Detecção de Autoanticorpos Anti-MDA5 Utilizando Células HeLa e Imunocitoquímica com Microscopia de Luz

As miopatias inflamatórias idiopáticas (MII), comumente chamadas de miosite, são um grupo heterogêneo de doenças autoimunes caracterizadas por inflamação muscular crônica, manifestações clínicas variáveis e diversos resultados terapêuticos. Os sintomas comuns incluem fraqueza muscular, resistência reduzida e mialgia¹. Os subtipos primários de MII incluem polimiosite (PM) e dermatomiosite (DM), enquanto a dermatomiosite clinicamente amiopática (CADM) se distingue por erupções cutâneas características semelhantes às observadas no DM, mas com envolvimento muscular mínimo ou inexistente. Uma das principais complicações do MP, DM e DAC é a doença pulmonar intersticial (DPI), que afeta aproximadamente 40% dos pacientes e está associada ao aumento da mortalidade².

O curso clínico e o prognóstico da DPI na MII variam amplamente. A DPI associada ao DM e à DCM (DM-/CADM-DPI) tende a ser mais resistente ao tratamento e apresenta um pior prognóstico em comparação com a DPI associada ao MP. Entre elas, a DPI aguda ou subaguda, que progride rapidamente em três meses³, é particularmente grave, com uma taxa de sobrevida relatada em cinco anos de apenas 52%, em comparação com 87% para a DPI crônica, que progride lentamente ou permanece estável. A DPI rapidamente progressiva (DPI-RP), um subtipo de DPI aguda/subaguda, é caracterizada por um rápido início de dispneia e extenso dano alveolar visível na imagem do tórax. A DPI-FR é uma condição com risco de vida e mau prognóstico, ressaltando a necessidade urgente de diagnóstico precoce e intervenção imediata para melhorar os resultados dos pacientes ^4,5,6.

Os autoanticorpos específicos para miosite (MSAs) surgiram como biomarcadores críticos na DPI associada à miosite, com os autoanticorpos anti-MDA5 desempenhando um papel particularmente significativo. Esses autoanticorpos são freqüentemente detectados em pacientes com DPI PM-/DM-/CADM e servem como importantes indicadores prognósticos para DPI-FR7,8,9. MDA5 (gene 5 associado à diferenciação do melanoma) é um receptor de reconhecimento de padrão citosólico codificado por um gene induzível por interferon que detecta RNA de fita dupla viral e mitocondrial, iniciando respostas imunes mediadas por interferon¹⁰. Embora os mecanismos patogênicos precisos permaneçam obscuros, acredita-se que os autoanticorpos anti-MDA5 interrompam a função do MDA5, contribuindo assim para a patogênese autoimune.

A detecção oportuna de autoanticorpos anti-MDA5 é essencial para a identificação e o manejo precoces da DPI-RP. Tradicionalmente, a imunoprecipitação radiomarcada (IP) usando ³⁵extratos de células K562 marcados com S-metionina tem sido considerada o padrão-ouro para detectar autoanticorpos anti-MDA5¹¹. No entanto, esse método é impraticável para uso clínico de rotina devido ao seu alto custo, dependência de equipamentos especializados e pessoal treinado, regulamentos rígidos de descarte de resíduos radioativos e vida útil limitada dos reagentes radiomarcados. Na prática clínica, os ensaios de blot são comumente empregados como alternativas; no entanto, eles estão associados a uma alta taxa de falso-positivos para autoanticorpos anti-MDA5 ^12,13, levantando preocupações sobre a precisão diagnóstica. Consequentemente, há uma necessidade urgente de um ensaio confirmatório confiável e não radioativo para validar resultados positivos e melhorar a confiança no diagnóstico.

Para preencher essa lacuna, propomos o uso da imunocitoquímica (ICC) como teste confirmatório suplementar para autoanticorpos anti-MDA5. Essa abordagem envolve a transfecção de células HeLa com uma construção MDA5, incubação das células com plasma do paciente e detecção de autoanticorpos anti-MDA5 ligados usando anticorpos secundários conjugados com enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano) combinados com um substrato cromogênico para visualização sob microscopia de luz. O ICC fornece uma plataforma não radioativa, altamente sensível e padronizada para visualizar autoanticorpos anti-MDA5 dentro dos compartimentos celulares. Ao integrar o ICC com o ensaio blot, esse método visa reduzir as taxas de falsos positivos, melhorar a precisão do diagnóstico e, por fim, melhorar o gerenciamento clínico e os resultados para os pacientes.

O objetivo deste estudo é estabelecer um protocolo robusto e não radioativo para a detecção de autoanticorpos anti-MDA5, abordando as limitações dos métodos de detecção atuais e oferecendo aos médicos uma ferramenta prática e confiável para o diagnóstico precoce de DPI-RP em pacientes com PM, DM e CADM. Na narração do vídeo que acompanha, esse curso com risco de vida é coloquialmente descrito como 'morte rápida'; cientificamente, corresponde a DPI rapidamente progressiva (DPI-RP). Este trabalho baseia-se nas evidências existentes e tem o potencial de melhorar significativamente a avaliação prognóstica e a tomada de decisão terapêutica na prática clínica.

1. Cultura celular e transfecção

1. Mantenha as células HeLa com o meio Eagle modificado de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO₂ .
2. Passe as células a cada 2-3 dias ou quando as células atingirem 90%-100% de confluência.
3. Semeie 7 × 10⁴ células HeLa em cada poço de uma placa de 24 poços (1,9 cm² / poço) 24 h antes da transfecção para permitir que as células atinjam aproximadamente 90% de confluência.
4. Diluir 500 ng de plasmídeo (pENTER-MDA5) e 1,5 μL de reagente de transfecção cada um em 25 μL de meio de soro reduzido.
5. Adicione DNA diluído ao reagente de transfecção diluído (proporção de 1:1). Misture bem e incube por 5 min.
6. Adicione a mistura às células semeadas um dia antes e agite para misturar o complexo DNA-lipídio imediatamente. Confirme se as células são 80% -90% confluentes.
7. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO₂ a 5% por 24 h e proceder à realização do ICC.
   NOTA: Usamos um vetor disponível comercialmente (pEnter-MDA5); mais informações podem ser encontradas na Tabela de Materiais. A eficácia da transfecção é de ~ 50%.
   O sucesso da transfecção e expressão da proteína-alvo pode ser determinado pela transfecção das células com um plasmídeo que expressa a proteína fluorescente e pela realização de um Western blot para visualizar a expressão da proteína-alvo.

2. Fixação celular

1. Após a incubação, lave as células 2x com PBS para remover qualquer meio restante.
   NOTA: A lavagem pode ser realizada agitando a placa em um agitador orbital.
2. Fixe as células em paraformaldeído a 4% em PBS. Deixe as células por 15 min em temperatura ambiente.
   CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico. Use diretrizes de manuseio apropriadas.
3. Aspire o reagente fixador e use PBS para lavar as células 2x.

3. Permeabilização celular

1. Adicione o reagente Triton X-100 (0,3% em PBS) e deixe as células descansarem por 10 minutos em temperatura ambiente.
2. Após 10 min, descarte o detergente.
3. Adicione PBS para lavar as células uma vez.

4. Bloqueio celular

1. Realizar bloqueio com soro fetal bovino a 10% em PBS (1x) e incubar as células por 1 h em temperatura ambiente.
2. Remova o reagente de bloqueio e adicione PBS para lavar as células uma vez.

5. Hibridização do anticorpo do paciente

1. Adicione o plasma diluído do paciente às células. Certifique-se de diluir a amostra do paciente (diluição de 1:5.000 em PBS) em PBS antes de usar.
   NOTA: Ajuste a diluição para aumentar o sinal ou reduzir o fundo conforme necessário. Para garantir resultados imparciais, a equipe que conduzia os testes não tinha conhecimento de quais amostras pertenciam aos pacientes e quais eram de indivíduos saudáveis.
2. Incubar a amostra a 4 °C durante 12-16 h (durante a noite).
3. Após o período de incubação, remova a amostra do paciente e lave as células 3x com PBS.

6. Hibridização de anticorpos secundários

1. Trate as células com IgG anti-humana de cabra conjugada com peroxidase de rábano diluída (diluição de 1:250 em PBS) e deixe as células por 1 h em temperatura ambiente.
2. Uma hora depois, descarte os anticorpos secundários.
3. Enxágüe com PBS 3x.

7. Coloração celular

1. Depois de lavar as células, core-as com 300 μL de solução/poço de trabalho DAB.
   NOTA: Esta solução foi preparada misturando concentrado de cromogênio DAB e diluente DAB de acordo com as instruções do fabricante.
2. Depois de manchar as células por 5 min, remova o corante, enxágue com água destilada deionizada e agite por 5 min.

8. Contracoloração celular

1. Contra-core o núcleo da célula com hematoxilina diluída.
   NOTA: Usamos Hematoxilina Gill II em uma diluição de 10 vezes e aguardamos 5 min para o processo de coloração.
2. Após 5 min, descarte a hematoxilina e lave com água destilada deionizada por 2 x 5 min.

9. Observação

1. Observe os resultados da coloração usando um microscópio óptico.
   NOTA: Um verdadeiro positivo mostra forte coloração marrom dentro das células HeLa expressando MDA5; isso confirma os autoanticorpos anti-MDA5 na amostra do paciente. Um resultado negativo mostra células HeLa sem coloração marrom, indicando que não há autoanticorpos anti-MDA5. Um resultado falso-positivo mostra extensa coloração marrom em todas as células, independentemente da expressão de MDA5. Essa coloração inespecífica, observada em outras condições autoimunes, deve ser diferenciada de um verdadeiro positivo para evitar erros de diagnóstico.

O pessoal que conduziu os testes foi cego para as identidades das amostras, incluindo os pacientes específicos dos quais foram obtidos, para minimizar possíveis vieses no processo de avaliação. No entanto, embora as amostras de controle saudáveis não tenham sido submetidas ao cegamento, elas produziram consistentemente resultados claros e inequívocos.

A Figura 1A demonstra a expressão bem-sucedida de MDA5 em células HeLa transfectadas com a construção pENTER-MDA5. Para validar a eficiência da transfecção, o ICC foi realizado usando um anticorpo anti-MDA5 comercial. Forte coloração citoplasmática marrom foi observada em aproximadamente 50% das células transfectadas, indicando expressão robusta da proteína MDA5. Em contraste, as células não transfectadas processadas em condições idênticas não mostraram coloração citoplasmática, confirmando a especificidade do anticorpo e a ausência de expressão endógena de MDA5.

Seguindo o protocolo ICC, amostras representativas de pacientes anti-MDA5-positivos, confirmadas por imunoprecipitação radiomarcada, demonstraram coloração citoplasmática marrom clara em células HeLa que expressam MDA5, enquanto as células não transfectadas permaneceram não coradas (Figura 1B). Esse padrão de coloração indica a presença de autoanticorpos anti-MDA5 no plasma do paciente e se alinha com a detecção padrão-ouro estabelecida usando 35extratos de células K562 marcados com S-metionina.

As características dos pacientes estão resumidas na Tabela SuplementarS1, que descreve os diagnósticos clínicos, o status do anticorpo anti-MDA5 e a classificação em três grupos: anti-MDA5-positivo, falso-positivo e controle saudável. Além do status de anticorpos, a Tabela Suplementar S1 agora também resume os dados demográficos do paciente, incluindo idade, sexo e diagnóstico subjacente para cada coorte. A reatividade do anticorpo foi classificada semiquantitativamente como fraca (1+), moderada (2+) ou forte (3+) com base na intensidade da banda, refletindo níveis crescentes de anticorpos. Isso fornece contexto clínico para interpretar os resultados do CCI, mantendo o foco metodológico primário do presente estudo. A coorte do estudo incluiu 10 pacientes com autoanticorpos anti-MDA5 confirmados (grupo positivo), cinco pacientes com doenças autoimunes que produziram resultados falso-positivos por teste comercial de blot (grupo falso-positivo) e 10 indivíduos saudáveis (grupo controle saudável). Cada amostra foi testada juntamente com controles positivos e negativos e verificada independentemente usando imunoprecipitação radiomarcada. Para amostras com resultados de coloração claros e conclusivos, uma única corrida de ICC foi considerada suficiente. Nos casos em que a coloração era ambígua ou limítrofe, testes adicionais foram realizados, incluindo diluições seriadas e ensaios ICC replicados, para garantir uma interpretação precisa. Essa abordagem garantiu rigor metodológico e eficiência de recursos na validação do desempenho do método de detecção baseado em ICC.

Os resultados falso-positivos são ilustrados na Figura 2. Nessas amostras, foi utilizado plasma de pacientes com doenças autoimunes que não miopatias inflamatórias idiopáticas (MII). Ao contrário da Figura 1, a coloração citoplasmática marrom foi observada extensivamente em todas as células, independentemente do status de expressão de MDA5. Esse padrão de coloração indica ligação inespecífica e destaca o potencial de falsos positivos em amostras de pacientes com outras condições autoimunes. Os resultados negativos são apresentados na Figura 3, onde o plasma de indivíduos saudáveis foi testado. Praticamente nenhuma coloração citoplasmática marrom foi observada em células HeLa transfectadas ou não transfectadas, indicando a ausência de autoanticorpos anti-MDA5 nessas amostras.

Figura 1: Validação da expressão de MDA5 e detecção de autoanticorpos anti-MDA5 usando ICC. (A) As células HeLa transfectadas com um plasmídeo que expressa MDA5 foram coradas usando um anticorpo anti-MDA5 comercial. Foi observada forte coloração citoplasmática marrom, indicando expressão robusta da proteína MDA5. Em contraste, as células não transfectadas processadas em condições idênticas não exibiram coloração, confirmando a especificidade do anticorpo e a ausência de expressão endógena de MDA5. (B) As células HeLa transfectadas com MDA5 foram incubadas com plasma de pacientes confirmados como anti-MDA5 positivos por imunoprecipitação radiomarcada. Foi observada coloração marrom citoplasmática clara, demonstrando a presença de autoanticorpos anti-MDA5 na amostra do paciente. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: ICC = imunocitoquímica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Detecção de sinais falso-positivos usando plasma de pacientes com doenças autoimunes diferentes da MII. Coloração citoplasmática marrom generalizada foi observada em células transfectadas e não transfectadas, sugerindo ligação de anticorpos não específica. Esses resultados ilustram o potencial de detecção de falso-positivos em ensaios de line blot ao usar plasma de pacientes com doenças autoimunes não relacionadas a pacientes com IIM anti-MDA5-positivo. Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: IIM = miopatias inflamatórias idiopáticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resultados negativos de coloração com plasma de indivíduos de controle saudáveis. As células HeLa transfectadas com MDA5 e incubadas com plasma de indivíduos saudáveis mostraram pouca ou nenhuma coloração citoplasmática marrom. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar S1: Características do paciente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores não têm interesses conflitantes a declarar.

Partes deste manuscrito foram geradas com a ajuda do GPT-4 da OpenAI. Os autores revisaram e editaram o conteúdo para garantir precisão e originalidade.