhagens celulares haplóides ou quase haplóides27,28,29,30,31, o InSET provou funcionar em linhagens celulares aneuploides32.

Este estudo fornece um protocolo detalhado e passo a passo para implementar o método InSET. Além disso, demonstra a aplicação do InSET em estudos de mutagênese insercional. O InSET serve como uma ferramenta poderosa para identificar novos éxons dentro de elementos genômicos, abrangendo RNAs codificadores e não codificantes de proteínas em linhagens celulares humanas.

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Protocolo

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A Figura 1 fornece uma visão geral esquemática do método InSET. Para uma cobertura ideal, prepare cinco bibliotecas paralelas a partir de 1 μg de DNA genômico e, em seguida, agrupe-as para sequenciamento de próxima geração. Este procedimento foi concluído com sucesso continuamente em testes anteriores, embora os usuários possam introduzir pontos de pausa com base em seu critério. Informações detalhadas sobre os reagentes e equipamentos utilizados neste estudo podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

1. Captura de locais de integração de lentivírus no genoma

  1. Use o DNA genômico isolado da biblioteca de células de mutagênese insercional baseada em lentivírus (1 μg), conforme descrito em um estudo anterior32, como modelo para uma PCR linear em uma reação de 50 μL contendo 1x tampão Taq, 2,5 U Taq DNA polimerase, 4 μL de mistura dNTP (2,5 mM cada) e 0,3 μM de primer biotinilado 3-LTR_prime (Tabela 1) em um tubo de PCR.
    NOTA: O primer de 3 LTR_prime recoze para a região LTR da sequência de lentivírus. Se recozer para o 5' LTR, o fragmento amplificado inclui a sequência genômica flanqueadora. Se ele recozer para o 3 'LTR, o fragmento amplificado contém uma sequência interna de lentivírus, que não pode ser alinhada ao genoma do hospedeiro e, portanto, será filtrada durante a análise de dados de sequenciamento a jusante. Este primer também pode ser modificado para se adaptar a outros tipos de vetores usados para gerar uma biblioteca de células de mutagênese insercional.
  2. Realize 50 ciclos de PCR linear em um termociclador de PCR padrão, adicionando 2,5 U de Taq DNA Polimerase no início e novamente imediatamente após 25 ciclos. As condições de PCR são as seguintes: 94 °C por 5 min; 50 ciclos de 94 °C durante 30 s, 55 °C durante 30 s e 72 °C durante 30 s; 72 °C por 5 min.
    NOTA: Para manter a atividade da Taq DNA Polimerase durante reações prolongadas, recomenda-se adicionar a enzima no início e no ponto médio da reação.
  3. Transfira os produtos de PCR para um tubo de centrífuga novo e limpo de 1,5 mL.
  4. Misture bem os produtos de PCR com 10 μL de esferas magnéticas de biotina-estreptavidina.
  5. Incubar a mistura por 2 horas em temperatura ambiente, agitando a 400 rpm em banho de metal.
    NOTA: Retire o tubo para misturar bem com a pipeta a cada 15 min.
  6. Use um suporte magnético para coletar as contas e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante.
  7. Lave os grânulos com 300 μL de tampão de ligação/lavagem (10 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de EDTA, 1 M de NaCl, 0,1% Tween-20) 6 vezes e descarte o sobrenadante.
  8. Lavar duas vezes com 300 μL (65 °C) de água destilada isenta de DNase/RNase e eliminar o sobrenadante.
  9. Para a síntese da segunda fita, ressuspenda os grânulos em um volume de reação de 24 μL contendo 1x tampão de fragmento de Klenow, 2 μL de mistura dNTP (2,5 mM cada) e 6,25 μM de primer P5_N6 (Tabela 1) em um tubo de PCR.
    NOTA: Prepare uma solução estoque de 100 μM de primer P5_N6. O primer P5_N6 é composto por uma sequência fixa do adaptador P5 na extremidade 5' e uma sequência hexâmera aleatória na extremidade 3'. O hexâmero aleatório pode se ligar a uma gama diversificada de sequências-alvo, tornando-o adequado para amplificar vários fragmentos de DNA gerados por PCR linear.
  10. Pré-incubar a mistura a 15 °C durante 20 min num termociclador PCR.
  11. Adicione 2 U de fragmento de Klenow (fragmento grande de E.coli DNA polimerase).
  12. Incubar as misturas num termociclador de PCR nas seguintes condições: rampa lenta a 0,5 °C/min de 15 °C a 25 °C, seguida de 30 min de incubação; em seguida, rampa lenta a 0,5 °C/min a 37 °C, seguida de 1 h de incubação.
  13. Transfira os produtos de PCR para um tubo de centrífuga novo e limpo de 1,5 mL.
  14. Use um suporte magnético para capturar as contas e, em seguida, descarte o sobrenadante.
  15. Lavar as esferas suavemente com 300 μL de água destilada sem DNase/RNase a 4 °C. Colete as contas e descarte o sobrenadante.

2. Construção de biblioteca NGS com nested PCR

  1. Ressuspenda os grânulos da etapa 1.15 em um volume de reação de PCR de 25 μL contendo 1x Tampão Taq, 1.25 U Taq DNA Polimerase, 0.5 μM de primer P5 (Tabela 1), 2 μL de Mistura dNTP (2.5 mM cada) e 0.5 μM de primer 3-LTR_Nest (Tabela 1) em um tubo de PCR.
  2. Realize reações de PCR em um termociclador de PCR nas seguintes condições: 94 ° C por 3 min; 20 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s; 72 ° C por 7 min.
  3. Use 5 μL dos produtos de PCR da etapa 2.2 como modelo para a próxima rodada de PCR em volume de 50 μL contendo 1x tampão Taq, 2,5 U Taq DNA polimerase, 4 μL de mistura dNTP (2,5 mM cada), 0,4 μM de primer Illumina_P5 (Tabela 1) e 0,4 μM de primer Illumina_P7-3LTR (Tabela 1).
  4. Realize reações de PCR em um termociclador de PCR nas seguintes condições: 94 ° C por 3 min; 15 ciclos de 94 ° C por 30 s, 55 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s; 72 ° C por 7 min.
  5. Transfira os produtos de PCR para um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado nesta etapa e as amostras podem ser armazenadas a -20 °C.
  6. Purifique os produtos de PCR usando 1,2x volumes de grânulos limpos de DNA, elevando o volume final para 21 μL.
    NOTA: Pegue 10 μL de produtos de PCR de cada uma das 5 bibliotecas preparadas em paralelo, junte-os e purifique até obter um volume final de 21 μL. O protocolo de purificação para os produtos de PCR é adaptado das instruções do fabricante para os grânulos de DNA limpos (consulte a Tabela de Materiais).
    1. Equilibre os grânulos de 2-8 °C à temperatura ambiente por 30 min.
    2. Misture bem as contas invertendo ou vórtice.
    3. Pipete 1,2x volumes dos grânulos em um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL.
    4. Adicione os produtos de PCR nos grânulos e misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
    5. Incube em temperatura ambiente por 5 min para permitir a ligação do DNA às contas.
    6. Coloque as amostras em um suporte magnético e remova o sobrenadante assim que a solução estiver límpida (cerca de 5 min).
    7. Adicione 200 μL de etanol a 80% para lavar as contas, incube em temperatura ambiente por 30 s e remova o sobrenadante.
      NOTA: O etanol a 80% deve ser preparado na hora.
    8. Repita a etapa 2.6.7 uma vez.
    9. Seque as contas ao ar em temperatura ambiente com a tampa aberta por cerca de 5 min.
    10. Remova o tubo do suporte magnético, adicione 22 μL de água destilada sem DNase / RNase, misture bem pipetando para cima e para baixo 10 vezes e deixe descansar em temperatura ambiente por 2 min.
    11. Coloque o tubo no suporte magnético até que a solução esteja límpida (cerca de 2 min) e, em seguida, transfira 21 μL de sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado nesta etapa e as amostras podem ser armazenadas a -20 °C.
  7. Use 1 μL de produtos de PCR purificados para medir a concentração usando o fluorômetro com o kit de detecção de fluorescência dsDNA disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: O protocolo de medição de concentração segue as instruções do fabricante para o kit de detecção de dsDNA.
    1. Prepare a preparação da solução de trabalho misturando o reagente e o tampão (fornecidos no kit) na proporção de 1:200.
    2. Prepare os padrões de ensaio misturando 10 μL do Padrão #1 e 10 μL do Padrão #2 (fornecido no kit), cada um com 190 μL de solução de trabalho. Suavemente vortex a mistura por 2-3 s.
    3. Prepare a amostra de ensaio misturando 1 μL dos produtos de PCR purificados com 190 μL de solução de trabalho. Suavemente vortex a mistura por 2-3 s.
    4. Incube os padrões de ensaio e as amostras de ensaio por 2 min em temperatura ambiente, mantendo-as protegidas da luz.
    5. Ligue o fluorômetro.
    6. Selecione o programa dsDNA High Sensitivity no menu principal.
    7. Para calibração, insira o Padrão #1 na máquina, pressione o botão Ler padrão para medir o primeiro padrão, depois insira o Padrão #2 e pressione o botão Ler padrão para medir o segundo padrão.
    8. Para medição de amostra, pressione o botão Executar amostras para ir para a página de medição de amostra. Insira cada tubo contendo a amostra de ensaio e pressione o botão Ler tubo para obter a concentração.
      NOTA: O protocolo pode ser pausado nesta etapa e as amostras podem ser armazenadas a -20 °C.
  8. Execute NGS em plataformas Illumina usando a estratégia de extremidade emparelhada de 150 bp (PE150) em uma escala de 30 giga-base (GB).
    NOTA: Esta etapa geralmente é terceirizada para as empresas de sequenciamento.

3. Análise dos dados

NOTA: A análise em linhagens celulares humanas foi usada como exemplo nesta seção.

  1. Mapeamento de locais de integração de lentivírus
    1. Filtre leituras de sequenciamento com mais de 50% de bases de baixa qualidade (pontuação Phred <20), mais de 15 'N' bases ou menos de 150 bases usando fastp tool33 (consulte Tabela de Materiais).
    2. Selecione apenas leituras de extremidade emparelhada com a leitura 2 começando com a tag LTR "GCCTTGTGTGTGGTAGATCCACAG
      ATCAAGGATATCTTGTCTTCGTTGGGAGTGAAT
      TAGCCCTTCCA".
      NOTA: Essa sequência depende da sequência do vetor usado para gerar a biblioteca de células de mutagênese insercional.
    3. Corte a sequência de tags LTR das leituras selecionadas na etapa 3.1.2.
    4. Alinhe as leituras cortadas ao GRCh37/hg19 usando BWA-MEM 34 (consulte Tabela de materiais) com as configurações padrão.
    5. Reter apenas pares de leitura em que a leitura 1 e a leitura 2 são mapeadas exclusivamente para o genoma com configuração e espaçamento corretos, indicados por FLAG 147 e FLAG 163.
    6. Defina a posição de inserção como a primeira base alinhada da leitura aparada 2.
    7. Normalize as contagens de leitura em cada local de inserção exclusivo para o número total de leituras alinhadas exclusivamente em cada amostra.
  2. Identificação de inserções que afetam a aptidão celular (IACFs)
    NOTA: Na análise estatística, é aconselhável realizar comparações pareadas entre as três réplicas biológicas das amostras controle e tratadas para identificar posições significativamente enriquecidas ou esgotadas. O número de réplicas mencionado acima é mínimo. Recomenda-se usar o maior número possível de réplicas para garantir a confiabilidade e precisão dos resultados.
    1. Converta as contagens de leitura normalizadas de cada posição em registrar10 valores.
    2. Defina os valores logarítmicos10 das posições com zero lido como −5.
    3. Execute o teste t de Student pareado bilateral nos valores de log10.
    4. Ajuste os valores de p para comparações múltiplas usando o método de Benjamini-Hochberg no ambiente R.
    5. Selecione posições com um limite de Taxa de Descoberta Falsa (FDR) de 25% como IACFs.
  3. Identificação de clusters que afetam a aptidão celular (CACFs)
    NOTA: Três réplicas biológicas de amostras controle e tratadas foram recomendadas para esta análise.
    1. Identifique os clusters de inserção significativamente enriquecidos ou esgotados entre as amostras de controle e tratadas usando SICER35 (ver Tabela de Materiais) com um limite de FDR de 1%. O comando para análise SICER é "sh $SICER/SICER.sh $InputDir $In $Control $OutputDir hg19 1 10 1 0.8 30 0.01".
      NOTA: Os significados dos parâmetros no comando acima são os seguintes: ["InputDir"] ["arquivo de leito de locais de inserção de amostra tratada"] ["arquivo de leito de locais de inserção de amostra de controle"] ["OutputDir"] ["espécie"] ["limite de redundância"] ["tamanho da janela (bp)"] ["tamanho do fragmento"] ["fração efetiva do genoma"] ["tamanho da lacuna (bp)"] ["E-value"].
    2. Obtenha regiões de cluster compartilhadas por pelo menos duas réplicas biológicas com a função de "interseção" do BEDTools suite36 (consulte a Tabela de Materiais) e denote essas regiões de cluster como CACFs.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A avaliação do controle de qualidade de uma biblioteca NGS, normalmente realizada pelo provedor de sequenciamento, serve como a verificação de qualidade padrão antes do sequenciamento. Para demonstrar o impacto da qualidade da biblioteca, duas amostras foram comparadas. A biblioteca de alta qualidade, rotulada s2-20-15, foi preparada usando o protocolo padrão de PCR aninhado, consistindo em duas etapas de amplificação sequencial: a primeira com 20 ciclos, seguida pela segunda com 15 ciclos. Em contraste, a biblioteca de ...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na análise genética avançada, a caminhada do genoma é essencial para traçar o perfil dos locais de integração em bibliotecas de células de mutagênese insercional. Métodos clássicos de caminhada do genoma, como I-PCR e LAM-PCR, geralmente requerem digestão e ligação enzimática de restrição, o que pode reduzir a complexidade da biblioteca e introduzir vieses devido à dependência do local da enzima 27,28,29. O método InSET supera e...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm divulgações.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.X. é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32000441), pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (2023J01130), pelos Fundos de Pesquisa Fundamental das Universidades Centrais da Universidade de Huaqiao (ZQN-924) e pelos Fundos de Pesquisa Científica da Universidade de Huaqiao (18BS205). P.K. é apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32170619), pelo Fundo de Pesquisa para Cientistas Seniores Internacionais da National Natural Fundação de Ciências da China (32150710525) e Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian, China (2020J02006).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,5 M EDTAInvitrogenAM9260GPara fazer Buffer de Ligação/Lavagem
1 M Tris-HCl (Ph 8,0)Invitrogen15568025Para fazer Buffer de Ligação/Lavagem
10× Klenow Fragment Buffer Takara2140A
10&vezes; Taq BufferTiangenET101-01-01
5 M NaClInvitrogenAM9659Para fazer Binding / Wash Buffer
BeaverBeads StreptavidinBeaver22307-11 μ m
Software BEDTools, v2https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/
Software BWA-MEM, v0.7.12
dNTP MisturaTakara40302.5 mM cada
Equalbit dsDNA HS Kit de EnsaioVazymeEQ111-02
fastpSoftware
HiSeq X TenIlluminaPlataforma SY-412-1001Illumina, terceirizada para Novogene Corporation (Pequim)
Klenow FragmentTakara2140A
NovaSeq 6000Illumina20012850plataforma Illumina, terceirizada para Novogene Corporation (Pequim)
Qubit 3.0 FluorômetroThermoFisher ScientificQ33216
SICERSoftware, v1.1
Taq DNA PolimeraseTiangenET101-01-01
Tween-20HuShi30189328Para fazer Ligação/Wash Buffer
UltraPure Água DestiladaInvitrogen10977015
VAHTS DNA Clean BeadsVazymeN411-01

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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