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Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados para estudos da função gênica

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DOI:

10.3791/67598

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29 de novembro de 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Therapies Dresden, TUD Dresden University of Technology

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos a manipulação genética aguda de organoides corticais humanos fatiados por eletroporação. Esses modelos organoides corticais são particularmente passíveis de injeção, pois estruturas semelhantes a ventrículos podem ser prontamente identificadas após o corte, permitindo a investigação funcional do desenvolvimento cortical humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução cortical.

Resumo

Os organoides corticais humanos tornaram-se ferramentas importantes para estudar o desenvolvimento do cérebro humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução do cérebro humano. Estudos que analisam a função gênica por superexpressão ou nocaute têm sido fundamentais em modelos animais para fornecer insights mecanicistas sobre a regulação do desenvolvimento do neocórtex. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para nocaute agudo de genes mediado por CRISPR/Cas9 por eletroporação de organoides corticais humanos fatiados. O corte de organoides corticais auxilia na identificação de estruturas semelhantes a ventrículos para injeção e subsequente eletroporação, tornando este um modelo particularmente adequado para manipulação genética aguda durante o desenvolvimento cortical humano. Descrevemos o desenho de RNAs guia e a validação da eficiência de direcionamento in vitro e em organoides corticais. A eletroporação de organoides corticais é realizada em estágios neurogênicos intermediários, permitindo o direcionamento da maioria das principais classes de células no neocórtex em desenvolvimento, incluindo glia radial apical, células progenitoras basais e neurônios. Em conjunto, a eletroporação de organoides corticais humanos fatiados representa uma técnica poderosa para investigar a função gênica, a regulação gênica e a morfologia celular durante o desenvolvimento cortical.

Introdução

O neocórtex refere-se à cobertura externa dos hemisférios cerebrais e é uma estrutura exclusiva dos mamíferos. O neocórtex representa a sede das funções cognitivas superiores 1,2,3,4,5. Durante o desenvolvimento, as células-tronco neurais e progenitoras dão origem aos neurônios em um processo denominado neurogênese. Estudos funcionais que investigam o desenvolvimento do neocórtex humano fornecem a base para elucidar os mecanismos subjacentes à regulação das células-tronco neurais humanas, patologias neurais e evolução do cérebro humano 2,6,7.

Historicamente, os estudos do desenvolvimento do cérebro humano dependiam de abordagens histológicas descritivas usando tecido post-mortem, com sistemas de cultura de tecidos flutuantes mais recentes permitindo investigações funcionais com tecido fetal humano 8,9. Além disso, o tecido cerebral fetal humano demonstrou ter a capacidade de se auto-organizar em organoides em expansão de longo prazo10. A pesquisa de tecidos fetais forneceu informações importantes sobre o desenvolvimento humano11,12, mas a disponibilidade restrita de tecidos e considerações éticas limitam sua aplicação generalizada para estudos mecanicistas do desenvolvimento do cérebro humano. Na última década, foram desenvolvidos protocolos que permitem a geração de organoides neurais tridimensionais a partir de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC), incluindo PSC induzida por humanos (hiPSC)13,14.

Os organoides cerebrais exibem características importantes do cérebro em desenvolvimento, como a formação de estruturas semelhantes a ventrículos, polaridade apicobasal, citoarquitetura cortical, migração nuclear intercinética durante a divisão da glia radial e migração neuronal. É importante ressaltar que esses novos modelos organoides humanos recapitulam características do cérebro humano em desenvolvimento que não são bem modeladas no camundongo, incluindo os principais tipos de progenitores neurais evolutivamente relevantes, em particular a glia radial basal (ou glia radial externa) 7 , 14 , 15 . Várias limitações dos primeiros protocolos organoides cerebrais - como problemas com heterogeneidade organoide, suprimento limitado de nutrientes para o núcleo interno e identidade regional variada - foram abordadas nos avanços recentes do protocolo e melhorias adicionais podem ser esperadas nos próximos anos 15,16,17,18,19. Os organoides cerebrais e corticais humanos rapidamente se tornaram modelos-chave para estudar o desenvolvimento cortical humano20, distúrbios neurológicos 21,22,23,24 e evolução cerebral 25,26,27,28,29, e para realizar abordagens de triagem em larga escala 30,31,32.

Para manipulação genética aguda, dois métodos têm sido usados principalmente em modelos animais de desenvolvimento do neocórtex: entrega viral por infecção de células-alvo33 e eletroporação in utero ou in vitro 34,35. A injeção de DNA - e, mais recentemente, de complexos de ribonucleoproteína (RNP) CRISPR / Cas936 - nos ventrículos laterais, seguida de eletroporação, oferece a vantagem de que regiões específicas do cérebro podem ser direcionadas com base na orientação dos eletrodos de eletroporação. A eletroporação envolve breves pulsos elétricos que aumentam temporariamente a permeabilidade da membrana celular, permitindo a introdução de DNA e outras moléculas carregadas nas células. A eletroporação in utero foi realizada pela primeira vez no camundongo37, onde rapidamente se tornou uma metodologia amplamente aplicada para a neurobiologia do desenvolvimento. Posteriormente, o método também foi aplicado a outras espécies, como o rato 38,39 e o furão 40,41,42, espécie girencefálica utilizada para estudar a expansão do neocórtex e o dobramento cortical 3,43,44,45.

A eletroporação também se tornou um método importante na pesquisa de organoides do cérebro humano46. Em organoides cerebrais, a eletroporação tem sido aplicada para visualizar a morfologia celular e os axônios neuronais14,47, para fornecer reagentes de knockdown de genes 22,48,49 e para investigação da função gênica por superexpressão50. O método não se restringe a modelos humanos, mas também tem sido aplicado para modificação genética de organoides cerebrais primatas50,51. Além disso, a eletroporação de organoides corticais gerados em um biorreator giratório Spin Ω foi descrita52.

Neste protocolo, descrevemos a eletroporação de organoides corticais humanos fatiados15 para estudos da função gênica no desenvolvimento cortical. Os organoides específicos da região cerebral aumentam a reprodutibilidade e a consistência, o que é fundamental para o sucesso da análise quantitativa, por exemplo, na modelagem de doenças. No protocolo organoide cortical humano fatiado15, pistas de padronização potentes são aplicadas durante a diferenciação de iPSC para obter uma população homogênea de progenitores dorsais do prosencéfalo, que é seguida pela aplicação de meios de cultura que promovem o crescimento do tecido com menos sinais instrutivos 53,54. Foi demonstrado que o corte de organoides corticais reduz a morte celular resultante da redução da disponibilidade de nutrientes e oxigênio no núcleo organoide15. Além disso, o corte suporta o desenvolvimento de estruturas semelhantes a ventrículos contendo glia radial basal abundante, com neurogênese sustentada levando à formação de uma região semelhante a uma placa cortical expandida15. O corte repetido neste protocolo também torna esses organoides corticais particularmente adequados para eletroporação, pois os lúmens do ventrículo podem ser facilmente identificados e direcionados por injeção. A eletroporação de organoides corticais fatiados tem sido aplicada para estudar regiões reguladoras de genes e evolução cortical26,55.

Durante o procedimento de eletroporação, a mistura de injeção é entregue ao lúmen de estruturas semelhantes a ventrículos. Após a aplicação de um campo elétrico pulsado, a mistura é absorvida pela glia radial apical que reveste o ventrículo. À medida que a glia radial apical se divide e dá origem a tipos de células mais comprometidas4, os agentes eletroporados são transmitidos às células progenitoras basais e neurônios. A progênie eletroporada é distribuída na zona ventricular (VZ) e na zona subventricular (SVZ) após 3 dias e abrange a maior parte da parede cortical, incluindo a região semelhante à placa cortical (CP), 7 dias após a eletroporação durante os estágios neurogênicos médios26,55.

Aqui, descrevemos a interrupção do gene mediada por CRISPR / Cas956 por eletroporação em organoides corticais humanos fatiados26. Além disso, o método de eletroporação também pode ser aplicado para superexpressão gênica, visualização da morfologia celular e processos celulares por expressão de proteínas fluorescentes, entrega de bibliotecas de plasmídeos para Massive Parallel Reporter Assays (MPRA), entrega de ferramentas de edição de epigenoma e marcação de células para imagens ao vivo.

Protocolo

Todos os experimentos envolvendo células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) foram realizados de acordo com os padrões éticos descritos na Declaração de Helsinque de 1964 e aprovados pelo Comitê de Revisão Ética do Hospital Universitário de Dresden (IRB00001473; IORG0001076; número de aprovação ética SR-EK-456092021).

1. Desenho de RNAs guia para nocaute agudo de genes mediados por CRISPR/Cas9

  1. Projete um par de RNAs guia (gRNAs) direcionados ao mesmo éxon com uma distância de idealmente 7-11 pb (evitando múltiplos de 3 pb) entre os motivos adjacentes ao protoespaçador (PAMs) para aumentar a probabilidade de ruptura da proteína usando software ou ferramentas online.
    NOTA: Idealmente, os éxons que codificam domínios funcionais devem ser direcionados. Alternativamente, os primeiros éxons do transcrito podem ser escolhidos (Figura 1A). Selecione os RNAs guia com base na pontuação de atividade (próxima a 1)57 e na pontuação de especificidade (próxima a 100%)58.

2. Cultura de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

  1. Para gerar organoides corticais humanos e validar a função do gRNA, use a linha hiPSC CRTDi004-A59 , que é derivada de um doador saudável.
  2. Cultive os iPSCs conforme descrito anteriormente60 em placas de 6 poços revestidas com matriz de membrana basal em meio de células-tronco sob condições padrão (37 ° C, 5% CO2). As CEPs induzidas devem ser passadas a 80% de confluência usando uma enzima para dissociação de célula única com suplementação de inibidor da via ROCK (1:1.000) durante as primeiras 24 h.
    NOTA: Outras linhas iPSC podem ser usadas para geração de organoides e validação de gRNA.

3. Extração de DNA genômico de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

  1. Use 2 poços de 80% -90% de hiPSC confluente de uma placa de 6 poços para extração de DNA genômico. Dissocie as células da placa com uma enzima para fazer uma suspensão unicelular. Pegue as células em 1 mL de meio de células-tronco (volume total), depois gire por 10 min a 600 x g e remova o sobrenadante.
  2. Ressuspenda o pellet celular em 250 μL de tampão de lise (50 mM de TrisHCl (pH 7,5), 100 mM de NaCl, 0,5% de SDS, 5 mM de EDTA em H2O) e 12,5 μL de Proteinase K (estoque de 10 mg / mL). Incubar durante 2 h a 55 °C e 250 rpm.
  3. Misture 100 μL de NaCl 5 mM. Gire por 10 min a 18.000 x g a 4 ° C e transfira o sobrenadante para novos tubos de reação de 1,5 mL.
  4. Adicione 250 μL de isopropanol, inverta os tubos várias vezes e gire por 15 min a 18.000 x g a 4 ° C.
  5. Remova o sobrenadante, lave com 500 μL de EtOH a 70% (grau de biologia molecular), inverta os tubos e gire por 10 min a 18.000 x g a 4 ° C.
  6. Finalmente, remova completamente o sobrenadante pipetando-o cuidadosamente e pressionando os tubos de reação abertos em toalhas de papel.
  7. Deixe o pellet secar ao ar por 10 min em RT e, em seguida, dissolva o pellet em 100 μL de água livre de nuclease por 30 min a 37 °C.
  8. Meça a concentração do DNA com um espectrômetro. O DNA genômico isolado é estável a -20 °C por vários meses.

4. Verificação do reconhecimento do modelo por gRNA (in vitro)

NOTA: Como a primeira abordagem para validar o reconhecimento bem-sucedido do modelo por gRNAs, realize uma reação Cas9 in vitro onde o DNA de fita dupla é clivado em dois fragmentos que podem ser distinguidos por eletroforese em gel de agarose 40,61,62.

  1. Para gerar o molde, execute uma reação em cadeia da polimerase (PCR) com uma mistura mestre de PCR de alta fidelidade e primers de 10 μM no DNA genômico isolado de hiPSC (seção 3) usando as seguintes condições de ciclagem: desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s, 40 ciclos [98 ° C, 10 s; 60 ° C, 30 s; 72 ° C, 1 min] e alongamento final a 72 ° C por 5 min.
    1. Ajuste a temperatura de recozimento de acordo com os primers de PCR. Certifique-se de que o amplicon tenha 800 pb a 1,5 kb de tamanho com localização assimétrica dos locais de ligação do gRNA.
    2. Resolva o produto de PCR por eletroforese em gel em gel de agarose a 1,5%, corte a banda correspondente do gel e extraia o DNA26.
    3. Meça a concentração de DNA do produto de PCR extraído com um espectrômetro.
  2. Monte o gRNA funcional combinando 10 μM de RNA CRISPR (crRNA, sequência personalizada, estoque de 100 μM) e 10 μM de tracrRNA (estoque de 100 μM) em tampão duplex livre de nuclease (volume total de 5 μL). Incubar a mistura durante 5 min a 95 °C e depois deixá-la arrefecer até à temperatura ambiente (RT).
  3. Crie o complexo ribonucleoproteína (RNP) combinando 10 μM do gRNA da etapa 4.2 e 1 μM da enzima Cas9 (de Streptococcus pyogenes, estoque de 62 μM) em PBS por 15 min em RT (25 μL de volume total).
  4. Para realizar a reação de digestão in vitro , misture 1 μM do complexo RNP (da etapa 4.3) com molde de DNA de 0,1 μM (produto de PCR da etapa 4.1) e 1x tampão de reação de nuclease Cas9 (contendo 200 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM MgCl2, 1 mM EDTA; pH 6,5; pode ser armazenado em alíquotas a -20 ° C).
    1. Encha até um volume final de 10 μL com água livre de nuclease.
    2. Incubar a reação a 37 °C durante 1 h.
    3. Adicione 2 mg/mL de proteinase K e incube por mais 10 min a 56 °C para liberar o substrato de DNA da enzima Cas9. Conservar a mistura de reacção digerida a 4 °C ou -20 °C até à análise final.
      NOTA: Recomenda-se o uso de uma proporção molar de 10:1 de substrato Cas9-RNP:DNA para obter a melhor eficiência de clivagem. Diluir o produto da PCR em água isenta de nuclease até à concentração necessária, se necessário. Como controle negativo, uma mistura de reação sem a enzima gRNA ou Cas9 pode ser levada junto.
  5. Visualize produtos clivados por eletroforese em gel de agarose em um gel de agarose a 2%.
    NOTA: Idealmente, duas bandas de tamanhos diferentes devem ser visíveis e a banda modelo deve ter desaparecido ou ser fortemente reduzida para gRNAs eficientes (Figura 1B).

5. Verificação da função do gRNA em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

NOTA: Recomenda-se testar a eficiência dos gRNAs direcionados à mesma linha celular a partir da qual os organoides corticais serão gerados26. Para isso, os complexos RNP contendo os gRNAs relevantes são co-transfectados com um plasmídeo de expressão GFP em hiPSCs, as células são cultivadas por 3 dias e o DNA genômico é posteriormente isolado para análise de sequenciamento. Para cada teste de gRNA, são necessárias cerca de 200.000 células. As células não devem ser mais de 70% -80% confluentes e devem ter sido passadas pelo menos duas vezes após o descongelamento. É importante levar consigo um controle negativo (gLACZ)36,63 e uma condição simulada (solução de nucleofecção sem RNP).

  1. Altere o meio do hiPSC para incluir o inibidor de ROCK (1:1.000) 2 h antes do experimento para aumentar a viabilidade das células em uma capa de cultura de células.
  2. Cubra o número apropriado de poços de uma placa de 6 poços com uma matriz de membrana basal.
  3. Inicie a unidade nucleofectora ("unidade X" para tiras de 16 poços) e selecione o programa "Células ES, H9" como pré-programado (pulso CB150). Selecione o número apropriado de poços da faixa.
  4. Prepare os complexos RNP combinando 24 μM de crRNA e 24 μM de tracrRNA em Duplex Buffer.
    1. Incubar a 95 °C durante 5 min e depois deixar arrefecer até à temperatura de reerguimento, conforme descrito no passo 4.2.
    2. Enquanto isso, diluir a enzima Cas9 a 8 μM em PBS.
    3. Combine 3 μL de gRNA e 3 μL de Cas9 e incube 15 min em RT para montar o RNP.
      NOTA: Uma proporção molar de 3:1 gRNA:Cas9 fornece eficiência de clivagem ideal. Para testar gRNAs como um par, prepare cada RNP separadamente e combine 1,5 μL de cada RNP no final.
  5. Durante a incubação RNP de 15 minutos, prepare o hiPSC para nucleofecção sob uma capa de cultura de células.
    1. Substitua o revestimento da membrana basal por 1,5 mL de meio de células-tronco suplementado com inibidor de ROCK (1:1.000) e 1x Penicilina/Estreptomicina por poço.
    2. Prepare a solução de nucleofecção como uma mistura mestra no gelo, seguindo as instruções do fabricante.
    3. Separar os hiPSCs da placa para fazer uma suspensão de célula única (conforme descrito na secção 2) e contar as células com a coloração com azul de tripano numa câmara de contagem de Neubauer.
    4. Pellet 200.000 células vivas por par de gRNA a 600 x g por 5 min.
  6. Na coifa de cultura de células, em gelo, adicione 3 μL de RNP a 20 μL de solução de nucleofecção mais 0,2 μg/μL de plasmídeo pCAG-GFP.
  7. Ressuspenda as células peletizadas nos 23 μL da mistura final de nucleofecção e transfira-as para 1 poço de uma tira de nucleofecção de 16 poços no gelo.
  8. Quando todas as condições estiverem na tira, coloque-a na unidade X da máquina nucleofetora fora do exaustor e pressione o botão Iniciar para iniciar a nucleofecção.
  9. Posteriormente, transporte a tira de nucleofecção de volta sob a capa de cultura de células e transfira as células nucleofectadas para a placa preparada de 6 poços, enxaguando os poços com algum meio da placa.
  10. Cultive o hiPSC por 3 dias, trocando de meio contendo 1x Penicilina/Estreptomicina diariamente. Após 24 h, o inibidor de ROCK não é mais necessário.
  11. Verifique o sinal GFP sob um microscópio fluorescente convencional (Figura 1C).
    1. No dia 3, classifique e colete células GFP-positivas por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).
    2. Preparar o tampão de triagem com 2% de FBS em PBS e manter a 4 °C.
    3. Arrefecer uma centrifugadora de mesa até 4 °C. Prepare tubos de reação de 1,5 mL com tampão de classificação de 50 μL contendo inibidor de ROCK (1:1.000) para coleta de células após FACS em gelo e tubos de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com tampas de filtro de células em gelo.
    4. Faça suspensões unicelulares das células nucleofecadas.
    5. Ressuspenda as células em 1 mL de meio de células-tronco contendo inibidor de ROCK (1:1.000) por amostra e centrifugue a 600 x g por 5 min.
    6. Remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 200 μL de tampão de classificação com inibidor de ROCK (1:1.000) e, em seguida, adicione 0,4 μL de DAPI (2 ng/μL) para identificar células vivas por FACS.
    7. Pipetar a solução celular através da tampa do filtro de células dos tubos de fundo redondo resfriados para remover quaisquer aglomerados de células residuais.
      NOTA: O DAPI pode comprometer a viabilidade celular ao longo do tempo e, portanto, é melhor adicionar fresco a cada amostra antes da classificação.
    8. Classifique 10.000 células vivas vivas GFP-positivas (DAPI-negativas) nos tubos de reação de 1,5 mL previamente preparados com 50 μL de tampão de classificação contendo inibidor de ROCK (no gelo).
  12. Após o FACS, extraia diretamente o DNA genômico das células classificadas.
    1. Gire as células coletadas e classificadas no buffer de classificação a 600 x g por 10 min.
    2. Remova o sobrenadante e pegue o pellet celular em 250 μL de tampão de lise mais 12,5 μL de proteinase K por amostra.
    3. Continue conforme descrito na seção 3.
    4. Finalmente, dissolva o pellet de DNA em 50 μL de água livre de nuclease.
  13. Execute uma PCR para gerar um modelo para sequenciamento de Sanger, conforme descrito na etapa 4.1. Como controle, use o DNA da condição gLACZ e os primers direcionados ao gene de interesse (os mesmos primers usados na seção 4). Extraia as bandas apropriadas da eletroforese em gel de agarose, purifique-a sobre uma coluna e envie-a para sequenciamento de Sanger.
  14. Alinhe os resultados do sequenciamento Sanger usando um alinhamento global em pares.
    NOTA: O direcionamento bem-sucedido pode ser identificado por sinais sobrepostos ou sequências incompletas resultantes de inserções / deleções aleatórias ao redor do local de ligação do gRNA ( Figura 1D ).

6. Geração de organoides corticais humanos fatiados

NOTA: Os organoides corticais humanos (hCO) são gerados de acordo com o método do organoide neocortical fatiado (SNO), conforme descrito anteriormente em detalhes15,60.

  1. Separe pequenas colônias de hiPSC de 1 poço de uma placa de 6 poços com 1 mg / mL de colagenase incubando por 30-40 min a 37 ° C em uma incubadora. Enquanto isso, cubra uma nova placa de 6 poços com a matriz da membrana basal.
    1. Pare a enzima com 1 mL de meio de células-tronco e colete as colônias com uma ponta larga em 5 mL de meio de células-tronco em um tubo cônico de 15 mL.
      NOTA: Quaisquer etapas que mencionem "pontas de pipeta de diâmetro largo" também podem ser realizadas com pontas cortadas em uma abertura de pelo menos 2 mm de diâmetro.
    2. Assim que as colônias se estabelecerem no fundo, remova o meio antigo e substitua-o por meio de células-tronco fresco.
    3. Usando uma ponta de furo largo, distribua as colônias uniformemente na placa revestida de 6 poços com 1,5 mL de meio de células-tronco por poço.
    4. Cultive o hiPSC por 2-3 dias em condições padrão.
  2. Quando as colônias de hiPSC atingirem cerca de 1,5 mm de diâmetro, retire todas as colônias novamente com 1 mg / mL de colagenase incubando por até 1 h a 37 ° C.
    1. Pare a enzima com 6 mL de meio prosencéfalo 115 e colete colônias destacadas em um tubo cônico de 15 mL usando pontas largas.
    2. Assim que as colônias estiverem assentadas, remova o meio antigo e lave com 5 mL de meio prosencéfalo 1.
    3. Finalmente, transfira as colônias para uma placa de 6 poços de fixação ultrabaixa contendo 3 mL de meio prosencéfalo 1 por poço com pontas largas e deixe-as formar corpos embrióides (EBs). Esta etapa indica o dia 0 do protocolo organoide cortical humano. A partir daqui, siga o protocolo conforme publicado15.
  3. No dia 7, incorpore EBs em uma matriz de membrana basal, com cerca de 20 EBs por "biscoito" e cultura por 1 semana em meio de prosencéfalo 2 15. No dia 14, libere mecanicamente os organoides da matriz e continue cultivando em placas de fixação ultrabaixa de 6 poços no meio do prosencéfalo 315 em um agitador orbital a 120 rpm.
  4. A partir do dia 35, a matriz de membrana basal a 1% v/v é suplementada ao meio.
  5. Na semana 6, incorpore organoides em agarose de baixo ponto de fusão a 3% e corte em um vibratomo em fatias de 500 μm de espessura (Figura 2A, B), que suporta o suprimento de oxigênio e nutrientes em todos os organoides. Se necessário, repita o corte de organoides a cada 4 semanas.
  6. A partir do dia 70, cultive organoides no meio do prosencéfalo 415.

7. Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados

NOTA: Os organoides corticais humanos podem ser injetados e eletroporados assim que as estruturas semelhantes a ventrículos forem visíveis, aproximadamente a partir da semana 2. Para organoides em estágio avançado (semana 5 e mais), a eletroporação é mais eficiente e a viabilidade das células é melhor quando o procedimento é realizado 2 dias após o corte dos organoides26,55. Após o corte, as estruturas semelhantes a ventrículos são fáceis de identificar, o que auxilia no procedimento de injeção (Figura 2C, D). Além disso, as estruturas semelhantes a ventrículos permanecem parcialmente abertas por algum tempo após o corte, permitindo que o excesso de solução injetável escape, o que protege a integridade da correia de junção aderente que reveste os ventrículos. O cronograma de fatiamento pode ser alterado para corresponder ao cronograma experimental. O corte deve ser repetido a cada 3-4 semanas para culturas de longo prazo.

  1. Puxe os capilares de vidro borossilicato para injeções injetáveis em um extrator microcapilar com as seguintes configurações: P 500, calor 600, tração 30, velocidade 40, tempo 1. Armazene os capilares em uma grande placa de Petri usando fita adesiva para fixação.
  2. No dia da eletroporação, prepare novamente o complexo CRISPRR/Cas9 RNP conforme descrito na etapa 5.4 com uma concentração final de 24 μM RNP. A co-eletroporação de plasmídeo pCAG-GFP de 0,1 μg / μL (ou de qualquer outro repórter fluorescente) suporta a identificação de células eletroporadas. Além disso, adicione 0,1% de solução Fast Green em água à mistura de injeção final, o que permite a confirmação da entrega bem-sucedida da mistura.
    NOTA: Faça misturas separadas para cada gene de interesse e o controle gLACZ .
  3. Pré-aqueça a solução de Tyrode (uma embalagem de sal de Tyrode, 1 g de NaHCO3, 13 mL de HEPES 1 M pH 7,25 em 1 L de dH2O) a 37 °C. Conservar a restante solução de Tyrode a 4 °C durante vários meses.
  4. Selecione hCO com estruturas semelhantes a ventrículos bem desenvolvidas ( Figura 2E ) e descarte quaisquer organoides que não mostrem estruturas semelhantes a ventrículos ( Figura 2F ). Transferir até 10 organoides para uma placa de Petri de 6 cm contendo a solução de Tyrode e manter as restantes hCOs na incubadora.
  5. Encha um microcapilar de vidro com 10 μL da solução injetável com a ajuda de uma ponta de pipeta microcarregadora e abra o capilar beliscando a extremidade fina com uma pinça. Verifique se o capilar está aberto liberando um pouco da mistura de injeção na solução de Tyrode. Realize as injeções com um microinjetor em um ambiente contínuo com gating controlado por meio de um pedal.
  6. Insira o capilar no centro de estruturas semelhantes a ventrículos ( Figura 2C ) e injete 0,2-0,5 μL da mistura pressionando o pedal.
    NOTA: Até 5 ventrículos podem ser injetados por hCO com um total de 7-8 hCOs processados por replicação. Idealmente, os ventrículos voltados para a parte externa do hCO devem ser direcionados, pois geralmente são os mais bem desenvolvidos (Figura 2G, H).
  7. Use uma pinça fina para empurrar o organoide contra para restringir o movimento. Na verdade, não pegue os organoides (Figura 2C).
  8. Após a injeção, use uma ponta de pipeta de diâmetro largo para transferir 1-2 organoides para uma câmara de eletroporação contendo a solução de Tyrode ( Figura 2C, D ).
  9. Oriente os organoides injetados em direção aos eletrodos de modo que a glia radial apical em regiões semelhantes a ventrículos voltadas para fora do organoide sejam direcionadas.
  10. Conecte os cabos à câmara de eletroporação com o lado injetado do organoide voltado para o pólo positivo (ânodo; Figura 2D).
  11. Pressione o botão Pulso da máquina eletroporadora para eletroporar com cinco pulsos de 38 V por 50 ms cada em intervalos de 1 s.
    NOTA: As configurações de eletroporação podem depender do eletroporador disponível e podem precisar ser otimizadas.
  12. Repita as etapas de injeção e eletroporação até que o número desejado de organoides seja processado.
  13. Recolher os organoides electroporados num meio em RT até que todas as amostras para o mesmo estado tenham sido processadas. Certifique-se de que eles não fiquem fora da incubadora por mais de 30 minutos no total.
  14. Em seguida, recolocar as hCOs eletroporosadas no meio de cultura apropriado e cultivá-las sem agitação durante as primeiras 24 h.
    NOTA: Após 2-3 dias, o sinal GFP deve ser visível em hCOs eletroporados sob um estereoscópio fluorescente (Figura 2H). O ponto de tempo da análise após a eletroporação deve ser escolhido dependendo da questão biológica a ser respondida. Após 3-7 dias, as células positivas para GFP estão localizadas em VZ, SVZ e CP15,60.

8. Fixação e crioseccionamento de organoides corticais humanos eletroporados

  1. Fixe organoides eletroporados em paraformaldeído a 4% (PFA) por 30 min em RT em um tubo de reação de 2 mL.
    CUIDADO: O PFA é tóxico e cancerígeno. Execute todas as etapas envolvendo PFA sob uma hotte. O uso de luvas de nitrilo e óculos de segurança é fortemente recomendado.
  2. Lave uma vez em PBS por 5 min e armazene em sacarose a 30% filtrada estéril em PBS a 4 ° C até que o tecido esteja totalmente saturado com sacarose.
  3. Incorpore organoides fixos em um meio de incorporação para amostra de tecido congelado mais 15% de sacarose em PBS em blocos em gelo seco.
  4. Preparar cortes de 20-30 μm num criostato e recolher o tecido em lâminas adesivas26,64.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado quando os organoides fixos estiverem em sacarose (estáveis a 4 ° C por vários meses) ou embutidos em um meio de incorporação (blocos congelados podem ser armazenados em sacos herméticos a -20 ° C por vários meses a anos).

9. Análise imuno-histoquímica de organoides corticais humanos eletroporados

  1. Para a análise imuno-histoquímica26,64, efectuar a recuperação do antigénio em tampão citrato (citrato de sódio 10 mM, polissorbato 20 a 0,05% em dH2O, pH 6,0) durante 1 h a 70 °C em banho-maria.
  2. Lave uma vez em PBS por 5 min, depois seque as lâminas brevemente e circule as seções com uma caneta de cera.
  3. Tempere usando glicina 0,1 M em PBS (pH 7,4) por 30 min em RT e, posteriormente, lave duas vezes com PBS por 5 min cada.
  4. Cubra as seções com tampão de bloqueio (10% de soro de cavalo, 0,1% de Octoxinol 9 em PBS) e incube por 30 min em RT.
  5. Preparar os anticorpos primários em tampão de bloqueio e incubar em secções durante a noite a 4 °C.
  6. No dia seguinte, lave três vezes com PBS por 5 min cada, incube com anticorpos secundários e DAPI em tampão de bloqueio por 1 h em RT e lave três vezes novamente com PBS por 5 min cada.
  7. Monte as lâminas no meio de montagem e faça a imagem em um microscópio fluorescente (Figura 3).
    NOTA: Recomenda-se incluir um anticorpo contra o fluoróforo usado na mistura de injeção para identificar as células-alvo, uma vez que o sinal nativo geralmente é extinto após a fixação. Os anticorpos e corantes usados para coloração por imunofluorescência, conforme representado na Figura 3, estão listados na Tabela 1.

10. Verificação do nocaute mediado por CRISPR/Cas9 em nível de proteína

  1. Para verificar o nocaute no nível da proteína, realize imuno-histoquímica para a proteína-alvo nos organoides eletroporados (Figura 3I).
  2. Visualize o controle gLACZ e os organoides alvo usando as mesmas configurações para permitir a comparação da intensidade de fluorescência (Figura 3I, J). Faça isso de maneira específica da zona para comparar o efeito nos diferentes tipos de células do neocórtex em desenvolvimento. Conte as células em ImageJ/Fiji (plugin Cell Counter) ou segmentando usando o plugin StarDist 65.

Resultados

A ablação gênica mediada por CRISPR/Cas9 requer o design de gRNAs. Geralmente, direcionar um dos primeiros éxons de um gene de interesse com um par de gRNAs espaçados de 7 a 11 pb (evitando múltiplos de 3 pb) funciona bem (Figura 1A). Como primeiro teste, a eficiência do reconhecimento do modelo por gRNAs pode ser interrogada in vitro usando um modelo de PCR 26,40,62. O direcionamento eficiente e o corte mediado por Cas9 são visíveis na redução do DNA molde e no aparecimento de produtos de DNA clivado em um gel de agarose ( Figura 1B ). Testes adicionais de gRNA podem ser realizados na linha iPSC que é usada para geração de organoides corticais. Isso requer a nucleofecção de iPSCs, que pode ser visualizada pela expressão bem-sucedida do repórter fluorescente (Figura 1C). O direcionamento eficiente do locus de interesse pode ser verificado pelo sequenciamento de Sanger, resultando em um cromatograma que termina abruptamente ou se sobrepõe ao redor do local de direcionamento (Figura 1D), resultante de um espectro de indels do reparo de quebra de fita dupla por junção de extremidade não homóloga66. Testes de eficiência de RNA guia in vitro e em células iPSC auxiliam na seleção de pares de gRNA eficientes para ablação gênica em organoides corticais.

Antes da eletroporação, os organoides corticais são fatiados, o que suporta a identificação dos lúmens do ventrículo para injeção da mistura de eletroporação (Figura 2A-C). Os organoides injetados são então transferidos para a câmara de eletroporação (Figura 2D). Para a eletroporação, devem ser utilizados organoides corticais com estruturas ventrículo-símile bem desenvolvidas (Figura 2E), enquanto organoides corticais sem estruturas visíveis devem ser descartados (Figura 2F). A mistura de eletroporação contém um corante que permite a visualização dos ventrículos injetados durante o procedimento (Figura 2G). Após 1-3 dias em cultura, os ventrículos direcionados com sucesso são visíveis pelo sinal GFP nativo sob um microscópio fluorescente ( Figura 2H ).

Para uma análise histológica aprofundada, a imuno-histoquímica de criossecções pode ser realizada. Idealmente, vários ventrículos-alvo estão presentes dentro de um organoide cortical eletroporado (Figura 3A, B). As eletroporações mais ideais têm como alvo estruturas semelhantes a ventrículos na região externa do organoide voltada para o exterior (Figura 3C), pois esses são tipicamente os ventrículos mais expandidos. Em alguns casos, a eletroporação pode levar à morte celular excessiva (Figura 3D, E), por exemplo, quando as concentrações de plasmídeo são muito altas ou as configurações de eletroporação são abaixo do ideal. As eletroporações voltadas para o interior do organoide (Figura 3F) geralmente envolvem regiões menos expandidas das estruturas semelhantes a ventrículos em comparação com o exterior. Em nossa experiência, é útil focar a análise quantitativa em regiões definidas do organoide para reduzir a variabilidade. Às vezes, a eletroporação pode causar ruptura da superfície apical (Figura 3G), por exemplo, quando o volume de injeção é muito alto, causando ruptura dos ventrículos, ou quando os pulsos elétricos são muito fortes, levando à delaminação celular. Finalmente, quando dois ventrículos adjacentes são direcionados (Figura 3H), pode ser difícil atribuir os limites das zonas corticais e a origem das células-alvo.

A imuno-histoquímica pode ser usada para verificar o nocaute mediado por CRISPR / Cas9 bem-sucedido no nível da proteína em células de interesse ( Figura 3I ), exemplificado aqui pelo direcionamento da proteína PCGF4 do Complexo Repressivo Polycomb 1 (PRC1)67. A intensidade do sinal pode ser analisada em células GFP-positivas em condições de controle versus experimentais (Figura 3J). Alternativamente, se nenhum anticorpo adequado estiver disponível, as células-alvo podem ser isoladas por FACS de organoides corticais60 e posteriormente analisadas por Sanger ou Sequenciamento de Próxima Geração36. Além disso, a redução dos níveis de proteína também pode ser analisada por meio de Western blotting.

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Figura 1: Projeto e validação de RNA guia para nocaute agudo de genes mediado por CRISPR/Cas9. (A) Ilustração esquemática da estratégia de design de RNA guia (gRNA), com dois gRNAs direcionados a um éxon de um gene de interesse. As setas pretas indicam primers de PCR para preparação de modelos usados para validação de gRNA. (B) Validação da eficiência do gRNA in vitro. Os modelos amplificados por PCR foram digeridos com complexos RNP. Após a clivagem bem-sucedida, duas bandas de tamanhos diferentes são visíveis após a eletroforese em gel (esquerda), enquanto o molde permanece sem cortes para gRNAs de baixa eficiência (direita). (C) Imagem de campo claro (esquerda), fluorescência GFP (meio) e imagens mescladas (direita) de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) 3 dias após a nucleofecção com o complexo RNP e um plasmídeo GFP. Barras de escala: 350 μm. (D) Validação da eficiência do gRNA em hiPSCs por sequenciamento de Sanger de DNA amplificado de células GFP-positivas. Após a clivagem bem-sucedida do DNA de fita dupla, as trilhas de sequenciamento mostram sinais sobrepostos a partir do local alvo do gRNA (topo, KO1). No caso de direcionamento malsucedido, a trilha da sequência de DNA permanece inalterada (inferior, KO2) em comparação com o controle LACZ . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Eletroporação de organoides corticais humanos fatiados. (A) Ilustração esquemática mostrando o fluxo de trabalho para a eletroporação de organoides corticais humanos (hCOs). Primeiro, os hCOs são seccionados em fatias de 500 μm de espessura. Dois dias depois, a mistura RNP contendo um plasmídeo de expressão GFP e Fast Green é injetada em lúmens de estruturas semelhantes a ventrículos, preferencialmente na região externa de hCOs. Para eletroporação, os hCOs são colocados na câmara de eletroporação. Após vários dias de cultura, um sinal GFP pode ser detectado em áreas eletroporadas. (B) Imagens de seccionamento de vibratome de hCOs. Os organoides são incorporados em agarose de baixo ponto de fusão a 3% em um meio em um bloco (esquerda). O bloco é seccionado em fatias de 500 μm de espessura (meio). Os organoides fatiados são transferidos de volta para a placa de cultura com uma ponta de pipeta de diâmetro largo (direita). (C) Imagens mostrando a injeção da mistura contendo RNP, pCAG-GFP e 0,1% Fast Green em estruturas semelhantes a ventrículos dos organoides. Os organoides são submersos na solução de Tyrode e o capilar de vidro fino é inserido no lúmen do centro das estruturas semelhantes a ventrículos (esquerda). Fórceps são usados para estabilizar os organoides (esquerdo e médio). Os ventrículos do lado de fora dos organoides são direcionados (meio). Os organoides injetados são transferidos para a câmara de eletroporação, ou posteriormente para a placa de cultura, com pontas de pipeta de diâmetro largo (direita). (D) Imagens da câmara de eletroporação, que é composta por uma placa de Petri de vidro e duas lâminas de metal coladas ao vidro. As lâminas de metal servem como eletrodos e contêm orifícios para prender os cabos para conectar ao eletroporador. O lado injetado do hCO, visível através de uma sombra verde, deve estar voltado para o ânodo (pólo positivo, cabo vermelho) (direita). (E) Imagens representativas de hCOs mostrando estruturas semelhantes a ventrículos bem desenvolvidas. O anel mais leve representa a área semelhante à zona ventricular. O círculo mais escuro no centro da estrutura semelhante a um ventrículo representa o lúmen e deve ser direcionado para injeção. (F) Imagens representativas de hCOs sem estruturas semelhantes a ventrículos bem desenvolvidas, que recomendamos não incluir em experimentos futuros. (G) Imagens representativas de hCOs após a injeção da mistura de eletroporação, nas quais as áreas-alvo são visíveis em verde rápido (setas laranja). (H) Imagem representativa de hCO mostrando o sinal GFP nativo 24 h após a eletroporação. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

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Figura 3: Análise imuno-histoquímica de organoides corticais humanos fatiados eletroporados. (A) Esquema representando um organoide cortical humano eletroporado (hCO) com sinal fluorescente verde. (B) Coloração DAPI (cinza) e imunofluorescência para GFP (verde) de hCO criosseccionado com múltiplos ventrículos eletroporados, 7 dias após a eletroporação. (CH) Imagens de exemplo de diferentes resultados de eletroporação, coradas para GFP (verde) e núcleos (DAPI, cinza). (C) Uma eletroporação ideal com núcleos intactos (ver inserção 1, D), uma estrutura semelhante a um ventrículo não interrompida e células eletroporadas na área voltada para o exterior do organoide, que geralmente é mais expandida. (E) Exemplo de hCO exibindo morte celular maciça na área eletroporada (ver também inserção 2, D), caracterizada por núcleos pequenos, densos em DAPI e distorcidos. (F) Uma eletroporação bem-sucedida direcionada para o interior do organoide, que geralmente é mais difícil de interpretar devido às áreas semelhantes a placas corticais que se fundem com os ventrículos adjacentes. (G) Estruturas semelhantes a ventrículos rompidas no centro da área eletroporada (seta laranja). (H) Um exemplo de hCO contendo vários ventrículos menores que estão parcialmente fundidos e, portanto, difíceis de quantificar. (I) Coloração DAPI (cinza) e imunofluorescência para GFP (verde) e PCGF4 (magenta) 7 dias após a eletroporação de um complexo RNP visando LACZ (gLACZ KO, esquerda) ou PCGF4 (gPCGF4 KO, direita) para nocaute mediado por CRISPR/Cas9. As células circuladas destacam a intensidade reduzida do PCGF4, indicando ablação gênica bem-sucedida. Um sinal uniforme pode ser visto no controle LACZ (esquerda). (J) O gráfico mostra a intensidade quantificada de PCGF4 após imunofluorescência em células GFP-positivas para o controle (gLACZ KO) e o KO de PCGF4 (gPCGF4 KO) em relação à expressão mediana de PCGF4 na condição gLACZ. Cada ponto representa uma célula. Dados de 3-4 organoides de dois lotes diferentes (cinza e preto) da mesma linha hiPSC. p < 0,0001, teste de Mann-Whitney. Todas as imagens foram adquiridas com um microscópio confocal de varredura a laser (B, C) ou fluorescente (EI). As imagens representam projeções de intensidade máxima de pilhas z de 10-15 μm de espessura. Linhas tracejadas brancas indicam a superfície apical voltada para o lúmen do ventrículo e as superfícies externas das hCOs. Linhas tracejadas laranja indicam a borda VZ/SVZ nos ventrículos mesclados. Barras de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Anticorpo/CoranteDiluição
Frango anti-GFP1:2,000
Mouse anti-PCGF41:300
Alexa Fluor 488 Burro Anti-Frango1:1,000
Alexa Fluor 555 Burro Anti-Coelho1:1,000
DAPI1 mg/mL de estoque; 1:1,000

Tabela 1: Lista de anticorpos e corantes e sua diluição usados para coloração por imunofluorescência.

Discussão

Os organoides cerebrais e corticais humanos tornaram-se modelos-chave para investigar o desenvolvimento do neocórtex humano 7,16,17. Para modelagem de doenças humanas, linhagens e organoides hiPSC isogênicos tornaram-se o padrão-ouro68. No entanto, como a geração de novas linhagens de iPSC é demorada e cara, a manipulação aguda de modelos organoides corticais para estudos da função gênica tem sido amplamente aplicada.

A eletroporação de organoides cerebrais e corticais 14,22,26,46,47,48,49,50,51,55 é fácil de implementar, e muitos laboratórios que tradicionalmente usam modelos animais para estudos funcionais estão equipados com as ferramentas necessárias. Para injeção in vivo, os ventrículos laterais são tipicamente direcionados 34,36,37,39,40,41,42. Estes são modelados em organoides corticais por estruturas semelhantes a ventrículos com um lúmen central que também pode ser injetado. A eletroporação de organoides corticais tem como alvo principal os pés finais das células que revestem os ventrículos, tipicamente a glia radial apical69. A eficiência de direcionamento varia entre os experimentos, mas normalmente, algumas 100 a 1.000 células positivas para GFP podem ser obtidas por organoide após 3-7 dias de eletroporação. A duração do ciclo celular em células progenitoras neurais humanas é aproximadamente duas vezes maior em comparação com o camundongo, onde a glia radial apical tem uma duração de ciclo celular de 14 h e as células progenitoras basais de 23 h70. Portanto, após 3 dias, principalmente as células da glia radial apical e as células progenitoras intermediárias são GFP-positivas, enquanto as células GFP-positivas são distribuídas por todas as zonas após 7 dias. O sinal GFP ainda pode ser observado vários meses após a eletroporação, com células GFP-positivas representando principalmente neurônios que estão espalhados por todo o organoide, permitindo-nos analisar a morfologia de células individuais. O direcionamento de células progenitoras neurais que revestem o ventrículo é viável durante os estágios em que regiões semelhantes a ventrículos são identificáveis sob o microscópio de campo claro. No protocolo atual15, isso é possível da semana 2 à semana 12 do desenvolvimento do organoide cortical, após o qual os ventrículos encolhem e não são mais visíveis. Para um experimentador experiente, é viável injetar 50-80 organoides em uma sessão.

Embora a progênie da glia radial apical herde reagentes de manipulação de genes durante a divisão celular, o direcionamento direto de células maduras, como neurônios e astrócitos, não é viável com a abordagem de eletroporação padrão. Em vez disso, métodos de direcionamento viral foram aplicados a células pós-mitóticas no sistema nervoso33,71. Em particular, os vírus adeno-associados recombinantes (AAVs) são amplamente utilizados para transferência de genes no sistema nervoso, pois são fáceis de produzir e transduzir células terminalmente diferenciadas com alta eficiência71. Além disso, os AAVs podem ser direcionados a subpopulações neuronais específicas. Diferentes abordagens de direcionamento viral, incluindo o uso de adeno, Sendai e lentivírus, já foram aplicadas em organoides cerebrais e corticais 15,25,29,30,32,47,72,73,74.

Uma limitação nos protocolos de organoides cerebrais é o desenvolvimento de um núcleo necrótico devido ao suprimento limitado de oxigênio e nutrientes. Várias estratégias foram implementadas para melhorar a viabilidade celular no centro organoide, incluindo cultura de organoides em biorreatores giratórios 14,54, co-cultura de células endoteliais ou abordagens de bioengenharia para estruturação de modelos75,76, transplante de organoides em modelos de roedores 18,77 e fatiamento de organoides15,47. Aqui, usamos o protocolo organoide cortical humano fatiado, que demonstrou apresentar hipóxia reduzida no núcleo organoide e apoiar a expansão de estruturas semelhantes a ventrículos e a região semelhante a placa cortical15. Além disso, o corte de organoides cerebrais também é benéfico para imagens ao vivo da glia radial basal, que está localizada na zona subventricular, permitindo a geração de mapas de decisão de destino celular72. Da mesma forma, imagens ao vivo foram usadas para estudar organoides cerebrais fatiados cultivados na interface ar-líquido, que suporta a sobrevivência neuronal e o crescimento axonal47. Descobrimos que o corte de organoides corticais humanos também torna esses modelos organoides particularmente passíveis de eletroporação, pois estruturas semelhantes a ventrículos podem ser facilmente identificadas após o corte. A eletroporação de organoides corticais permite a introdução de plasmídeos de DNA, classicamente usados para superexpressão gênica e, mais recentemente, para entrega de bibliotecas inteiras de plasmídeos55, e de ferramentas de edição de genes CRISPR / Cas9 para inativação da função gênica26.

A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a investigação da função gênica 56,57,58,63,66. Neste protocolo, descrevemos a aplicação de complexos ribonucleoproteicos gRNA/Cas936 para inativação gênica aguda em organoides corticais humanos. A validação inicial da eficiência do gRNA foi realizada in vitro, primeiro em tubo de ensaio e segundo em iPSCs. Descobrimos que esses testes iniciais diretos auxiliam na seleção de pares de gRNA promissores, particularmente na ausência de anticorpos funcionais. À medida que mais e mais ferramentas para nocaute genético mediado por CRISPR/Cas9 se caracterizam, as etapas iniciais de validação podem ser omitidas no futuro. Embora o sequenciamento de próxima geração de regiões de DNA direcionadas isoladas de iPSCs seja mais quantitativo e tenha maior conteúdo de informação, descobrimos que o sequenciamento de Sanger geralmente pode oferecer resultados muito mais rápidos durante a pré-triagem de gRNAs. Em última análise, a validação da edição eficiente de CRISPR/Cas9 em organoides corticais e a redução dos níveis de proteína nas células de interesse é a prova mais definitiva da ablação bem-sucedida do gene mediada por CRISPR/Cas9.

A eletroporação de organoides corticais humanos fatiados permite a manipulação genética aguda para estudos de ganho e perda de função, visualização da morfologia celular e axônios neuronais, entrega de bibliotecas de plasmídeos para abordagens de triagem e ensaios de repórteres paralelos massivos, marcação de células para imagens ao vivo e entrega de ferramentas de edição de epigenoma. Como tal, a eletroporação de organoides corticais humanos fatiados é um método poderoso que pode revelar insights mecanicistas sobre o desenvolvimento cortical humano, distúrbios do neurodesenvolvimento e evolução cortical.

Divulgações

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.

Agradecimentos

Somos gratos às instalações dos parceiros CRTD e Dresden Concept pelo excelente apoio prestado, notadamente K. Neumann e sua equipe na Instalação de Engenharia de Células-Tronco, H. Hartmann e sua equipe na Instalação de Microscopia de Luz, A. Gompf e sua equipe na Instalação de Citometria de Fluxo e Hartmut Wolf da oficina MPI-CBG para a construção das câmaras de eletroporação. Agradecemos a Joshua Schmidt por seu feedback sobre o manuscrito. MA reconhece o financiamento do Centro de Terapias Regenerativas TU Dresden, do DFG (Emmy Noether, AL 2231 / 1-1) e da Fundação Schram.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga PP de 15 mL, cônicosCorning430791
4D-Nucleofector Core UnitLonza
4D-Nucleofector X UnitLonza
5 mL de poliestireno tubo de fundo redondo com tampa de filtro de célulaCorningFalcon 352235
placa de 6 poços, tratada com nunclonThermo Fisher140675para hiPSC placa de cultura
de 6 poços, fixação ultra baixaCorning3471Para cultura organoide
A83-01STEMCELL Technologies72022Meio prosencéfalo 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Compressor de arAerotec
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L)Jackson Immuno Research703-545-155Anticorpo secundário, RRID: AB_2340375; diluição 1:1000
Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)InvitrogenA-31572Anticorpo secundário, RRID: AB_162543; diluição 1:1000
Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA, 2 nmolintegradas de DNADesign personalizado (pedido de 2 nmol)
Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNATecnologias integradas de DNA10725325 nmol
Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 Tecnologiasintegradas de DNA1081060100 µ g, de Streptococcus pyogenes
Anfotericina B (Fungizone)Gibco15290018Meio de prosencéfalo 2, 3 e 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Anticorpo primário anti-GFP (frango, policlonal)Abcamab13970RRID: AB_300798; diluição 1:2000
Anticorpo primário anti-PCGF4 (camundongo, monoclonal)Millipore05-637 RRID: AB_309865; diluição 1:300
Microscópio fluorescenteApoTome Zeiss
Ácido AscórbicoSigma Aldrich1043003Meio para prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
B27-suplemento (+ vitamina A)Gibco17504044Meio para prosencéfalo 3, 4    (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Banana to Micrograbber Cable KitHarvard Apparatus BTX45-0216
Biometra TRIO-Thermocycler (máquina de PCR)Analytik Jena846-2-070-723
Capilares, vidro borossilicato com filamento, OD 1,2 mm; ID 0,69 mm; 10 cm de comprimentoScience ProductsBF120-69-10Precisa ser puxado para espessura específica
CHIR-99021STEMCELL Technologies72052Meio para prosencéfalo 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Collagenase Tipo IVGibco17104019
CRTDi004-AInstalação de Engenharia de Células-Tronco no CMCB DDhttps://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-ALinha hiPSC adaptada de célula única do doador saudável
DAPIRoche10236276001estoque de 1 mg/mL, use 1:1000 diluído para IF
Dibutiril-cAMPSTEMCELL Technologies73884Meio para prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma AldrichD2650
DMEM/F-12, HEPESFisher Scientific31330095Meio prosencéfalo 1, 2 e 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
DorsomorphinSTEMCELL Technologies72102Meio para prosencéfalo 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Dumont #55 Fórceps, estreito, 11 cmFerramentas de Belas Ciências11295-51
ECM 830 Sistema de Eletroporação de Onda QuadradaHarvard Aparelho BTX45-2052
EtanolSigma Aldrich32205-1L-M
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)Sigma AldrichEDS-500G
Fast Green FCFSigma AldrichF7252
Soro Fetal Bovino (FBS)GE Healthcare SH30070.03 
Extrator de Micropipeta Flamejante/MarromSutter Instrument Co.P-97Para extração de microcapilares
Geneious PrimeGraphPad Software LLC dba GeneiousSoftware versão 2024.0.5
gLACZKalebic et al., 2016; Platt et al., 20145'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; nucleotídeos sublinhados = PAM
GlutaMAXGibco 35050038Meio prosencéfalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
GlycineSigma AldrichG8898
gPCGF4 KO1este artigo5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (corresponde às imagens KO na Figura 3I+J)
gPCGF4 KO2este artigo5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (corresponde ao KO imagens na Figura 3I+J)
HEPESfeito em casa1 M stock
Soro de cavalo, inativado por calorGibco26050088
Proteína Recombinante Humana GDNFThermo Fisher450-10Meio de prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Humano/Camundongo/Rato BDNF Proteína Recombinante ThermoFisher450-02Meio para prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Ácido clorídrico (HCl)Sigma Aldrich258148Para fazer TrisHCl
ImmEdge (cera) CanetaVector LaboraoriesH-4000
Solução de insulina humanaSigma Aldrich  I9278Prosencéfalo médio 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
IsopropanolFisher ScientificBP2618-1
Knockout Serum ReplacementGibco 10828-010Meio para prosencéfalo 1  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Microscópio Confocal de Varredura a Laser 980Zeiss
Baixo Ponto de Fusão Agarose, ultra puroThermo Fisher16520100para incorporação de hCOs durante o seccionamento do vibratomo
Matriz de Membrana do Porão Matrigel Redução do Fator de Crescimento (TFG),Corning354230Para cultura
de organoidesMatriz Matrigel hESC-Qualificada,354277 CorningPara cultura hiPSC
MgCl2, 1M Thermo FisherAM9530G
Microinjetor PicoPump + Interruptor de PéWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Microloader Pipeta Tips 0.5 a 20 µ LEppendorf5242956003Para carregamento de capilares de vidro
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850Meio de células-tronco
N-2 suplementoGibco17502048Meio Forebrain 2 e 3  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
NaClSigma AldrichS5886
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NEB Próxima Transmissão de Alta Fidelidade 2x PCR Mastermix New England BiolabsM0541S
Marca718605
Meio neurobasalGibco21103049Meio para prosencéfalo 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Aminoácidos Não EssenciaisGibco 11140050Meio prosencéfalo 1, 2, 3 e 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15Nuclease-Free
Duplex BufferTecnologias integradas de DNA1072570
O. C. T. CompoundTissue-Tek4583Meio de incorporação para amostra de tecido congelado
P3 Célula Primária 4D-Nucleofector X Kit SLonzaV4XP-3032
ParaformaldeídoFisher ChemicalP/0840/53
pCAG-GFPAddgene11150
Molde de Incorporação Peel-A-Way TruncadoT12Polysciences Inc.18986-1Para incorporação de hCOs para vibratomo e crioseccionamento
Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL) Gibco15140122Forebrain medium 1, 2, 3 e 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15 e para meio de células-tronco após nucleofecção
Placa de Petri 60 mm x 15 mm, Sem Ventilação, Placa de Petri EstérilCorningBP50-02
Câmara de Eletrodo de Platina, lacuna de 5 mmHarvard Apparatus BTX45-0504
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)fabricada internamente
Proteinase KSigma AldrichP2308De Titrachium album; 10 mg/mL estoque
QIAquick Kit de Extração de GelQiagen28706
Inibidor da via RHO/ROCK (Y-27632)STEMCELL Technologies72308
SB-431542STEMCELL Technologies72232Meio para prosencéfalo 2  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Citrato de Sódio DihidratadoSigma AldrichW302600-1KG-K
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)Sigma AldrichL3771
Sucrose Lâminas de adesão Sigma AldrichS7903
SuperFrost PlusFisher Scientific10149870
SZX10 com um LED KL 300OlympusSZX10Ou estereoscópio alternativo
Thermo ShakerGrant bioPSC24N
Triton-XSigma AldrichT9284também conhecido como Octoxinol 9
Trizma baseSigma AldrichT1503Para fazer TrisHCl
Trypan Blue Solution, 0,4%Thermo Fisher15250061
TrypLE Express Enzyme (1x)Thermo Fisher12604021Dissociação enzmye para fazer suspensões de célula única
Tween 20Sigma AldrichP1379também conhecido como Polissorbato 20
Sal de TyrodeSigma AldrichT2145-10x1l
Vibratório Micrótomo (vibratoma)LeicaVT1200 S
Wide-Bore 1000 µ L Pontas de Filtro Universal FitCorningTF-1005-WB-R-S
β-MercaptoetanolGibco 21985-023Prosencéfalo médio 1, 3 e 4  (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15
Tecnologias sem LDEV sem LDEV Câmara de contagem Neubauer

Referências

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