Artigo de método

Modelo de reprogramação de macrófagos derivados de monócitos humanos para ensaios in vitro

DOI:

10.3791/67651

⸱

18 de abril de 2025

 , 
1Instituto de Medicina Experimental (IMEX), Academia Nacional de Medicina-CONICET, 2Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires

Neste artigo

Resumo

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Monócitos e macrófagos são células imunes muito plásticas e reprogramáveis, cruciais para a saúde e a doença. Eles sentem e respondem a uma ampla gama de estímulos adotando programas de diferenciação e fenótipos específicos. Padronizamos um modelo in vitro para estudar a polarização e reprogramação de macrófagos, fornecendo uma ferramenta valiosa para pesquisa.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células da linhagem monócitos-macrófagos são multifuncionais e encontradas em quase todos os tecidos do corpo. Eles coordenam as fases de iniciação e resolução da imunidade inata e adaptativa, afetando significativamente a imunidade protetora e a lesão patológica imunomediada. Embora os macrófagos residentes no tecido sejam atores-chave na manutenção da homeostase em estado estacionário, grandes quantidades de monócitos são recrutadas do sangue periférico para o tecido após danos ou insultos inflamatórios. Os macrófagos derivados de monócitos (M-DM) podem se diferenciar em muitos subtipos dinâmicos, e seus fenótipos e funções dependem do ambiente tecidual local.

Para comparar diferentes estímulos ou condições ambientais durante a diferenciação e polarização do M-DM, padronizamos um modelo in vitro de M-DM M0 humano não polarizado e alguns macrófagos polarizados por citocinas cardinais, M1 derivado de IFNγ/LPS, M2a derivado de IL-4 e M2c derivado de IL-10 ou dexametasona, para analisar a reprogramação enviesada de M-DM por citometria de fluxo e PCR em tempo real. Descobrimos que CD64, CD206, CD163, CD14 e MERTK podem discriminar claramente M0 não polarizado e M1, M2a e M2c polarizados por citometria de fluxo. Além disso, definimos IRF1 e CXCL10 como genes específicos para transcritos específicos clássicos de M1, IRF4, CCL22 e TGM2 derivados de IFNγ / LPS para M2a derivado de IL-4 e o gene MERTK para M2c derivado de dexametasona. Para resumir, nosso protocolo M-DM padronizado pode fornecer o mapa cardinal in vitro para analisar a diferenciação e polarização do M-DM humano sob diversos estímulos.

Introdução

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Os macrófagos, identificados pela primeira vez por Metchnikoff por sua capacidade fagocítica, são células antigas fundamentais para a vida dos metazoários. Encontrados de forma ubíqua em mamíferos adultos, eles exibem notável diversidade anatômica e funcional. Como parte do sistema fagocítico mononuclear, ao lado das células dendríticas e monócitos, os macrófagos desempenham papéis cruciais em vários processos biológicos, desde o desenvolvimento e homeostase até as respostas imunes contra patógenos1,2. Macrófagos residentes, especializados em seus microambientes teciduais, atuam como sentinelas, monitorando a saúde dos tecidos e respondendo a mudanças fisiológicas e ameaças externas. Acredita-se que sua plasticidade limitada seja uma adaptação evolutiva para manter a homeostase do tecido. Em contraste, os monócitos recrutados são mais flexíveis e podem se diferenciar em diversos fenótipos de macrófagos durante a inflamação. Essa dupla influência da inflamação e do nicho tecidual molda a diversidade funcional dos macrófagos3. Assim, dependendo do meio tecidual local, os macrófagos derivados de monócitos (M-DM) podem se diferenciar em muitos subtipos. Os metabólitos locais, fatores de crescimento, citocinas e interação célula-célula4,5,6 descrevem seus fenótipos e funções. Além disso, os macrófagos são os principais produtores de fatores que amortecem a inflamação e impulsionam a revascularização e o reparo tecidual7,8.

Dado que pelo menos três braços principais controlam a polarização (condições extrínsecas, intrínsecas e de ambiente tecidual), a polarização de macrófagos deve ser vista como multidimensional2. Os principais obstáculos e armadilhas na descrição da diferenciação e polarização de macrófagos são as condições experimentais heterogêneas em toda a literatura e a falta de consenso na definição de termos de macrófagos em experimentos in vitro e in vivo9. No entanto, alguma unificação de padrões experimentais começou para diversos cenários experimentais.

Para entender melhor o campo de macrófagos humanos, precisamos de modelos in vitro padronizados e bem definidos de M-DM para ligação, diferenciação, polarização, fenótipo e reprogramação, bem como funções específicas. Nosso objetivo foi definir um modelo in vitro padronizado de M-DM M0 humano não polarizado e macrófagos polarizados por citocinas para estudar a reprogramação enviesada de M-DM por citometria de fluxo e PCR em tempo real. Embora a polarização de macrófagos seja um processo dinâmico devido à sua alta plasticidade e capacidade de integrar múltiplos sinais de seu ambiente, caracterizamos aqui o M-DM não polarizado (M0) e alguns estados de polarização in vitro, como o pró-inflamatório clássico, comumente reconhecido também como M1, induzido com IFNγ e LPS. Da mesma forma, o reparo tecidual e os macrófagos M2 reguladores podem ser definidos como M2a quando induzidos com IL-4 e M2c quando estimulados com dexametasona ou IL-10. Esses estados polarizadores capturam um instantâneo do amplo espectro do meio M-DM no tempo e no espaço, mas nos dão alguns pontos cardeais para definir o mapa analítico onde localizar as condições de teste.

Apesar da combinação complexa e dinâmica de marcadores de superfície e programas transcricionais, ao analisar in vitro o M-DM, estabelecemos que CD64, CD206, CD163, CD14 e MERTK podem separar a condição M0 não polarizada de M1 induzida por IFNγ/LPS, M2a induzida por IL-4 e IL-10 ou induzida por dexametasona por citometria de fluxo. Além disso, a expressão dos genes IRF1 e CXCL10 foi definida como específica para M1 induzida por IFNγ / LPS; Transcritos específicos de IRF4, CCL22 e TGM2 para M2a derivado de IL-4; e gene MERTK para M2c derivado de dexametasona, estabelecendo pontos cardeais adicionais para comparar a reprogramação distorcida de M-DM desafiada com diferentes estímulos ou mesmo co-cultivada com outros tipos de células.

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Protocolo

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Todos os doadores de sangue voluntários saudáveis assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional da Academia Nacional de Medicina (IMEX-CONICET-ANM) Argentina. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e reagentes usados neste protocolo.

1. Isolamento de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs)

NOTA: As PBMCs são isoladas de 40 mL de sangue periférico anticoagulado com citrato de sódio a 3,8% e usando centrifugação com gradiente de densidade Ficoll-Hypaque (1077). Este protocolo é realizado em condições estéreis em um gabinete de biossegurança BSL2.

  1. Transfira a amostra de sangue periférico anticoagulado recebida para tubos apropriados de 15 mL ou 50 mL para centrifugação.
  2. Centrifugue amostras de sangue a 200 × g por 15 min (aceleração: 4 desaceleração: 2, quando o máximo é 5) à temperatura ambiente para obter plasma rico em plaquetas (PRP) na parte superior e fração celular, incluindo glóbulos vermelhos e brancos abaixo. Consulte Figura 1.
  3. Transferir a fração superior (PRP) para tubos de 15 ml (se for armazenado plasma) e centrifugar a 600 × g durante 10 min (aceleração e desaceleração máximas) para obter a fração plasmática final sem plaquetas. Armazenar o plasma a -20 °C.
  4. Diluir a fração celular obtida na primeira centrifugação, 2x (mínimo) a 3x (máximo) usando solução salina estéril 1x tamponada com fosfato (1x PBS) pré-aquecida à temperatura ambiente. Homogeneizar suavemente e utilizar esta fracção diluída para a centrifugação do gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque.
  5. Transfira 15 mL de Ficoll-Hypaque para um tubo estéril de 50 mL. Em seguida, adicione cuidadosa e lentamente 30 mL de sangue diluído em cima do Ficoll, evitando misturar as fases. Se estiver trabalhando com 10 mL ou menos de sangue diluído, transfira 4 mL de Ficoll-Hypaque para um tubo de 15 mL e, em seguida, adicione os 10 mL de amostra de sangue diluído.
    NOTA: Esta etapa é crítica para obter a fração mononuclear.
  6. Centrifugar o tubo que contém o Ficoll mais sangue diluído a 600 × g durante 25 min (aceleração: 1; Desaceleração: 0) à temperatura ambiente.
  7. Remova um pouco da camada superior amarela com uma pipeta Pasteur estéril de 3 mL. Em seguida, colete cuidadosamente a interface (fração mononuclear do "anel") formada entre a camada superior amarela e a camada Ficoll com uma pipeta Pasteur estéril. Este "anel" contém as células mononucleares (PBMC) de interesse.
    NOTA: Parte da fase plasmática restante pode ser coletada, mas certifique-se de evitar a fase Ficoll, pois pode ser tóxica para os PBMCs.
  8. Transfira os PBMCs coletados para um novo tubo de 15 mL contendo um mínimo de 3 mL de PBS 1x estéril. Em seguida, complete com o volume correspondente de 1x PBS estéril para 12-15 mL. Centrifugar os PBMCs a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) durante 10 min.
  9. Rejeitar o sobrenadante e lavar novamente os PBMC. Ressuspenda o pellet celular adicionando 1 mL de 1x PBS estéril e, em seguida, complete até 12-14 mL com 1x PBS estéril adicional. Centrifugar os tubos a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) durante 10 min.
  10. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet PBMC em 1x PBS estéril contendo 2% de soro fetal bovino inativado (1x PBS-2% FBS) e aumente o volume para 10 mL. Use um contador automático de células ou conte as células, preparando uma suspensão de células 1:5 diluída em frio estéril 1x PBS e depois (1:2) em Trypan Blue para obter uma diluição final de 1:10. Use um microscópio óptico para contar.
  11. Gire a suspensão PBMC a 300 × g por 5 min a 8-10 ° C. Ressuspenda as células em um volume desejado de 1x PBS-2% FBS estéril e frio para obter uma concentração final de 108 células / mL. Deixe essas células a 4 °C até a próxima etapa.
    NOTA: Se os PBMCs coletados não forem usados no mesmo dia, recomenda-se congelar em um frasco criogênico a 108 células / mL em meio de congelamento apropriado (90% de FBS contendo 10% de dimetilsulfóxido, DMSO). Armazene a -80 °C em um recipiente de polietilenoglicol durante a noite para permitir que as células congelem lentamente, minimizando assim os danos celulares. No dia seguinte, transfira as células para uma caixa de armazenamento e deixe-as a -80 °C por alguns dias ou transfira para um tanque de nitrogênio líquido por um longo período de armazenamento.

2. Classificação de monócitos CD14+ usando esferas magnéticas

NOTA: A quantidade de monócitos CD14 encontrados em PBMCs de doadores saudáveis é variável dependendo da idade e sexo. Quando disponível, use um contador de células para obter a % de monócitos em cada amostra e, em seguida, calcule o número de PBMCs necessários para classificar os monócitos CD14 necessários. Se nenhum contador de células estiver disponível, 10% de monócitos por amostra PBMC pode ser considerado uma abordagem ampla4,6,7,10,11,12,13.

Os monócitos CD14+ são isolados usando um kit de seleção positiva CD14 humana5. Padronizamos o protocolo de isolamento usando 1 a 2 × 107 PBMCs em 100 μL de reação; Use essa proporção para números mais altos. O volume mínimo de reação sugerido é de 100 μL, mesmo com um número de células inferior a 1 × 107 PBMCs.

  1. Prepare a suspensão de células PBMC na concentração de 1-2 × 108 células/mL em 1x PBS-2% FBS contendo 1 mM de tampão de ácido etilenodiaminotetracético (1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA) e transfira a quantidade desejada de PBMCs para um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL.
  2. Adicione 10 μL de Coquetel de Seleção Positiva para cada 100 μL de suspensão celular, misture bem e incube em temperatura ambiente por 15 min.
  3. Adicione 10 μL de nanopartículas magnéticas por 100 μL de suspensão celular, pipete vigorosamente para cima e para baixo mais de 5x para suspender uniformemente as nanopartículas magnéticas e incube em temperatura ambiente por 10 min.
    NOTA: O vórtice não é recomendado.
  4. Adicione 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA tampão para aumentar o volume total da suspensão celular para 2,5 mL. Pipete suavemente as células do tubo para cima e para baixo 2-3x. Insira o tubo no classificador magnético e separe-o por 5 min.
  5. Pegue o ímã e inverta-o e o tubo em um movimento contínuo, descartando a fração sobrenadante. As células marcadas magneticamente permanecerão dentro do tubo. Deixe o ímã e o tubo invertidos por 2-3 s e, em seguida, gire-os verticalmente na vertical.
    NOTA: Deixe todas as gotas penduradas na boca do tubo; não os agite ou seque.
  6. Remova o tubo do ímã e adicione 2.5 mL de 1x PBS-2% FBS-1 mM EDTA tampão no tubo novamente. Pipete suavemente a suspensão celular para cima e para baixo 2-3x para misturá-la. Insira o tubo de volta no ímã e separe-o por 5 min.
  7. Em um movimento contínuo, inverta o ímã e o tubo, descartando a fração sobrenadante. Remova o tubo do ímã e ressuspenda as células em uma quantidade adequada de 1x tampão PBS-2% FBS (sem EDTA). As células selecionadas positivamente agora estão prontas para uso.
    NOTA: Um total de duas separações de 5 minutos são necessárias no ímã.
  8. Lave as células CD14 classificadas empregando 1x tampão PBS-2% FBS, trazendo a suspensão celular para 12-14 mL para diluir qualquer EDTA restante e, em seguida, centrifugue a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) por 10 min.
  9. Descarte o sobrenadante e repita a lavagem ressuspendendo o pellet celular com 1 mL de 1x tampão PBS-2% FBS primeiro e depois completando o volume para 12-14 mL. Centrifugar os tubos a 600 × g (aceleração e desaceleração máximas) durante 10 min.
  10. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os monócitos CD14 selecionados positivos em 2 mL de tampão PBS-2% FBS 1x. Use o contador automático de células ou conte as células diluindo a suspensão celular (1:5) em frio estéril 1x PBS e depois (1:2) em Trypan Blue usando um microscópio óptico. Deixe as células no gelo até o preparo da cultura.
    NOTA: A pureza celular pode ser testada por citometria de fluxo, pegando 50 μL da suspensão celular e colorando-a para células CD14+ (clone HCD14). Recomenda-se mais de 90% de pureza.
  11. Para cultura, gire a suspensão celular a 300 × g por 5 min a 8-10 ° C. Ressuspenda o pellet na concentração de 106 células / mL usando RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS inativado e 1% de penicilina-estreptomicina (RPMI-10% FBS-1% P / S).
    NOTA: É fundamental usar um FBS de alta qualidade, com baixo teor de endotoxinas e inativado pelo calor. Mantenha sempre no gelo para evitar a aderência dos monócitos à parede de plástico antes de revestir.

3. Diferenciação e polarização de macrófagos derivados de monócitos (M-DM)

NOTA: A cultura M-DM é realizada por plaqueamento de 2,5 × 105 monócitos CD14+ em placas de 48 poços contendo 500 μL de RPMI-10% FBS-1% P/S e cultivado em uma incubadora umidificada a 37 °C com CO2 (5%) por 7 dias. Escolha placas tratadas para aumentar a aderência dos monócitos à placa.

  1. Defina todas as condições experimentais a serem executadas, incluindo poços para M-DM basal (M0), o M1 inflamatório, o reparo tecidual M2a, o M2c regulador e as condições de teste desejadas.
  2. Pipetar 250 μL da suspensão celular preparada na etapa 2.11 para semear 2,5 ×10 5 monócitos CD14+ em cada poço.
  3. Adicione 250 μL de RPMI-10% FBS-1% P/S mais 50 ng/mL de M-CSF a cada poço para completar os 500 μL de volume total.
  4. Incubar a placa de cultura de células em uma incubadora umidificada a 37 °C com 5% de CO2 por 4 dias para permitir a primeira etapa da diferenciação de macrófagos.
    NOTA: Verifique periodicamente a diferenciação da cultura de células para ver se ocorreram alterações morfológicas conforme o esperado ou se existem células indesejadas não anexadas.
  5. Substitua metade do meio de cultura (250 μL de RPMI-10% FBS-1% P/S) no dia 4 da cultura M-DM. Adicione citocinas ou reagentes para as condições polarizantes e cultive-os por 3 dias (o ponto final é o dia 7): LPS (1 ng/mL) mais IFNγ (50 ng/mL) para M1, IL-4 (40 ng/mL) para M2a, IL-10 (50 ng/mL) ou dexametasona (0,1 μM) para M2c.
  6. Colha M-DM no dia 7 para realizar a caracterização fenotípica, colete-os para expressão de mRNA conforme indicado nas próximas duas etapas ou realize um ensaio funcional.

4. Caracterização do fenótipo de superfície em M-DM polarizado por citometria de fluxo

  1. Descarte o volume total do meio de cultura (500 μL de uma placa de 48 poços) e adicione 200 μL de 1x tampão PBS-2% FBS-1 mM EDTA para coleta de células. Incube por 20 min no gelo e, em seguida, adicione 200 μL de 1x PBS-2% FBS para diluir o tampão EDTA. Colete o M-DM pipetando para cima e para baixo em microtubos de 1,5 mL. Lave essas células colhidas uma vez com 1x PBS-2% FBS e centrifugue a 800 × g por 3 min.
  2. Ressuspenda o pellet M-DM com 200 μL de PBS-5% FBS 1x e transfira-os para uma microplaca de fundo redondo de 96 poços para bloqueio à temperatura ambiente por 15 min. Centrifugue as células a 800 × g por 3 min.
  3. Prepare a combinação apropriada de anticorpos diretamente conjugados em 1x PBS- 2% FBS. Manchar cada alvéolo ou condição (1x) com 50 μL do painel de anticorpos e incubar a 4 °C durante 30 min no escuro.
    NOTA: Aqui, o painel de anticorpos consistiu em CD11b-APC / Cy7, CD64-APC, CD163-PerCP / Cy5.5, CD206-AlexaFluor 488, CD14-PECy7 e MERTK-biotina mais estreptavidina-PE. A concentração de anticorpos titulados está listada na Tabela 1.
  4. Lave o M-DM corado adicionando 150 μL de 1x PBS e centrifugue a 800 × g por 3 min.
  5. Para medir a viabilidade celular, adicione 100 μL do corante de viabilidade fixável Zombie Violet (1:1.000 em 1x PBS) e incube a 4 °C por 30 min no escuro.
  6. Lave as células coradas adicionando 100 μL de 1x PBS e centrifugue a 800 × g por 3 min. Repita o procedimento de lavagem usando 200 μL de 1x PBS.
  7. Fixe ressuspendendo o pellet M-DM com 100 μL do reagente fixador (do kit fixador/permeabilização) e incubando-os por 20 min no gelo e no escuro.
    NOTA: Para obter a fixação adequada, é essencial homogeneizar o pellet celular corretamente.
  8. Lave o M-DM adicionando 100 μL de 1x PBS-2% FBS e centrifugue a 800 × g por 3 min. Repita o procedimento de lavagem usando 200 μL de 1x PBS-2% FBS.
  9. Ressuspenda o pellet M-DM em 200 μL de 1x PBS e execute as células coradas no citômetro de fluxo.

5. Perfil do programa genético para discriminar a polarização M-DM por qPCR

NOTA: No dia 7 da cultura, 2,5 ×10 5 M-DM podem ser colhidos usando o reagente de extração de RNA para o isolamento de RNA total de alta qualidade. O isolamento de RNA também pode ser realizado usando métodos alternativos, como extração de RNA baseada em coluna e um kit de eluição.

  1. Rejeitar o volume total do meio de cultura e o M-DM lisado adicionando directamente 350 μL do reagente de extracção. Homogeneizar e transferir esta suspensão celular para um microtubo livre de RNase / DNase de 1,5 mL e continuar com o isolamento de RNA.
    NOTA: Se o isolamento de RNA não for realizado no mesmo dia, a amostra da etapa 5.1 pode ser armazenada a 4 ° C durante a noite ou -20 ° C por até um ano.
  2. Para permitir a dissociação completa do complexo de nucleoproteínas, incubar as amostras homogeneizadas da etapa 5.1 durante 5 min a 25 °C
  3. Adicionar 70 μL de clorofórmio a cada amostra. Tampe bem cada tubo para evitar vazamentos e misture bem o conteúdo agitando o tubo. Incubar as amostras durante 2-3 min e, em seguida, centrifugar as amostras a 12.000 × g durante 15 min a 4 °C. Esta etapa separará totalmente as fases em uma fase inferior de fenol-clorofórmio, uma interfase e uma fase aquosa superior incolor.
    NOTA: O volume de clorofórmio é baseado em uma proporção de 0,2 mL de clorofórmio por 1 mL de reagente de extração usado durante a etapa de lise.
  4. Transferir a fase aquosa contendo o RNA para um novo microtubo livre de RNase/DNase de 1,5 mL.
    NOTA: Deixe para trás um pequeno volume ao tomar a fase aquosa para evitar a transferência de qualquer uma das camadas interfásicas ou orgânicas.
  5. Adicione 175 μL de isopropanol a cada amostra para precipitar o RNA. Incubar por 10 min a 4 °C ou, alternativamente, durante a noite a -20 °C.
    NOTA: O volume de isopropanol é baseado em uma proporção de 0,5 mL de isopropanol por mL de reagente de extração inicial.
  6. Centrifugar as amostras a 12.000 × g durante 10 min a 4 °C. Um pellet branco semelhante a um gel de RNA total precipitará no fundo do tubo. Remova e descarte cuidadosamente o sobrenadante usando uma micropipeta.
  7. Lave o RNA ressuspendendo o pellet branco em forma de gel em 350 μL de etanol a 75% (1 mL por 1 mL de reagente de extração (v / v) usado para lise).
    NOTA: O RNA pode ser armazenado em etanol a 75% por até 1 ano a -20 °C ou até 1 semana a 4 °C.
  8. Agitar brevemente o sedimento ressuspenso e centrifugar a 7.500 × g durante 5 min a 4 °C. Retirar e eliminar o sobrenadante com uma micropipeta. Seque ao ar ou aspire o pellet de RNA por 5-10 min.
    NOTA: Para solubilizar o RNA, evite o ressecamento do pellet de RNA.
  9. Ressuspenda o pellet em 20-30 μL de água livre de RNase pipetando para cima e para baixo. Incubar em banho-maria ou bloco de calor a 55-60 °C durante 10-15 min. Prossiga para medir a concentração de RNA e armazene o RNA a -70 °C.
  10. Realize a transcrição reversa (cópia de cDNA) usando 100-500 ng de RNA (mínimo e máximo, respectivamente) em 20 μL de volume de reação, empregando um kit de síntese de cDNA.
  11. Execute as reações de PCR em tempo real usando 1 μL de cDNA (5-25 ng).
    1. Prepare a mistura de reação para cada tubo (1x) usando 5 μL de mistura verde SYBR (2x), 0,2 μL de cada primer (direto e reverso) e 3,6 μL de água livre de nuclease. Dimensione todos os componentes de acordo com o número da amostra. Misture bem a mistura de reação e dispense 9 μL em cada tubo de qPCR e, finalmente, 1 μL de cDNA para atingir o volume total final de 10 μL.
    2. Programe o protocolo de ciclagem térmica em um instrumento de PCR em tempo real da seguinte forma: 2-3 min a 98 °C (1x); 5-15 s a 98 °C mais 15-30 s a 60 °C (35-40x); por fim, inclua a análise da curva de fusão (65-95 °C) com incremento de 0,5 °C a 2-5 s/passo ou use a configuração padrão do instrumento.
      NOTA: Esta reação foi padronizada empregando a mistura universal SYBR Green. Os primers recomendados para análise de polarização M-DM estão listados na Tabela 2.
  12. Normalizar os resultados utilizando como gene de referência o fator de alongamento da tradução eucariótica 1 alfa 1 (EEF1A1), e verificar a especificidade dos produtos amplificados através da análise das curvas de dissociação.
    NOTA: A análise da curva de dissociação permite confirmar a presença de apenas um produto de amplificação de qPCR na reação.

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Resultados

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Com base em nosso trabalho na caracterização de macrófagos por vários anos, estabelecemos uma combinação precisa de marcadores que distingue claramente os diferentes subconjuntos de M-DM in vitro. Os marcadores fenotípicos foram selecionados com base na literatura e em uma ampla triagem prévia que havíamos realizado anteriormente9,14,15,16,17. Além di...

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Discussão

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A diferenciação, ativação e polarização de macrófagos tornaram-se um foco central na imunologia, homeostase tecidual, patogênese da doença e resolução da inflamação. Além disso, a imagem emergente de que os macrófagos teciduais podem ser derivados de monócitos circulantes sob condições de homeostase interrompida enfatiza a necessidade de modelos M-DM precisos caracterizados por fenótipos definidos, programas transcricionais e vias de ativação.

Algumas etapas críticas deste protocolo devem ser ...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Agência Nacional de Promoção da Ciência e Tecnologia (ANPCyT-FONCYT) por meio das bolsas PICT 2018-3070 e 2021-I-A-00807 para E.A.C.S. e PICT 2021-I-A-00716 para AEE, e pelo Conselho Nacional de Pesquisas Científicas e Técnicas (CONICET) por meio da bolsa PIP 2022-0763 e pela Universidade de Buenos Aires por meio de Projetos de Investigação e Desenvolvimento em Áreas Estratégicas com Impacto Social (PIDAE) 2022 para A.E.E., E.A.C.S. e A.E.E. são investigadores de carreira no CONICET.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Alexa Fluor 488 mouse anti-humano  CD206 Clone de anticorpo 15-2BioLegend, San Diego, CA, EUA.Gato# 321113; RRID: AB_571874
APC camundongo anti-humano CD64 Anticorpo clone 10.1BioLegend, San Diego, CA, EUA.Gato# 305013; RRID: AB_1595539
APC / Cy7 rato anti-camundongo / clone de anticorpo CD11b humano M1 / 70BioLegend, San Diego, CA, EUA.Gato# 101226; RRID:AB_830642
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, San Jose, CA, EUACat# 554714kit de fixação/permeabilização
Biotina anti-humano MERTK Anticorpo clone 590H11G1E3BioLegend, San Diego, CA, EUA.Gato# 367616; RRID:AB_2721500 
Equipamento CFX-Connect Bio-Rad, Hercules, CA, EUA
Kit de Seleção Positiva CD14 Humano EasySep; Coquetel de Seleção Positiva EasySep; Nanopartículas magnéticas EasySep; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Vancouver, CanadáCat# 18058
FACS Citômetro Canto Becton Dickinson, Franklin Lakes, Nova Jersey, EUA.
Soro Fetal Bovino, qualificado, Nova Zelândia Gibco™   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA EUA 		Cat# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare - Ciências da Vida, EUACat# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
kit de síntese de cDNA iScript, inclui mistura de reação de transcrição reversa 5x, transcriptase reversa iScript, água livre de nucleaseBio-Rad, Hercules, CA, EUACat# 1708891
Partec CyFlow citômetro espacial Sysmex Partec, Alemanha
PE StreptavidinBioLegend, San Diego, CA, EUA.Cat# 405203
PE/Cy7 camundongo anti-humano CD14 Anticorpo clone HCD14 BioLegend, San Diego, CA, EUA.Gato# 325618; RRID: AB_830691
PerCP / Cy5.5 clone de anticorpo CD163 humano GHI / 61BioLegend, San Diego, CA, EUA.Gato# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 Médio Gibco™   Thermo Fisher Scientific
Waltham, MA EUA 		Cat# 11875119
SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, contém fusió Sso7d de arranque a quente mediado por anticorpos; n polimerase, dNTPs, MgCl2, corante SYBR Green I, intensificadores, estabilizadores e uma mistura de corantes de referência passivos (incluindo ROX e fluoresceína).Bio-Rad, Hercules, CA, USACat# 1725271
TriZol ReagentThermo Fisher Scientific
Life Sciences Solutions
Carlsbad, CA, USA 		Cat#  15596026Reagente de extração de RNA
Zombie Violet Fixable Kitde Viabilidade BioLegend, San Diego, CA, EUA.Gato # 423113

Referências

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