A combinação de multiplexidade iterativa de branqueamento (IBEX) e um ensaio comercial de marcação de nucleotídeos (Click-iT EdU) permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos em seções fixas de tecido murino congelado. Além disso, um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto fornece aquisição e análise de imagens de alto rendimento.
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Artigo de método
Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido
Neste artigo
Resumo
Resumo
As lesões cutâneas iniciam uma complexa cascata regenerativa que envolve vários tipos de células. Entre elas, as células gliais periféricas desempenham um papel crítico para garantir o sucesso do processo de reparo. No entanto, nossa compreensão desses processos permanece incompleta devido às limitações das tecnologias atuais. Portanto, o método iterativo-branqueamento-estende-multiplexidade (IBEX) foi empregado para caracterizar as alterações na composição celular da pele usando anticorpos direcionados contra proteínas expressas por principais tipos de células e estruturas envolvidas na regeneração tecidual. É importante ressaltar que os anticorpos direcionados contra marcadores de proliferação celular geralmente subestimam o número de células em divisão na pele. Para superar essa limitação, a química Click-iT EdU foi combinada com o método IBEX, permitindo a caracterização detalhada dos tipos de células em proliferação. Usando um microscópio confocal de disco giratório totalmente automatizado, um fluxo de trabalho de alto rendimento foi desenvolvido para imagens iterativas de amostras seccionadas em placas de 24 poços. Além de estender o método IBEX para avaliar os estados das células in situ com o Click-iT EdU, um novo pipeline de processamento de imagem de código aberto também foi introduzido para realizar correção, costura e registro de imagem, e pode ser usado por pesquisadores sem ampla experiência em programação. Além disso, também é fornecida uma documentação detalhada sobre o processamento e visualização de dados de imagem altamente multiplexados (usando software convencional de análise de imagem, incluindo Fiji e QuPath). Em resumo, este protocolo destaca a versatilidade do protocolo IBEX e demonstra sua adaptação a uma plataforma de imagem convencional estabelecida. Notavelmente, a combinação de IBEX com a marcação Click-iT EdU permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão ativa em tecidos intactos e durante processos altamente dinâmicos em resolução espacial.
Introdução
A pele é o maior órgão do corpo humano e a barreira primordial para proteger o corpo do ambiente externo1. Consequentemente, está exposto a uma infinidade de desafios externos que comprometem sua função de barreira. Portanto, a pele desenvolveu mecanismos complexos para restaurar a integridade e a funcionalidade do tecido após o dano. A cicatrização de feridas cutâneas ocorre em três estágios sobrepostos: inflamação, proliferação e maturação/remodelação. Esses três estágios envolvem vários tipos diferentes de células, como fibroblastos dérmicos e células imunes, que atuam juntos para restaurar as propriedades b....
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Protocolo
Toda a criação, alojamento e experimentação de animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do escritório veterinário do Cantão de Zurique, na Suíça.
1. Feridas cutâneas de espessura total (Dia 0)
- Induza camundongos de 8 a 10 semanas de idade com isoflurano a 5% em O2 a 70% e mantenha-o usando isoflurano a 2,5%.
- Raspe a pele das costas e limpe-a bem.
- Desinfete antes da cirurgia usando sabonete antibacteriano e solução de EtOH a 70%.
- Aplique analgesia pré-operatória usando uma injeção subcutânea de buprenorfina (30 μg∙mg∙kg−1).
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Resultados
Este método permite a detecção adequada de tipos de células em proliferação, combinando a química EdU Click-iT com IBEX em seções fixas de pele murina congelada. A detecção de tipos de células em proliferação foi comparada usando diferentes metodologias, em particular, marcação de tipos de células em proliferação com anticorpo Ki-67 e detecção de proliferação celular usando a abordagem química EdU Click-iT (Figura 1). Observamos que a marcação do anticorpo Ki.......
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Discussão
A proliferação celular é um dos quatro principais estágios do reparo da pele, e a transição entre a fase inflamatória e a fase proliferativa é fundamental para um processo de reparo bem-sucedido20. Uma resposta imune bem regulada é essencial, pois a inflamação prolongada pode levar a feridas crônicas, um problema significativo de saúde global 1,21. A proliferação é um processo biológico chave, importante n.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes a declarar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer ao Centro de Microscopia e Análise de Imagem por seu apoio com o microscópio MD ImageXpress e ao Centro de Serviços para Animais de Laboratório para a criação de camundongos. L.S. foi financiado por duas bolsas da Swiss National Science Foundation (310030_192075 e 310030_207801), uma bolsa da Swiss Cancer Research Foundation (KLS-5391-08-2021) e pela SKINTEGRITY. Consórcio de pesquisa colaborativa CH. S.S. foi financiado por uma bolsa de pós-doutorado da Universidade de Zurique (FK-22-056).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpos e reagentes & nbsp; | FONTE | IDENTIFICADOR | Comentários |
| Anticorpos | |||
| CD31 Alexa Fluor 647 (Ciclo 2) | BioLegend | Gato#102516 | 1:100 |
| AB_2161029 | |||
| CD45 Alexa Fluor 488 (Ciclo 2) | BioLegend | Gato#103122 | 1:100 |
| AB_493531 | |||
| Ki-67 FITC (Ciclo 1) | BioLegend | Gato#151212 | 1:50 |
| AB_2814055 | |||
| Frango Ki-67 (CK) | LSBio | Gato#LS-C772946 | 1:800 |
| Ki-67 rat (rt) e nbsp; | BioLegend | Gato#652402 | 1:100 |
| AB_11204254 | |||
| Neurofilamento H & M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (Ciclo 3) | BioLegend | Cat#837710 | 1:300 |
| AB_2734613 | |||
| p75NTR (Ciclo 1) | Tecnologia de Sinalização Celular | Cat#8238 AB_10839265 | 1:1500 |
| Vimentin Alexa Fluor 488 (Ciclo 3) | BioLegend | Gato#699305 | 1:100 |
| AB_2888889 | |||
| Alexa Fluor 647 burro anti-coelho | Jackson ImmunoResearch | Cat#711-605-152 | |
| Reagentes | |||
| Placa Inferior de Vidro Cellvis de 24 poços | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| Gelatina de alúmen cromado | Oferta de Novos Chegados | Cat#1033A | |
| Kit Click-iT EdU | Thermo Fisher Scientific | C10637 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | Cat#14533; CAS# 23491-52-3 | |
| LiBH4, Borohidreto de Lítio, 95% | Thermo Fisher Scientific | Gato#10438443 | |
| Composto Tissue-Tek O.C.T Sakura | Biossistemas Suíça | Cat#7109-4583 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | Cat#10010-015 | |
| Laminas de Microscópio de Adesão Superfrost Plus | Epredia | Gato#J1800AMNZ | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat#T8787 | |
| Equipamento | |||
| Escova de cabelo | Faust AG | Cat#9172051 e 9172050 | |
| Lâminas de microtomo | Biossistemas Suíça | Gato#207500011 | |
| Microscópio | Dispositivos Moleculares, ImageXpress Confocal HT.ai | ||
| Forno & nbsp; | Thermo Fisher Scientific | Gato#HBMCR4220 | |
| Balançador de balanço | Edmund Bü hler GmbH | Gato#32310015 |
Referências
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: Mechanisms, signaling, and translation. Sci Transl Med. 6 (265), 265sr6(2014).
- Martin, P. Wound healing - aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Gu....
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Reimpressões e permissões
