Artigo de método

Detecção de Autoanticorpos Anti-MDA5 Utilizando Células HeLa e Imunocitoquímica com Microscopia de Luz

DOI:

10.3791/67575

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31 de outubro de 2025

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1Graduate Institute of Biomedical Sciences, China Medical University, 2College of Medicine, China Medical University, 3Rheumatology and Immunology Center, China Medical University Hospital, 4Rheumatic Diseases Research Center, China Medical University Hospital, 5Drug Development Center, China Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Fornecemos uma metodologia de imunocitoquímica (ICC) passo a passo para detectar anti-MDA5. Essa abordagem envolve fixação celular, permeabilização, incubação de anticorpos e técnicas de imagem, que permitem a detecção precisa de autoanticorpos anti-MDA5, auxiliando no diagnóstico de doença pulmonar intersticial de rápida progressão em pacientes com miosite.

Resumo

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Os autoanticorpos anti-MDA5 são biomarcadores críticos para dermatomiosite (DM), dermatomiosite amiopática (CADM) e polimiosite (PM), particularmente na identificação de pacientes em risco de doença pulmonar intersticial rapidamente progressiva (DPI-RP). A detecção precoce desses autoanticorpos é essencial para melhorar os resultados dos pacientes, pois o diagnóstico tardio geralmente leva a prognósticos ruins. Atualmente, o radioimunoensaio é o padrão-ouro para detecção de anti-MDA5, mas seu uso é limitado por altos custos, procedimentos demorados e necessidade de conhecimento especializado. Além disso, o teste de blot, uma ferramenta clínica amplamente utilizada, exibe uma alta taxa de falso-positivos para autoanticorpos MDA5, potencialmente comprometendo a precisão diagnóstica. Para lidar com essas limitações, propomos um método de teste confirmatório não radioativo, altamente sensível e padronizado usando Imunocitoquímica (ICC). Este protocolo envolve o tratamento de células HeLa com uma construção MDA5, permeabilização das células com Triton X-100 para facilitar a ligação de autoanticorpos anti-MDA5 primários e detecção de anticorpos ligados usando anticorpos secundários conjugados com enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano) com cromogênio DAB para imagens de microscopia. O ICC oferece uma abordagem prática, econômica e de alta sensibilidade para visualizar autoanticorpos anti-MDA5 em estruturas celulares. Ao integrar o ICC como um procedimento confirmatório suplementar, este estudo visa aumentar a confiabilidade da detecção de anti-MDA5, melhorando assim as estratégias diagnósticas e prognósticas para DPI-RP em pacientes com DM, CADM e PM.

Introdução

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As miopatias inflamatórias idiopáticas (MII), comumente chamadas de miosite, são um grupo heterogêneo de doenças autoimunes caracterizadas por inflamação muscular crônica, manifestações clínicas variáveis e diversos resultados terapêuticos. Os sintomas comuns incluem fraqueza muscular, resistência reduzida e mialgia1. Os subtipos primários de MII incluem polimiosite (PM) e dermatomiosite (DM), enquanto a dermatomiosite clinicamente amiopática (CADM) se distingue por erupções cutâneas características semelhantes às observadas no DM, mas com envolvimento muscular mínimo ou inexistente. Uma das principais complicações do MP, DM e DAC é a doença pulmonar intersticial (DPI), que afeta aproximadamente 40% dos pacientes e está associada ao aumento da mortalidade2.

O curso clínico e o prognóstico da DPI na MII variam amplamente. A DPI associada ao DM e à DCM (DM-/CADM-DPI) tende a ser mais resistente ao tratamento e apresenta um pior prognóstico em comparação com a DPI associada ao MP. Entre elas, a DPI aguda ou subaguda, que progride rapidamente em três meses3, é particularmente grave, com uma taxa de sobrevida relatada em cinco anos de apenas 52%, em comparação com 87% para a DPI crônica, que progride lentamente ou permanece estável. A DPI rapidamente progressiva (DPI-RP), um subtipo de DPI aguda/subaguda, é caracterizada por um rápido início de dispneia e extenso dano alveolar visível na imagem do tórax. A DPI-FR é uma condição com risco de vida e mau prognóstico, ressaltando a necessidade urgente de diagnóstico precoce e intervenção imediata para melhorar os resultados dos pacientes 4,5,6.

Os autoanticorpos específicos para miosite (MSAs) surgiram como biomarcadores críticos na DPI associada à miosite, com os autoanticorpos anti-MDA5 desempenhando um papel particularmente significativo. Esses autoanticorpos são freqüentemente detectados em pacientes com DPI PM-/DM-/CADM e servem como importantes indicadores prognósticos para DPI-FR7,8,9. MDA5 (gene 5 associado à diferenciação do melanoma) é um receptor de reconhecimento de padrão citosólico codificado por um gene induzível por interferon que detecta RNA de fita dupla viral e mitocondrial, iniciando respostas imunes mediadas por interferon10. Embora os mecanismos patogênicos precisos permaneçam obscuros, acredita-se que os autoanticorpos anti-MDA5 interrompam a função do MDA5, contribuindo assim para a patogênese autoimune.

A detecção oportuna de autoanticorpos anti-MDA5 é essencial para a identificação e o manejo precoces da DPI-RP. Tradicionalmente, a imunoprecipitação radiomarcada (IP) usando 35extratos de células K562 marcados com S-metionina tem sido considerada o padrão-ouro para detectar autoanticorpos anti-MDA511. No entanto, esse método é impraticável para uso clínico de rotina devido ao seu alto custo, dependência de equipamentos especializados e pessoal treinado, regulamentos rígidos de descarte de resíduos radioativos e vida útil limitada dos reagentes radiomarcados. Na prática clínica, os ensaios de blot são comumente empregados como alternativas; no entanto, eles estão associados a uma alta taxa de falso-positivos para autoanticorpos anti-MDA5 12,13, levantando preocupações sobre a precisão diagnóstica. Consequentemente, há uma necessidade urgente de um ensaio confirmatório confiável e não radioativo para validar resultados positivos e melhorar a confiança no diagnóstico.

Para preencher essa lacuna, propomos o uso da imunocitoquímica (ICC) como teste confirmatório suplementar para autoanticorpos anti-MDA5. Essa abordagem envolve a transfecção de células HeLa com uma construção MDA5, incubação das células com plasma do paciente e detecção de autoanticorpos anti-MDA5 ligados usando anticorpos secundários conjugados com enzimas (por exemplo, peroxidase de rábano) combinados com um substrato cromogênico para visualização sob microscopia de luz. O ICC fornece uma plataforma não radioativa, altamente sensível e padronizada para visualizar autoanticorpos anti-MDA5 dentro dos compartimentos celulares. Ao integrar o ICC com o ensaio blot, esse método visa reduzir as taxas de falsos positivos, melhorar a precisão do diagnóstico e, por fim, melhorar o gerenciamento clínico e os resultados para os pacientes.

O objetivo deste estudo é estabelecer um protocolo robusto e não radioativo para a detecção de autoanticorpos anti-MDA5, abordando as limitações dos métodos de detecção atuais e oferecendo aos médicos uma ferramenta prática e confiável para o diagnóstico precoce de DPI-RP em pacientes com PM, DM e CADM. Na narração do vídeo que acompanha, esse curso com risco de vida é coloquialmente descrito como 'morte rápida'; cientificamente, corresponde a DPI rapidamente progressiva (DPI-RP). Este trabalho baseia-se nas evidências existentes e tem o potencial de melhorar significativamente a avaliação prognóstica e a tomada de decisão terapêutica na prática clínica.

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Protocolo

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1. Cultura celular e transfecção

  1. Mantenha as células HeLa com o meio Eagle modificado de Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico-antimicótico a 37 ° C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 .
  2. Passe as células a cada 2-3 dias ou quando as células atingirem 90%-100% de confluência.
  3. Semeie 7 × 104 células HeLa em cada poço de uma placa de 24 poços (1,9 cm2 / poço) 24 h antes da transfecção para permitir que as células atinjam aproximadamente 90% de confluência.
  4. Diluir 500 ng de plasmídeo (pENTER-MDA5) e 1,5 μL de reagente de transfecção cada um em 25 μL de meio de soro reduzido.
  5. Adicione DNA diluído ao reagente de transfecção diluído (proporção de 1:1). Misture bem e incube por 5 min.
  6. Adicione a mistura às células semeadas um dia antes e agite para misturar o complexo DNA-lipídio imediatamente. Confirme se as células são 80% -90% confluentes.
  7. Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera umidificada de CO2 a 5% por 24 h e proceder à realização do ICC.
    NOTA: Usamos um vetor disponível comercialmente (pEnter-MDA5); mais informações podem ser encontradas na Tabela de Materiais. A eficácia da transfecção é de ~ 50%.
    O sucesso da transfecção e expressão da proteína-alvo pode ser determinado pela transfecção das células com um plasmídeo que expressa a proteína fluorescente e pela realização de um Western blot para visualizar a expressão da proteína-alvo.

2. Fixação celular

  1. Após a incubação, lave as células 2x com PBS para remover qualquer meio restante.
    NOTA: A lavagem pode ser realizada agitando a placa em um agitador orbital.
  2. Fixe as células em paraformaldeído a 4% em PBS. Deixe as células por 15 min em temperatura ambiente.
    CUIDADO: O paraformaldeído é tóxico. Use diretrizes de manuseio apropriadas.
  3. Aspire o reagente fixador e use PBS para lavar as células 2x.

3. Permeabilização celular

  1. Adicione o reagente Triton X-100 (0,3% em PBS) e deixe as células descansarem por 10 minutos em temperatura ambiente.
  2. Após 10 min, descarte o detergente.
  3. Adicione PBS para lavar as células uma vez.

4. Bloqueio celular

  1. Realizar bloqueio com soro fetal bovino a 10% em PBS (1x) e incubar as células por 1 h em temperatura ambiente.
  2. Remova o reagente de bloqueio e adicione PBS para lavar as células uma vez.

5. Hibridização do anticorpo do paciente

  1. Adicione o plasma diluído do paciente às células. Certifique-se de diluir a amostra do paciente (diluição de 1:5.000 em PBS) em PBS antes de usar.
    NOTA: Ajuste a diluição para aumentar o sinal ou reduzir o fundo conforme necessário. Para garantir resultados imparciais, a equipe que conduzia os testes não tinha conhecimento de quais amostras pertenciam aos pacientes e quais eram de indivíduos saudáveis.
  2. Incubar a amostra a 4 °C durante 12-16 h (durante a noite).
  3. Após o período de incubação, remova a amostra do paciente e lave as células 3x com PBS.

6. Hibridização de anticorpos secundários

  1. Trate as células com IgG anti-humana de cabra conjugada com peroxidase de rábano diluída (diluição de 1:250 em PBS) e deixe as células por 1 h em temperatura ambiente.
  2. Uma hora depois, descarte os anticorpos secundários.
  3. Enxágüe com PBS 3x.

7. Coloração celular

  1. Depois de lavar as células, core-as com 300 μL de solução/poço de trabalho DAB.
    NOTA: Esta solução foi preparada misturando concentrado de cromogênio DAB e diluente DAB de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Depois de manchar as células por 5 min, remova o corante, enxágue com água destilada deionizada e agite por 5 min.

8. Contracoloração celular

  1. Contra-core o núcleo da célula com hematoxilina diluída.
    NOTA: Usamos Hematoxilina Gill II em uma diluição de 10 vezes e aguardamos 5 min para o processo de coloração.
  2. Após 5 min, descarte a hematoxilina e lave com água destilada deionizada por 2 x 5 min.

9. Observação

  1. Observe os resultados da coloração usando um microscópio óptico.
    NOTA: Um verdadeiro positivo mostra forte coloração marrom dentro das células HeLa expressando MDA5; isso confirma os autoanticorpos anti-MDA5 na amostra do paciente. Um resultado negativo mostra células HeLa sem coloração marrom, indicando que não há autoanticorpos anti-MDA5. Um resultado falso-positivo mostra extensa coloração marrom em todas as células, independentemente da expressão de MDA5. Essa coloração inespecífica, observada em outras condições autoimunes, deve ser diferenciada de um verdadeiro positivo para evitar erros de diagnóstico.

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Resultados

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O pessoal que conduziu os testes foi cego para as identidades das amostras, incluindo os pacientes específicos dos quais foram obtidos, para minimizar possíveis vieses no processo de avaliação. No entanto, embora as amostras de controle saudáveis não tenham sido submetidas ao cegamento, elas produziram consistentemente resultados claros e inequívocos.

A Figura 1A demonstra a expressão bem-sucedida d...

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Discussão

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Nossa técnica baseada em ICC para identificar autoanticorpos anti-MDA5 oferece vantagens significativas em relação aos métodos tradicionais, como análise de line blot e radioimunoensaio. Anteriormente, Nombel et al. relataram valores de sensibilidade e especificidade de 96% e 100%, respectivamente, comparando a imunofluorescência indireta (IFI) em células transfectadas com MDA5 com ELISA em uma coorte de 23 pacientes com dermatomiosite anti-MDA5 positiva e 22 controles anti-MDA5 negativo...

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Divulgações

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Os autores não têm interesses conflitantes a declarar.

Partes deste manuscrito foram geradas com a ajuda do GPT-4 da OpenAI. Os autores revisaram e editaram o conteúdo para garantir precisão e originalidade.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por doações do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia de Taiwan concedidas a Jye-Lin Hsu (NSTC 114-2320-B-039-038 e NSTC 113-2320-B-039-032). Este estudo também foi apoiado em parte por bolsas da Universidade Médica e Hospital da China concedidas a Jye-Lin Hsu (CMU113-MF-89 e C1110812016-12).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placas de 24 poços (1,9 cm²/poço)Corning354541
Antimicoótico antibióticoGibco15240062
CoposPYREX1000-600
Tubos cônicos (15 mL)Corning430052
Tubos cônicos (50 mL)Corning430290
Água destilada desionizadaNossa água destilada deionizada é produzida internamente usando um sistema Milli-Q (Coluna 1: Quantum TEX, SN: F4EB53476; Coluna 2: Prepak, SN: F1CB11442)
Caracterizado pelo Soro Bovino FetalCytivaSH30396.03
cilindros graduados (50 mL)VITLAB64804
Hematoxilina Gill IILeica3801522
Hyclone Dulbecco' s Eagle Medium Modificado com glicose altaCytivaSH30243.02
Reagente de transfecção Lipofectamin 2000Invitrogen11668019Reagente de transfecção
MDA-5 (D74E4) Coelho mAbTecnologia de Sinalização Celular5321
Tubos microcentrífugas (tubos Eppendorf de 1,5 mL)AXYGEN142503
Meio sérico reduzido Opti-MEM IGibco31985070
Agitador orbital (opcional)FIRSTEKS300R
ParaformaldeídoSigma-Aldrich4% em PBS 1x
PBSPRO TECHME222605
pENTER-MDA5Vigene Biosciences Inc.CH863586
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Human IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch109-035-003
Controlador de pipetaTermo Científica130165
Pipettes GILSON
Pipetas e pontas de pipeta (10 & micro; L)QSP104-Q
Pipetas e pontas de pipeta (200 & micro; L)QSPT090-Q
Pipetas e pontas de pipeta (1000 & micro; L)QSP111-Q
Pipetas sorológicas (5 mL)SPL91005
Pipetas sorológicas (10 mL)SPL91010
Pipetas sorológicas (25 mL)SPL91025
Kit de substrato DAB SignalStainSinalização celular80590,3% no PBS

Referências

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