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Dissociação de alto rendimento e implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama

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DOI:

10.3791/67607

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20 de dezembro de 2024

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1Division of Exercise Physiology, Department of Health Professions, West Virginia University School of Medicine, 2Cancer Institute, West Virginia University School of Medicine, 33Department of Microbiology, Immunology, and Cell Biology, West Virginia University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método eficiente e não cirúrgico para a implantação ortotópica de xenoenxertos derivados de pacientes com câncer de mama em camundongos. A técnica envolve a dissociação enzimática do tumor seguida de injeção direta nas bolsas de gordura mamária, permitindo a implantação de alto rendimento. A validação abrangente garante a fidelidade do modelo, facilitando estudos rigorosos em vários subtipos de câncer de mama.

Resumo

Os xenoenxertos derivados do paciente (PDXs) fornecem um método clinicamente relevante para recapitular os tipos de células envolvidas no tumor e o microambiente tumoral, o que é essencial para o avanço do conhecimento do câncer de mama (CM). Além disso, os modelos PDX permitem o estudo dos efeitos sistêmicos do CB, o que não é possível usando modelos in vitro. Os métodos tradicionais para implantar xenoenxertos de BC geralmente envolvem anestesia e procedimentos cirúrgicos estéreis, que são demorados, invasivos e limitam a escalabilidade dos modelos PDX na pesquisa de CB. Este protocolo descreve um método simples e escalável para o implante ortotópico de BC PDXs em camundongos. A cepa de camundongo imunodeficiente NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) foi usada para enxerto de PDX. Amostras de BC humanas obtidas de pacientes consentidas com IRB foram mecanicamente e enzimaticamente dissociadas e, em seguida, ressuspensas em uma solução de extrato de membrana basal (BME) e RPMI 1640. Os animais foram contidos por scruffing e creme depilatório foi aplicado para remover os pelos das bolsas de gordura no quarto mamilo inguinal, seguido de injeção. Aproximadamente 2 milhões de células em uma suspensão de 100 μL foram injetadas bilateralmente ortotopicamente nas bolsas de gordura mamária usando uma agulha 26 G. Notavelmente, nenhum anestésico foi necessário e o tempo total do procedimento foi inferior a 5 min, desde a preparação da célula até a injeção. Após um período de crescimento de vários meses, os tumores foram excisados e processados para autenticação. A validação incluiu a avaliação do status do receptor usando imuno-histoquímica com anticorpos específicos para receptores BC tradicionais (ou seja, ER, PR, HER2). A morfologia do tumor foi confirmada com coloração de hematoxilina e eosina (H&E), que foi interpretada por um patologista. A similaridade genética com a amostra de pacientes foi verificada por meio de sequenciamento de RNA em massa e análise de repetição curta em tandem (STR). Essa abordagem para enxerto e validação de PDX suporta o desenvolvimento rigoroso de modelos e implantação de tumor de alto rendimento, permitindo estudos bem capacitados em vários subtipos de CB.

Introdução

O câncer de mama (CM) é diagnosticado em mais de 2 milhões de mulheres em todo o mundo a cada ano1. Para avançar na compreensão biológica básica do CM e traduzir com sucesso novas terapias para tratamentos aprovados, são necessários modelos animais pré-clínicos que retenham as características definidoras dos tumores do paciente. Foi demonstrado que os xenoenxertos derivados de pacientes (PDXs) recapitulam a heterogeneidade do tumor com alta fidelidade quando implantados ortotopicamente, incluindo histopatologia, expressão de receptores e aberrações genéticas 2,3,4. É importante ressaltar que eles também retêm células estromais que contribuem para o microambiente do tumor, como vasculatura, células imunes e fibroblastos associados ao câncer. Embora sejam gradualmente substituídos por células estromais hospedeiras murinas com passagem5. As PDXs também permitem o estudo de complicações sistêmicas decorrentes do crescimento tumoral, como a fadiga 6,7, o que atualmente não é possível com o uso de modelos in vitro.

O enxerto BC PDX bem-sucedido, no entanto, requer uma cepa de camundongo imunodeficiente, com a cepa mais comumente usada sendo NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ). Os camundongos NSG são desprovidos de imunidade adaptativa e exibem imunidade inata altamente defeituosa8. O enxerto de BC PDX foi alcançado em outras cepas imunodeficientes, como SCID/Beige (CB17.Cg-PrkdcscidLystbg-J/Crl), com taxas de enxerto semelhantes4.

Os métodos tradicionais de implantação de BC PDXs envolvem a implantação cirúrgica de um fragmento tumoral na bolsa de gordura mamária9, e essa abordagem leva a um enxerto bem-sucedido em taxas favoráveis. No entanto, a necessidade de procedimentos cirúrgicos estéreis e uso de anestésicos torna isso demorado, limitando assim o número de camundongos que podem ser implantados em uma determinada janela de tempo. Dados os potenciais benefícios preditivos dos PDXs de respostas a medicamentos em tumores e uso em medicina de precisão10, é vital ter um fluxo de trabalho simples e reprodutível para implantar PDXs de forma homogênea em camundongos. Este artigo demonstra a dissociação de tumores de mama humanos em uma única suspensão celular e subsequente injeção ortotópica em bolsas de gordura mamárias de camundongos imunodeficientes.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes estabelecidas pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da West Virginia University (WVU). Camundongos fêmeas NOD.Cg-PrkdcscidIl2rg tm1Wjl/SzJ (NSG), com 8 semanas ou mais e pesando aproximadamente 25 g, foram usados para injeções de células tumorais. O tecido tumoral do câncer de mama foi adquirido no West Virginia University Cancer Institute (Morgantown, WV) e pela NCI Cooperative Human Tissue Network sob o protocolo aprovado do WVU Institutional Review Board e o WVU Cancer Institute Protocol Review and Monitoring Committee. O consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes. Todos os procedimentos foram conduzidos em condições assépticas dentro de uma cabine de segurança biológica Classe II, seguindo protocolos apropriados de equipamentos de proteção individual (EPI). Os detalhes dos animais, reagentes e equipamentos usados neste estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Dissociação enzimática de alto rendimento do tecido tumoral

  1. Descongele e combine as enzimas H, R e A do kit de dissociação de tumores humanos em um tubo C estéril. Adicione 200 μL de enzima H, 100 μL de enzima R e 25 μL de enzima A. Traga o volume final para ~ 5 mL adicionando 4,7 mL de meio estéril RPMI 1640 ao tubo C.
    NOTA: O Modified Eagle Medium (DMEM) da Dulbecco pode ser usado no lugar do RPMI 1640.
  2. Os fragmentos tumorais podem ser cortados e congelados conforme descrito nos protocolos existentes9. Transferir fragmentos tumorais descongelados e o meio de congelação que o acompanha para a metade de uma placa de cultura estéril de 100 mm. Usando uma pinça estéril, transfira os fragmentos do tumor para um microtubo estéril de 5 mL.
    NOTA: Uma agulha hipodérmica estéril pode ser usada como alternativa à pinça. Um prato de 35 mm pode ser usado no lugar de um microtubo de 5 mL.
  3. Lave os fragmentos tumorais com 1-3 mL de solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS, 1x). Manipule os fragmentos na solução usando uma pinça para garantir a remoção completa do meio de congelamento residual.
  4. Transfira os fragmentos lavados para um microtubo de 2 mL usando uma pinça. Aplique 1 mL de solução tripla de antibiótico (TAB) nos fragmentos tumorais e incube por 10 min em temperatura ambiente.
    NOTA: Esta etapa pode ser ignorada, se desejado. O estoque 10x TAB pode ser feito dissolvendo 1% de gentamicina, 1% de clindamicina e 0,5% de sulfato de polimixina B em 1x PBS estéril. Diluir para solução 1x TAB em 1x PBS estéril.
  5. Usando uma pinça estéril, transfira os fragmentos desinfetados para um novo microtubo de 5 mL. Faça uma segunda lavagem com 1-3 mL de PBS estéril. Transferir os fragmentos lavados para a metade seca da placa de cultura de 100 mm a partir do passo 1.2.
  6. Usando duas lâminas de bisturi nº 10 estéreis, pique bem o tecido tumoral. Transfira os fragmentos tumorais picados para uma lâmina e deposite-os no tubo C contendo a solução enzimática preparada. Aperte bem a tampa do tubo até sentir um clique final.
  7. Inverta o tubo C várias vezes para garantir uma distribuição uniforme dos fragmentos tumorais dentro da solução enzimática.
  8. Coloque o tubo C no dissociador mecânico. Inverta o tubo e certifique-se de que todo o conteúdo esteja submerso no meio. O tubo estará em uma posição invertida na máquina.
    1. Prenda o tubo em uma ranhura com a parte recuada voltada para o operador. Se aplicável, coloque o aquecedor ao redor do tubo.
  9. Selecione o programa 37C_h_TDK_3 na interface da tela sensível ao toque. Este programa opera por 60 min a 37 °C. Para tumores mais moles, 37C_h_TDK_1 ou 2 podem ser usados.
    NOTA: Para maior eficiência, recomenda-se que os camundongos sejam preparados para injeção durante este período de dissociação, aplicando creme depilatório nos locais de injeção.
  10. Após a conclusão do programa de dissociação, inspecione o conteúdo do tubo. Nenhum fragmento tumoral visível deve permanecer.
    NOTA: Se houver fragmentos, pode ser necessário um tempo adicional de dissociação. Nesses casos, execute o programa por mais 20 a 30 minutos.
  11. Uma vez alcançada a dissociação adequada, centrifugue o tubo C a 200 x g durante 5-8 min a 4 °C para granular as células dissociadas. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando aspiração a vácuo ou uma pipeta.
  12. Ressuspenda o pellet celular em 5-10 mL de meio RPMI fresco. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mL para facilitar a manipulação. Centrifugue a suspensão da célula a 200 x g durante 5-8 min a 4 °C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante.
    NOTA: Esta etapa pode ser omitida se o pellet da célula for pequeno. Nesses casos, as células são ressuspensas diretamente no volume desejado de meio e, em seguida, combinadas com extrato de membrana basal (Matrigel) para minimizar a perda celular.
  13. Ressuspenda o pellet celular em um volume de RPMI 1640, equivalente à metade do volume final de injeção desejado. RPMI 1640 e Matrigel serão combinados em uma proporção de 1:1 v/v, com um volume final de injeção de 100 μL por local de injeção.
    NOTA: Para injeção bilateral em 4 camundongos, o volume total necessário é de 800 μL. Portanto, ressuspenda as células em pelo menos 400 μL de RPMI 1640. Para contabilizar a perda de volume potencial, é aconselhável adicionar mais 20% ao volume final, mantendo a relação 1:1 v/v. Alternativamente, DMEM ou 1x PBS podem ser usados no lugar do RPMI 1640.
  14. Conte as células ressuspensas usando um hemocitômetro ou método automatizado. Diluir conforme necessário para atingir a concentração desejada para a injeção. Sugere-se um ponto de partida de aproximadamente 1-2 milhões de células por local de injeção.
  15. Em um tubo de microcentrífuga de fundo redondo de 2 mL, combine a quantidade desejada de suspensão de células diluídas em RPMI com um volume igual de Matrigel. Misture suavemente a suspensão por pipetagem repetida para garantir a homogeneidade.
    NOTA: Seguindo a etapa anterior, adicione 400 μL de suspensão celular diluída a 400 μL de Matrigel. Considere o número de agulhas de injeção a serem usadas e considere as perdas de volume associadas. Mantenha Matrigel no gelo o tempo todo. Não descongele até que as células sejam ressuspensas, pois ele se solidificará rapidamente. Recomendado para manter pequenas alíquotas (por exemplo, 120 μL) para descongelamento rápido e combinação em tubo de 2 mL.
  16. Mantenha a suspensão celular congelada até estar pronta para a injeção.

2. Injeção ortotópica de almofada de gordura mamária inguinal de PDX dissociado

  1. Determine a massa de cada mouse usando uma balança calibrada. Aplique uma fina camada de creme depilatório no(s) local(is) de injeção alvo. Usando um cotonete estéril, massageie o creme alternadamente no sentido horário e anti-horário para facilitar a remoção rápida do pelo.
    1. Remova o excesso de pelo e o creme depilatório usando uma esponja de gaze estéril embebida em solução salina. Garanta a depilação completa na área de injeção.
      NOTA: Não exceda 60 s de exposição ao creme depilatório para evitar irritação da pele. Os ratos podem ser barbeados antes da aplicação do creme depilatório para minimizar ainda mais o tempo de exposição. Esta etapa pode ser realizada durante a dissociação do tumor para otimizar a eficiência do tempo e minimizar a duração do armazenamento da suspensão celular no gelo.
  2. Realize uma inspeção visual completa de cada camundongo para avaliar a aptidão para a injeção. Avalie quaisquer sinais de dor, angústia, doença ou outras contra-indicações.
  3. Usando uma seringa de 1 mL sem agulha acoplada, aspire suavemente a suspensão celular para cima e para baixo para garantir a homogeneidade. Coloque uma agulha de 26 G na seringa de 1 ml e retire o volume de injeção pretendido. Elimine quaisquer bolhas de ar da seringa batendo suavemente ou sacudindo suavemente.
    NOTA: Recomenda-se não exceder 600 μL por seringa para facilitar a injeção com uma mão.
  4. Coloque a seringa preparada horizontalmente em cima do recipiente de gelo, com a agulha orientada para longe do operador. Posicione o recipiente de gelo e a agulha do mesmo lado da mão dominante do operador ou da mão de injeção preferida. Remova o mouse de seu alojamento e desinfete a área de injeção usando uma almofada de limpeza com álcool.
  5. Contenha o mouse com segurança segurando a pele dorsal firmemente na nuca e nas costas. Garanta imobilização suficiente para expor claramente as bolsas de gordura mamárias. A almofada de gordura mamária inguinal se estende do mamilo até o topo do quadril. Pode ser observado como tecido macio e rosado na área descrita sob a pele.
    NOTA: Um operador assistente pode usar uma pinça de lado plano para beliscar e elevar a pele que contém a almofada de gordura. Essa técnica ajuda a garantir que o operador que realiza a injeção atinja com sucesso a almofada de gordura.
  6. Coloque o mouse em decúbito dorsal. Insira a agulha (chanfrar para cima) em um ângulo de 45 graus, apontando para o quadril aproximadamente 0,5-1 cm caudal à almofada de gordura, ajustando o comprimento da agulha.
    1. Avance a agulha para a almofada de gordura. De forma controlada, injetar o volume desejado de suspensão celular. A velocidade de injeção eficiente ajudará a minimizar a agitação animal devido à contenção prolongada.
      NOTA: Para minimizar o sofrimento do animal, a duração máxima da contenção manual contínua não deve exceder 30 s. Se a duração da contenção exceder 30 s, o animal deve ser solto na gaiola para se recuperar antes de uma segunda tentativa.
  7. Após a injeção, gire a agulha 180 graus (chanfro para baixo). Mantenha a posição da agulha brevemente antes de retirar lentamente para minimizar a perda de células do local da injeção. Se ocorrer algum sangramento, aplique gaze padrão ou gaze hemostática conforme necessário.
  8. Repita as etapas 2.6 e 2.7 para a bolsa de gordura contralateral se forem necessárias injeções bilaterais. Para vários animais, repita as etapas 2.2 a 2.7 conforme necessário.

3. Procedimentos de acompanhamento

  1. Descarte todos os objetos cortantes em recipientes designados para objetos cortantes. Descarte todos os outros conteúdos em recipientes de lixo adequados.
  2. Se ocorrer sangramento durante a injeção, monitore os camundongos por pelo menos 1 h depois para garantir a hemostasia.
  3. Monitore a massa corporal semanalmente. Avalie o volume do tumor quando o crescimento se tornar palpável.

Resultados

Este estudo descreve uma abordagem eficiente e não cirúrgica para o implante ortotópico de xenoenxertos de câncer de mama derivados de pacientes em camundongos. O tecido tumoral da mama foi dissociado usando enzimas humanas específicas e agitação mecânica, ressuspenso em uma proporção de 1:1 v/v de Matrigel: RPMI 1640 e injetado ortotopicamente nas bolsas de gordura mamárias inguinais de camundongos NSG (Figura 1 e Figura 2). Para garantir a fidelidade dos modelos PDX, a concordância da amostra original do tumor do paciente com os tumores passados foi validada com técnicas histopatológicas e genômicas estabelecidas. A expressão do receptor foi perfilada usando coloração imuno-histoquímica (IHC) de receptores padrão de câncer de mama, incluindo receptor de estrogênio (ER), receptor de progesterona (PR) e receptor do fator de crescimento epidérmico humano 2 (HER2) (Figura 3). A morfologia celular foi avaliada usando coloração de hematoxilina e eosina (H&E) de cortes tumorais seccionados e interpretação patologista especialista dos cortes corados. A preservação da paisagem genética e a retenção de células humanas foram validadas usando sequenciamento de RNA em massa e autenticação de repetição curta em tandem (STR) (Figura 4 e Tabela 1). Além disso, o teste de patógenos não identificou contaminação do paciente ou amostras de tumor passadas, o que é uma etapa de verificação essencial devido ao uso de camundongos imunodeficientes.

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Figura 1: Visão geral do protocolo. Representação do fluxo de trabalho de dissociação e injeção de tumores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os camundongos NSG foram preparados para injeção usando um creme depilatório aplicado em movimentos alternados no sentido horário e anti-horário para remover completamente o pelo da área da almofada de gordura mamária inguinal (Figura 2A). O excesso de creme depilatório foi limpo da pele abdominal exposta com gaze estéril e a área foi desinfetada com compressa com álcool (Figura 2B). Uma agulha estéril carregada com células tumorais dissociadas foi posicionada em um ângulo de aproximadamente 45 graus 0,5-1 mm caudal às bolsas de gordura mamária do quarto mamilo inguinal (Figura 2C). As células tumorais foram injetadas de forma controlada nas bolsas de gordura mamária do quarto mamilo inguinal (Figura 2D). O crescimento tumoral foi inicialmente detectado pela palpação digital das bolsas de gordura. Posteriormente, a progressão do volume tumoral foi rastreada quantitativamente por meio de ressonância magnética (RM) (Figura 2E). Tanto o peso corporal (Figura 2F) quanto os volumes tumorais (Figura 2G) foram medidos semanalmente para monitorar flutuações no peso e progressão dos volumes tumorais. Os tumores foram inspecionados visualmente para monitorar feridas como ulceração que exigiriam interrupção prematura. O enxerto bilateral bem-sucedido do PDX nas bolsas de gordura mamárias inguinais é mostrado na Figura 2H, e as bolsas de gordura após a excisão dos tumores são mostradas na Figura 2I.

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Figura 2: Preparação de camundongos, injeção de PDX e monitoramento da progressão do tumor. (A) As bolsas de gordura mamárias foram completamente depiladas. (B) Apresentação do local de injeção com visibilidade clara das áreas de injeção alvo. (C) Posição da seringa na almofada de gordura, normalmente 0,5-1 mm caudal à almofada de gordura, dependendo do comprimento da agulha. A seta branca indica a área alvo da agulha ao inserir. (D) Representação da injeção de células dissociadas na almofada de gordura mamária do quarto mamilo inguinal esquerdo. A agulha deve ser mantida em um ângulo de aproximadamente 45 graus, conforme mostrado para a injeção. (E) Imagem representativa de ressonância magnética de tumores enxertados bilateralmente no local da injeção. Os tumores são destacados em verde. (F) Progressão representativa dos pesos corporais em gramas após a injeção de células tumorais (n = 5). A linha azul escura representa a regressão linear simples, que é significativamente diferente de zero (p < 0,0001); Os camundongos ganharam, em média, 22 mg.dia-1. O sombreamento azul escuro é um intervalo de confiança de 95%, o sombreamento azul claro é um intervalo de previsão de 95% e as linhas laranja são medidas longitudinais do peso corporal. (G) Progressão representativa dos volumes tumorais individuais em mm3 após a injeção de células tumorais (n = 10). A linha azul escura representa regressão exponencial; O tempo de duplicação do volume tumoral foi de 19,08 dias. O sombreamento azul escuro é um intervalo de confiança de 95%, o sombreamento azul claro é um intervalo de previsão de 95% e as linhas laranja são volumes tumorais longitudinais. (H) Enxerto bilateral bem-sucedido de células PDX nas bolsas de gordura mamárias inguinais. Observe que a vascularização pode ser observada suprindo cada tumor. As setas brancas identificam os tumores. (I) A área do coxim adiposo mamário inguinal após a excisão de tumores. (H, I) As unidades na régua estão em cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O PDX representativo (PEN_056) originou-se de uma mulher caucasiana de 31 anos com carcinoma mamário invasivo estágio 3A. O tumor primário, coletado da mama direita, apresentava status de receptor de RE e PR negativo, HER2 positivo (ER-PR-HER2+). A coloração IHQ para receptores ER, PR e HER2 mostrou concordância entre o paciente e os tumores PDX (Figura 3). No entanto, o PDX mostra uma maior expressão de HER2, o que pode ser devido a um crescimento seletivo de células HER2+. A avaliação patologista dos cortes corados com H&E confirmou carcinoma pouco diferenciado com morfologia e citologia consistentes nas amostras do paciente e do PDX (Figura 3).

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Figura 3: Coloração do receptor IHC e H&E. (Coluna da esquerda) Coloração IHC dos receptores ER, PR e HER2 e coloração H&E no tumor do paciente. As colorações de RE e PR não mostram coloração positiva evidente, como esperado. As colorações de HER2 exibem positividade para HER2 (marrom). (Coluna da direita) Coloração IHC dos receptores ER, PR e HER2 e coloração H & E na amostra PDX passada. A coloração do receptor se assemelha muito à observada na amostra do paciente, embora o HER2 mostre maior expressão após a passagem. Barra de escala: 50 μm; Ampliação: 20x. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A genotipagem de repetição curta em tandem (STR) confirmou >80% de similaridade entre os 13 loci autossômicos definidos pelas diretrizes de consenso ASN-0002-2022 da American Type Cell Culture Collection (ATCC) mais 3 loci adicionais (Tabela 1). O sequenciamento de RNA em massa (RNA-seq) da amostra de tumor do paciente e o PDX confirmaram níveis equivalentes de alinhamento ao genoma de referência humano mais recente (T2T CHM13v2.0), com 82,3% e 79,1% de alinhamento de leituras, respectivamente. Além disso, o tumor do paciente e o PDX mostraram uma forte correlação positiva com um valor de r de Pearson de 0,9559 (Figura 4A). A análise de enriquecimento do conjunto de genes comparando PDX vs tumor do paciente revelou que as 10 principais vias significativamente enriquecidas de processos biológicos de ontologia gênica eram predominantemente conjuntos de genes imunológicos, sugerindo que a maior parte da variação transcricional entre PDX e tumor do paciente deriva da falta de células imunes na amostra PDX (Figura 4B).

D5S818D13S317D7S820VWATH01SOUem TPOXCSF1POD3S1358D21S11D18S51Penta_EPenta_DD8S1179FGA
Tumor do paciente12
13		8
8		8
9		17
17		9
9.3		X
X		8
10		15
16		29
31.2		16
19		12
13		14
14		10
14		21
25
Tumor PDX13
14		8
8		8
9		17
17		9
9.3		X
X		10
10		15
15		29
29		16
19		12
13		14
14		10
14		21
25

Tabela 1: Autenticação de repetição curta em tandem (STR).

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Figura 4: Correlação de sequenciamento de RNA e enriquecimento do conjunto de genes. (A) Gráfico de dispersão visualizando as contagens normalizadas log2 por milhão (CPM) para todos os genes do tumor do paciente (eixo x) e PDX (eixo y). Foi encontrada uma forte correlação positiva, com um valor de r de Pearson de 0,9559. (B) Gráficos de crista para os 10 principais conjuntos de genes de processos biológicos de ontologia de genes enriquecidos ao comparar PDX vs. tumor do paciente. As curvas descrevem a distribuição da pontuação de enriquecimento para cada conjunto de genes; color representa o valor q de FDR para cada conjunto de genes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este artigo apresenta um método eficiente e de alto rendimento para implantar ortotopicamente BC PDXs nas bolsas de gordura mamárias inguinais de camundongos imunodeficientes. Esse fluxo de trabalho otimizado permite que um único pesquisador implante PDXs em dezenas de camundongos por dia, apoiando estudos em larga escala e com poder adequado. A capacidade de dissociar e implantar simultaneamente vários PDXs exclusivos também permite abordagens oncológicas de precisão. Além da eficiência do tempo, a dissociação dos tumores cria uma suspensão homogênea de tipos de células que é distribuída uniformemente entre os camundongos. Em nossa experiência, essa homogeneidade contribui para taxas consistentes de enxerto e crescimento tumoral.

Embora geralmente eficaz, este protocolo pode exigir modificações em determinados cenários. Por exemplo, o tempo de execução padrão de 1 h no dissociador mecânico ocasionalmente se mostra insuficiente para a dissociação completa do tecido tumoral. Enquanto segura firmemente o tubo C, mova-o para baixo várias vezes para acumular qualquer tecido perdido no fundo. Se fragmentos de tecido visíveis permanecerem, continue a dissociação e inspecione novamente em intervalos de 15 minutos. É importante observar que alguns tecidos, particularmente o tecido fibroso ou adiposo, podem resistir à dissociação e exigir remoção manual para evitar o entupimento da agulha durante a injeção.

Recomendamos o uso da agulha de menor calibre possível (27 G ou 26 G) para minimizar o sofrimento animal e reduzir o risco de refluxo celular do local da injeção, o que pode afetar o sucesso do enxerto e as taxas de crescimento do tumor. No entanto, se o tecido não dissociado ou os fragmentos adiposos permanecerem, uma agulha de calibre maior (16 G ou 18 G) pode ser necessária, embora com riscos aumentados de sangramento ou perda celular. Independentemente do calibre da agulha selecionado, a proficiência no manuseio do animal é o componente mais importante na realização das injeções de forma eficaz. Nenhuma anestesia é usada neste protocolo e, embora isso economize tempo, também permite que o animal tenha um grau de mobilidade quando as injeções estão sendo realizadas. Se a contenção adequada não for alcançada ao se desembaraçar, movimentos abruptos dos membros podem causar punção dos vasos, a criação de uma ferida de saída que impede a retenção celular ou punções na parede abdominal. A prática suficiente de injeção é fortemente recomendada antes de injetar células valiosas.

A técnica de dissociação descrita é altamente transferível e pode ser empregada na implantação de vários outros tipos de tumores para modelos ortotópicos e subcutâneos. No entanto, pelo menos no contexto do CM, o implante subcutâneo deve ser evitado. A injeção ortotópica de BC PDX resulta em vascularização superior do tumor enxertado do hospedeiro em comparação com o subcutâneo, e o implante de coxim gorduroso inguinal leva a maiores taxas de enxerto do que o coxim gordurosotorácico 11. Além disso, os PDXs implantados ortotopicamente têm um tempo de enxerto mais curto e uma taxa de crescimento mais rápida em comparação com as injeções subcutâneas12. Também deve ser observado que, embora a dissociação facilite a injeção rápida de células tumorais, ela inerentemente resulta na perda do contexto célula a célula; portanto, pode não ser uma abordagem apropriada em todos os casos. Para casos que exigem interação celular autêntica (por exemplo, transcriptômica espacial dos tumores), a injeção de pedaços de tumor picados ou a implantação de fragmentos podem ser preferidas.

Embora essencial para estudos de PDX, o uso de camundongos imunodeficientes apresenta certas limitações. Do ponto de vista logístico, é necessário um ambiente totalmente estéril, incluindo moradia, comida e água. Isso requer ainda áreas de alojamento dedicadas para animais imunodeficientes para reduzir o risco de infecção, aumentando potencialmente os custos de alojamento. Essa maior suscetibilidade a infecções é o motivo pelo qual uma etapa de incubação de antibióticos para os fragmentos tumorais é sugerida antes da dissociação. No entanto, alguns estudos têm mostrado que o uso de antibióticos em cultura celular leva a alterações nos perfis de expressão gênica13. Diante disso, os pesquisadores devem avaliar o uso de antibióticos para cada estudo. Embora a ausência efetiva de um sistema imunológico permita que os PDXs sejam enxertados, ela também impede o estudo dos numerosos efeitos do sistema imunológico na progressão do CM14.

Este método demonstra alta fidelidade às amostras de tumor do paciente. A autenticação histopatológica confirmou a concordância do PDX passado em relação à amostra de tumor do paciente, como esperado. O alto alinhamento das leituras com o genoma humano sugere fortemente que o PDX mantém uma alta porcentagem de células humanas após a passagem. Isso é ainda apoiado pela semelhança de >80% nos perfis STR e forte correlação positiva nos dados de RNA-seq entre o tumor do paciente e o PDX. As adaptações moleculares nos tecidos periféricos de camundongos PDX após o crescimento do tumor de mama também são consistentes com as adaptações moleculares em pacientes humanos com CM. As análises proteômicas e de RNA-seq em massa dos músculos esqueléticos de camundongos BC PDX são surpreendentemente concordantes com as alterações moleculares nas biópsias musculares obtidas de pacientes diagnosticados com BC em estágio inicial 6,7. Coletivamente, a semelhança do perfil STR e RNA-seq, juntamente com adaptações consistentes em tecidos periféricos, fornece dados convincentes para o uso de camundongos BC PDX em ensaios pré-clínicos.

Divulgações

Os autores declaram que não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer as generosas contribuições dos pacientes que forneceram amostras de tumor para o desenvolvimento de PDXs. Emidio Pistilli reconhece as contribuições anteriores significativas de Hannah Wilson, MD / PhD. Esta pesquisa foi apoiada pelas seguintes organizações: Institutos Nacionais de Artrite, Doenças Musculoesqueléticas e de Pele (NIAMS) sob o número de concessão R01AR079445 (Pistilli); o WVU Genomics Core Facility (U54GM104942); o WVU Animal Model and Imaging Facility (P20GM121322, U54GM104942, P20GM144230, P30GM103488); Institutos Nacionais de Ciências Médicas Gerais sob o número de prêmio P20GM121322 (Lockman). A Figura 1 foi criada com BioRender.com.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 mL de seringa de tuberculinaBD305945estéril
1x solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4Gibco10010023estéril
2,0 mL tubo de microcentrífuga de fundo redondoEppendorf0030123620agulha estéril
de 26 G, ½ pol.BD305111microtubo estéril
5,0 mLEppendorf0030119401estéril
NSG de 8+ semanas (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) TheJackson Laboratory#005557
Almofadas de preparação de álcoolFisher Scientific22-363-750extrato estéril
de membrana basal (Matrigel)Cultrex3632-005-02
Aplicadores com ponta de algodão, 6 pol.Fisher Scientific22-029-553
fórceps curvo estéril com pontas médias não serrilhadas, 152 mmMicroscopia eletrônica Sciences50-365-845
creme depilatórioNair
gentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo dissociador com aquecedoresMiltenyi Biotec130-096-427
Lâminas de bisturi nº 10Fisher Scientific12-000-162esponjas de
gaze não tecidas estéreis, 4x4 polegadasFisher Scientific22-028-558estéril
RPMI 1640 1x + L-GlutaminaGibco11875093estéril
Kit de dissociação de tumor, humanoMiltenyi Biotec130-095-929
de estéril

Referências

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