Fluxo de trabalho de imagem e análise de alto rendimento para avaliar fenótipos de células da pele e estados de proliferação em amostras de tecido

Summary

A combinação de multiplexidade iterativa de branqueamento (IBEX) e um ensaio comercial de marcação de nucleotídeos (Click-iT EdU) permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão em processos altamente dinâmicos em seções fixas de tecido murino congelado. Além disso, um novo pipeline de processamento de imagens de código aberto fornece aquisição e análise de imagens de alto rendimento.

Abstract

As lesões cutâneas iniciam uma complexa cascata regenerativa que envolve vários tipos de células. Entre elas, as células gliais periféricas desempenham um papel crítico para garantir o sucesso do processo de reparo. No entanto, nossa compreensão desses processos permanece incompleta devido às limitações das tecnologias atuais. Portanto, o método iterativo-branqueamento-estende-multiplexidade (IBEX) foi empregado para caracterizar as alterações na composição celular da pele usando anticorpos direcionados contra proteínas expressas por principais tipos de células e estruturas envolvidas na regeneração tecidual. É importante ressaltar que os anticorpos direcionados contra marcadores de proliferação celular geralmente subestimam o número de células em divisão na pele. Para superar essa limitação, a química Click-iT EdU foi combinada com o método IBEX, permitindo a caracterização detalhada dos tipos de células em proliferação. Usando um microscópio confocal de disco giratório totalmente automatizado, um fluxo de trabalho de alto rendimento foi desenvolvido para imagens iterativas de amostras seccionadas em placas de 24 poços. Além de estender o método IBEX para avaliar os estados das células in situ com o Click-iT EdU, um novo pipeline de processamento de imagem de código aberto também foi introduzido para realizar correção, costura e registro de imagem, e pode ser usado por pesquisadores sem ampla experiência em programação. Além disso, também é fornecida uma documentação detalhada sobre o processamento e visualização de dados de imagem altamente multiplexados (usando software convencional de análise de imagem, incluindo Fiji e QuPath). Em resumo, este protocolo destaca a versatilidade do protocolo IBEX e demonstra sua adaptação a uma plataforma de imagem convencional estabelecida. Notavelmente, a combinação de IBEX com a marcação Click-iT EdU permite a detecção e categorização de tipos de células em divisão ativa em tecidos intactos e durante processos altamente dinâmicos em resolução espacial.

Introduction

A pele é o maior órgão do corpo humano e a barreira primordial para proteger o corpo do ambiente externo¹. Consequentemente, está exposto a uma infinidade de desafios externos que comprometem sua função de barreira. Portanto, a pele desenvolveu mecanismos complexos para restaurar a integridade e a funcionalidade do tecido após o dano. A cicatrização de feridas cutâneas ocorre em três estágios sobrepostos: inflamação, proliferação e maturação/remodelação. Esses três estágios envolvem vários tipos diferentes de células, como fibroblastos dérmicos e células imunes, que atuam juntos para restaurar as propriedades biológicas iniciais do tecido cutâneo lesado ^1,2,3.

A pele é um órgão densamente inervado, e sabe-se que a inervação nervosa é crucial para o sucesso do processo de reparo ^4,5,6. Além da sinalização axonal ^4,7,8, a glia periférica, normalmente revestindo os axônios, participa da regeneração tecidual bem-sucedida ^9,10,11. No entanto, o papel dos tipos de células sub-representadas, como as células gliais periféricas, permanece pouco compreendido em processos dinâmicos como a regeneração do tecido da pele. Para determinar melhor a função dessas células, é fundamental analisar o microambiente celular e os tipos de células vizinhas com as quais elas podem interagir durante o processo regenerativo. Além disso, como a proliferação celular é um estágio chave para a regeneração do tecido, é importante detectar e classificar com precisão os tipos de células em proliferação ao longo do processo de reparo.

Métodos de imagem óptica multiplexados e de alto conteúdo, como o IBEX¹², foram desenvolvidos para caracterizar a composição celular, visualizar e quantificar as interações célula-célula e dissecar padrões microambientais dentro de tecidos complexos em resolução espacial. Enquanto outros métodos de multiplexação requerem instrumentos especializados e reagentes proprietários, uma vantagem particular do IBEX é que ele pode ser estabelecido a custos relativamente baixos usando anticorpos, reagentes e microscópios disponíveis comercialmente acessíveis em um ambiente de pesquisa padrão. Embora os anticorpos anti-Ki-67, frequentemente usados em painéis IBEX, rotulem de forma confiável os tipos de células em proliferação em muitos tecidos^13,14, o número de células Ki-67-positivas (Ki-67+) foi subestimado em comparação com outras metodologias em seções fixas de tecido congelado de feridas cutâneas murinas agudas. Portanto, combinamos a química Click-iT EdU com IBEX e descobrimos que o número de células EdU⁺ representa com mais precisão o número total de células em proliferação obtidas por outras metodologias.

Além disso, ao empregar um microscópio confocal de disco giratório totalmente automatizado, um fluxo de trabalho de alto rendimento foi estabelecido para imagens iterativas de seções de tecido colocadas em uma placa de 24 poços. As imagens resultantes são processadas combinando várias ferramentas Python de código aberto em um novo pipeline de processamento de imagem que corrige as imagens para iluminação irregular, executa a costura dos blocos individuais e, por fim, o registro da imagem. Em detalhes, a biblioteca BaSiCPy¹⁵ foi usada para correção de iluminação, a biblioteca m2stitch para costurar as imagens e a correlação cruzada de fase para registro de ciclo. As imagens registradas são salvas como OME-TIFFs e podem ser carregadas em softwares convencionais de análise de imagens, como Fiji¹⁷ e QuPath¹⁸, onde as imagens são processadas posteriormente e a categorização do tipo de célula e outras medições, como cálculos de intensidade e distância, podem ser realizadas. Em conjunto, o presente protocolo nos permitiu realizar uma caracterização detalhada e altamente eficiente dos principais tipos de células da pele em regeneração, com foco particular no microambiente celular ao redor da população de células gliais periféricas.

Protocol

Toda a criação, alojamento e experimentação de animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes do escritório veterinário do Cantão de Zurique, na Suíça.

1. Feridas cutâneas de espessura total (Dia 0)

1. Induza camundongos de 8 a 10 semanas de idade com isoflurano a 5% em O₂ a 70% e mantenha-o usando isoflurano a 2,5%.
2. Raspe a pele das costas e limpe-a bem.
3. Desinfete antes da cirurgia usando sabonete antibacteriano e solução de EtOH a 70%.
4. Aplique analgesia pré-operatória usando uma injeção subcutânea de buprenorfina (30 μg∙mg∙kg⁻¹).
5. Gere quatro feridas excisionais circulares de espessura total de 5 mm de diâmetro na pele lombar de cada animal, duas de cada lado, a 1 cm da linha média do animal e a cerca de 2 cm de distância uma da outra¹⁹.
6. Realize analgesia pós-operatória com tratamento de 3 dias com buprenorfina através de água potável (9 μg/mL com sacarose a 2%).
7. Deixe as feridas cicatrizarem sem curativo.
8. Colete as feridas em pontos de tempo definidos para exame histológico e análise de citometria de fluxo.
9. Para o protocolo IBEX, dissecar e fixar os tecidos cutâneos com solução de paraformaldeído (PFA) a 4% durante a noite. Use uma cápsula de biópsia disponível comercialmente para evitar o enrolamento das amostras durante a fixação. Crioproteja os tecidos fixados com PFA a 4% em sacarose a 30% em PBS durante a noite a 4 °C. Transfira os tecidos para uma mistura 1:1 de sacarose a 30% com composto OCT por 2 h em RT e, finalmente, incorpore em OCT antes de congelar em isopentano.

2. Preparação da amostra (Dia 1)

1. Cubra a placa de 24 poços com 200 μL de gelatina de alúmen de cromo por 15 min em um agitador de balancim. Em seguida, remova completamente a gelatina e seque os poços revestidos por 60 min em um forno a 40 °C. Cubra o dobro dos poços necessários como backup. Adicione 2 mL de PBS por poço.
   NOTA: Certifique-se de que o revestimento esteja completamente seco antes de colocar o lenço de papel. Os poços também podem ser revestidos um dia antes e secos durante a noite em RT. Depois de revestido, não armazene os poços revestidos na geladeira ou no freezer e, para obter melhores resultados, use a placa revestida de 24 poços dentro de 1-2 dias.
2. Corte o tecido embebido em O.C.T com 15-30 μm de espessura no criostato e transfira-o rapidamente para um poço revestido contendo 2 mL de PBS.
   NOTA: O tecido pode ser transferido usando uma espátula de metal ou fórceps.
3. Remova cuidadosamente o PBS usando uma pipeta de 1 mL, com o objetivo de manter a seção do tecido centralizada no poço. Para fazer isso de forma eficaz, aspire lentamente o PBS das bordas do poço, ajustando a posição da pipeta conforme necessário para evitar que o tecido se desloque.
   NOTA: A colocação precisa do tecido é essencial para o sucesso do protocolo. Uma vez que o tecido adere à superfície revestida, ele não pode ser reposicionado.
4. Secar as secções de tecido durante 1 h numa estufa a 37 °C.

3. Bloqueio tecidual, reação EdU Click-iT e imunomarcação de anticorpos, ciclo IBEX 1 (Dia 1)

1. Reidrate com 1 mL de PBS por 5 min.
2. Permeabilize o tecido com 500 μL de Triton a 0,5% em PBS por 30 min em RT.
3. Lave o lenço brevemente 2x com PBS.
4. Execute a reação Click-iT, de acordo com as instruções do fabricante, por 30 min em RT.
   NOTA: Mantenha as amostras protegidas da luz.
5. Lave o lenço brevemente 2x com PBS.
6. Bloqueie o tecido por 1 h à temperatura ambiente (RT) usando um tampão de bloqueio.
   NOTA: Aqui, 10% de soro de burro em PBS foi usado para este experimento, mas isso pode ser ajustado conforme necessário; Qualquer tampão de bloqueio compatível com os protocolos de imunomarcação padrão é adequado.
7. Aplicar anticorpos primários (diluídos em tampão de bloqueio; ver Tabela de Materiais) para o 1.º ciclo durante a noite a 4 °C.
   NOTA: O bloqueio e a imunomarcação também podem ser realizados por ~ 1 h usando um micro-ondas sem aquecimento, conforme descrito em Radtke et ^al.12. No entanto, para feridas cutâneas, a melhor relação sinal-ruído é obtida quando os anticorpos primários são incubados durante a noite. Seções de tecido imunomarcadas podem ser armazenadas em PBS por vários dias antes da imagem. A imagem é recomendada no dia seguinte para obter a qualidade ideal do sinal.

4. Imunomarcação de anticorpos secundários e contracoloração nuclear (Dia 2)

1. Lave os poços com 3 x 1 mL de PBS.
2. Incubar a secção de tecido com a coloração de anticorpos secundários anti-coelho (1:300) em solução de bloqueio, juntamente com a contracoloração nuclear Hoechst 1:1.000, durante 1 h a RT no escuro.
3. Lave 3 x 5 min com 1 mL de PBS em RT.
4. Deixe ~ 500 μL de PBS em cada poço e leve a placa ao microscópio.
   NOTA: Este pode ser um ponto de pausa: as amostras são estáveis por vários dias a 4 °C, mas a relação sinal-ruído é melhor quando fotografada dentro de 24 h após a imunomarcação.

5. Configuração do microscópio e imagem do primeiro ciclo IBEX (Dia 2)

1. Faça login no microscópio, carregue o software e entre no perfil do usuário.
2. Entrar a configuração de aquisição (aberta via Triagem | Configuração de aquisição) para configuração de protocolo e aquisição de imagem.
3. Use o botão Ejetar para carregar a placa no microscópio.
4. Limpe o fundo da placa de 24 poços com etanol a 70% antes de colocar a placa no microscópio. Clique no botão Carregar placa para carregar a placa no microscópio.
5. Selecione o modo de ampliação e aquisição desejado em Objetiva e Câmera. Como modo de aquisição , selecione o modo de fenda confocal de 51 μm .
   NOTA: Aqui, uma objetiva de imersão em água de 20x com uma abertura numérica de 0,95 e um disco giratório com orifícios de 50 μm, espaçados em 250 μm foram usados para o experimento.
6. Na guia Placa , selecione o modelo de placa usado.
7. Vá para a guia Placa/Sites a serem visitados. Em Opções do site, clique em Número fixo de sites. Escolha o número de colunas e linhas de modo que aproximadamente todo o poço seja coberto. Clique em Sobrepor sites 10%.
   NOTA: Este botão precisa ser ativado para garantir a costura dos ladrilhos individuais.
8. Selecione somente o primeiro poço preenchido para aquisição clicando com o botão direito do mouse no poço correspondente no mapa do poço. Os poços selecionados são verdes e os poços desmarcados são cinza.
9. Mova o palco para uma posição onde o tecido deve estar clicando com o botão esquerdo do mouse no primeiro poço preenchido no mapa da placa e em um local próximo ao centro no mapa do site. Procure uma cor mais escura do poço e do local indicando a posição atual.
10. Vá para a guia Aquisição . Selecione as opções Ativar foco baseado em laser e Adquirir Série Z.
11. Vá para a guia Aquisição/Foco automático . Para Foco automático de poço a poço, selecione a opção Foco na placa e no fundo do poço e, para Foco automático do local, selecione a opção Todos os locais .
12. Vá para a guia Comprimentos de onda e escolha o número de corantes a serem visualizados no ciclo atual. Procure o número correspondente de novas guias que se abrem abaixo da guia Comprimentos de onda .
13. Vá para a primeira guia de comprimento de onda. Em Iluminação, selecione as configurações de filtro mais adequadas para o fluoróforo de interesse (por exemplo, escolha DAPI se Hoechst foi usado).
14. Escolha Laser com deslocamento z para o posicionamento z e clique no botão Calcular deslocamento para definir a altura correta da imagem. Uma série de imagens será adquirida em diferentes posições z. Escolha aquele em que a amostra está melhor em foco.
    NOTA: Certifique-se de que a posição do palco esteja definida para um local com lenços de papel. Se nenhum tecido estiver visível nesta posição, selecione um local diferente e tente novamente (consulte a etapa 4.9).
15. Pressione o botão Foco e aguarde até que uma imagem em foco do tecido seja exibida.
16. Para Potência de iluminação, escolha 50%. Digite 2000 para Intensidade máxima do alvo e pressione Exposição automática para ajustar o tempo de exposição automaticamente.
    NOTA: Para acelerar a aquisição, a potência do laser pode ser aumentada, o que deve reduzir o tempo de exposição. No entanto, isso pode levar a mais fotobranqueamento, o que levará a artefatos de imagem em que os blocos individuais se sobrepõem.
17. Para Série Z, escolha Série Z e Imagem de projeção 2D e, para Correção de sombreamento, escolha Somente sombreamento FL.
18. Repita as etapas 5.13-5.17 para os outros comprimentos de onda, mas em vez de Laser com deslocamento z, escolha deslocamento Z de W1 e escolha 0.
19. Vá para a guia Série Z . Insira o tamanho do passo desejado (para a objetiva de 20x, use um tamanho de passo de 0,5 μm).
    NOTA: A velocidade de aquisição pode ser aumentada usando um tamanho de passo que é 2-3x o valor recomendado.
20. Clique no botão Foco e aguarde até que uma seta rotulada como posição atual apareça.
21. Clique em Iniciar ao vivo e aguarde até que uma nova janela com imagens ao vivo apareça. Arraste a seta da posição atual até que a parte inferior do tecido seja alcançada e clique no botão Definir B . Arraste a seta da posição atual até que o topo do tecido seja alcançado e clique no botão Definir T . Clique em F2: Parar.
    NOTA: Pode-se escolher o comprimento de onda usado para imagens ao vivo em Comprimento de onda ativo.
22. Selecione os sites a adquirir; primeiro, certifique-se de que o palco esteja no primeiro poço clicando com o botão esquerdo nele e pressione Iniciar ao vivo novamente. Vá para diferentes posições dentro do poço clicando com o botão esquerdo do mouse em diferentes locais no mapa do site. Encontre a borda do tecido e marque todos os locais que contêm tecido para aquisição clicando com o botão direito do mouse. Os sites selecionados ficarão verdes e os sites desmarcados cinza.
    NOTA: Por enquanto, faça isso apenas para o primeiro poço e certifique-se de que apenas o primeiro poço seja selecionado para aquisição.
23. Vá para a guia Executar . Para o Nome da placa, nomeie-o como "Ciclo{i}_Well{w}_{descrição}"; Substitua {i}, {w} e {description} pelos valores/descrição correspondentes.
24. Clique em Salvar Protocolo e salve-o, incluindo novamente "Cycle{i}_Well{w}" no nome.
25. Configure as regiões de aquisição para todos os outros poços. Para isso, repita as etapas 5.22-5.24.
    NOTA: Para cada poço a ser adquirido, um arquivo de protocolo individual precisa ser salvo. Certifique-se de que o poço correto esteja ativado antes de desenhar o novo ROI. O resultado deve ser um protocolo salvo por poço para adquirir. Isso é necessário, pois os tecidos têm formas diferentes de poço a poço. Caso o ROI e a pilha z sejam idênticos entre os poços, as etapas de repetição 5.22-5.24 podem ser ignoradas e as etapas 5.26-5.29 também podem ser ignoradas. Nesse caso, basta selecionar todos os poços a serem fotografados (consulte a etapa 5.22), ir para a guia Executar e pressionar Adquirir placa.
26. Clique em Controle | Revista | Inicie a gravação e imediatamente Controle | Revista | Pare a gravação. Salve o Diário criado e abra-o novamente via Controle | Revista | Editar diário.
27. No painel esquerdo, localize e clique duas vezes em Aquisição de Chapas - Carregar Protocolo do Arquivo e em Aquisição de Chapas para adicionar essas etapas ao diário; Procure-os no painel direito. Clique duas vezes no Aquisição de placas - Carregar protocolo do arquivo adicionado e escolha o protocolo salvo para o primeiro poço (consulte a etapa 5.24).
28. Repita o passo 5.27 para cada poço a ser adquirido, sempre carregando o respectivo protocolo.
29. Clique em Salvar e, finalmente, em Executar diário para iniciar a aquisição (requer aproximadamente 3 h para adquirir 180 blocos com uma pilha z de 15 μm).

6. Branqueamento com fluoróforo (Dia 2)

1. Aproximadamente 30 minutos antes do final do diário, prepare o reagente clareador. Dissolva 10 mg de borohidreto de lítio em 10 mL de ddH₂O e passe por um filtro de 0,22 μm. Deixe por 10 min, esperando a formação de bolhas. Para garantir um branqueamento eficiente, use o reagente clareador dentro de 4 h após a preparação.
   CUIDADO: Trabalhe sob uma capa química ao manusear o borohidreto de lítio, pois ele pode reagir com o ar e produzir gás hidrogênio inflamável.
2. Branqueie os fluoróforos com 1 mL de 1 mg/mL de borohidreto de lítio por 15 min enquanto exposto à iluminação ambiente padrão. Procure pequenas bolhas no tecido durante o procedimento de clareamento.
   NOTA: Ao trabalhar sob uma capa química, certifique-se de que a iluminação não seja desligada automaticamente durante o procedimento de branqueamento.
3. Repita o branqueamento com mais 1 mL de 1 mg/mL de Borohidreto de Lítio (preparado a partir da mesma solução) por 15 min.
4. Lave o poço por 3 x 5 min com 1 mL de PBS.
   NOTA: Não reduza os tempos de lavagem, pois a remoção incompleta do reagente clareador pode danificar o próximo painel de anticorpos.

7. Ciclos IBEX (Dia 2)

1. Aplique anticorpos primários para o próximo ciclo de imunomarcação (etapa 3.7) e incube a 4 °C durante a noite. Repita as etapas 4.4-5.4.
   NOTA: As etapas 4.2-4.3 não são repetidas, pois um anticorpo de coelho desacoplado é usado apenas no primeiro ciclo IBEX. No entanto, anticorpos desacoplados criados em espécies menos comuns, como galinha ou porquinho-da-índia, também podem ser usados em ciclos posteriores, pois seu anticorpo secundário não reagirá de forma cruzada com os anticorpos primários acoplados. Detalhes exatos dos anticorpos usados em cada ciclo podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
2. No microscópio, carregue as configurações de protocolo do ciclo IBEX anterior para o poço correspondente clicando em carregar protocolo, salvo no PC local como Cycle{i}_Well{w} (etapa 5.24). As configurações do protocolo terão o ROI (blocos selecionados a serem adquiridos), ampliação, configurações de foco automático e quaisquer configurações de aquisição adicionais salvas do ciclo IBEX anterior (etapas 5.5 a 5.25).
3. Selecione as guias de comprimento de onda e ajuste a exposição e a potência de iluminação para o novo painel de anticorpos (etapas 5.12-5.18). Certifique-se de obter uma imagem de um marcador (geralmente DAPI ou Hoechst) ao longo de todos os ciclos para alinhar os ciclos posteriormente.
   NOTA: Conforme relatado em Radtke et ^al.18, proteínas fluorescentes comumente usadas, como GFP e tdTomato, não são sensíveis ao branqueamento por borohidreto de lítio. Ao trabalhar com tecido que contém proteínas fluorescentes endógenas, como o tdTomato, o comprimento de onda correspondente pode ser omitido da aquisição após o ciclo 1, se não for necessário para o registro da imagem - isso acelerará a imagem. Os comprimentos de onda podem ser removidos na guia Comprimento de onda geral , reduzindo o número de canais de aquisição. Além disso, não foi observado um aumento consistente na autofluorescência tecidual ao longo dos ciclos de imagem; no entanto, é provável que isso varie dependendo do tipo de tecido¹⁸.
4. Verifique se as configurações do z-Stack ainda são razoáveis e ajuste de acordo (etapas 5.19-5.21).
   NOTA: Certifique-se de que o tamanho do passo da pilha z seja o mesmo para todos os ciclos.
5. Atualize o Nome da placa na guia Executar e salve novamente o protocolo.
6. Repita as etapas 7.2-7.5 para todos os poços a serem adquiridos.
   NOTA: Recomenda-se anotar a configuração de Exposição para todos os comprimentos de onda usados no primeiro poço e usar a mesma configuração em todos os poços subsequentes.
7. Edite o diário, selecione os novos arquivos de protocolo e salve o diário para este ciclo.
8. Execute o diário.
9. Repita as etapas 6.1-6.4 para branquear os fluoróforos.
10. Repita as etapas 7.1-7.9 até que a quantidade desejada de imunomarcação seja alcançada.

8. Processamento de imagem (dia 2)

1. Depois de finalizar a aquisição da imagem dos ciclos IBEX, exporte os dados da imagem:
   1. Selecione Triagem | Utilitários de dados de placas | Exportar imagens.
   2. Clique em Selecionar placa(s) e escolha todas as placas adquiridas para cada ciclo e poço.
   3. Escolha Todos os planos Z, selecione um diretório de saída e pressione OK para exportar os dados.
      NOTA: Os dados serão exportados como arquivos tiff individuais para cada bloco e plano. Para combinar todos os ladrilhos e ciclos, foram realizadas as seguintes etapas de processamento.
2. Organize os dados exportados em pastas de acordo com o seguinte esquema: certifique-se de que cada ciclo seja uma pasta, cada uma contendo novamente uma pasta para cada poço. Nomeie da seguinte forma: "\cycle{i}\{well}\*_Plate_*", onde {i} e {well} são o ciclo e o poço correspondentes, e * é qualquer caractere. Por exemplo: "\cycle1\A01\some_name_Plate_8654"
   NOTA: Uma nomenclatura e estrutura de pastas corretas são necessárias para as etapas de processamento subsequentes.
3. Instale os pacotes python necessários: use o Miniforge para gerenciar o ambiente Python. Consulte https://github.com/conda-forge/miniforge para obter instruções de instalação.
   NOTA: O código para as etapas de processamento é fornecido na forma de Jupyter Notebooks. Eles podem ser encontrados em https://github.com/ZMB-UZH/zmb-ibex-jove ou como arquivos complementares (Arquivo Suplementar 1, Arquivo Suplementar 2, Arquivo Suplementar 3, Arquivo Suplementar 4 e Arquivo Suplementar 5).
4. Ao baixar o código do Github, baixe todos os arquivos clicando em Código | Baixe o ZIP e siga as instruções de instalação no arquivo README.md.
5. Inicie o Jupyter-Lab (Arquivo Suplementar 2):
   1. Ative o ambiente conda instalado digitando conda activate zmb-ibex-jove em um terminal.
   2. No terminal, mude para o diretório baixado digitando, por exemplo, cd C:\path\to\zmb-ibex-jove.
   3. Inicie o Jupyter-Lab digitando jupyter-lab no terminal. Uma janela do navegador será aberta com jupyter-lab.
6. Calcule a correção de iluminação:
   1. Na guia esquerda, navegue até o bloco de anotações " examples/01_get_flatfield_BaSiC.ipynb" e abra-o clicando duas vezes nele . Este notebook calculará as imagens de correção de iluminação, usando a biblioteca BaSiCPy (Arquivo Suplementar 3).
   2. Altere o "base_dir" e o "save_dir" para os caminhos corretos, onde os dados estão localizados e onde as imagens de correção de iluminação devem ser salvas.
   3. Para executar o código no notebook, selecione cada célula e pressione Shift+Enter para executá-lo. Execute o notebook de cima para baixo.
7. Execute a costura para cada ciclo individual (Arquivo Suplementar 4):
   1. Na guia esquerda, navegue até o próximo bloco de anotações e abra-o : "02_stitching_MD.ipynb". Neste caderno, para cada ciclo, os blocos individuais são carregados, a iluminação corrigida e unida, resultando em um arquivo de imagem por poço e ciclo. Use a biblioteca m2stitch (https://github.com/yfukai/m2stitch) para costura.
   2. Altere as entradas na primeira célula para os caminhos de arquivo corretos. Execute o notebook novamente de cima para baixo.
8. Execute o registro de imagem entre os ciclos (Arquivo Suplementar 5):
   1. Na guia esquerda, navegue até o próximo bloco de anotações e abra-o : "03_registration_pcc.ipynb". Neste notebook, os ciclos individuais são alinhados uns com os outros usando apenas transformações translacionais, que são calculadas com o algoritmo de correlação cruzada de fase da biblioteca de imagens scikit (https://scikit-image.org/) de acesso aberto.
   2. Altere as entradas na primeira célula para os caminhos de arquivo corretos. Escolha um ciclo de referência e um canal de referência a serem usados (geralmente DAPI). Execute o notebook novamente de cima para baixo.
      NOTA: Apenas um dos capítulos "Opção 1: Carregar e salvar todos os canais juntos" e "Opção 2: Carregar e salvar canais como arquivos individuais" precisa ser executado. O primeiro capítulo criará um arquivo grande, contendo todos os canais de todos os ciclos. O segundo capítulo criará um arquivo individual para cada canal. A segunda opção exigirá menos memória para ser processada.

9. Análise de imagem (dia 2)

1. Baixe e abra Fiji (https://imagej.net/software/fiji/downloads).
   NOTA: As imagens resultantes serão imagens multiplanas e multicanais, que podem ser analisadas como imagens 3D. Aqui, um exemplo de fluxo de trabalho de análise é mostrado apenas para dados 2D, para os quais uma projeção de intensidade máxima é calculada primeiro.
2. Abra o arquivo em Fiji arrastando-o para a janela do Fiji.
3. Calcule a projeção de intensidade máxima selecionando Imagem | Pilhas | Z Project..., escolha Intensidade máxima e pressione ok. Salve novamente a imagem via Arquivo | Salvar como | OME-TIFF".
4. Para analisar as células, use o software de código aberto QuPath; Baixe e instale-o a partir do https://qupath.github.io/.
5. Abra o QuPath e crie um novo projeto arrastando uma pasta vazia para a janela.
6. Importe todos os arquivos para o projeto arrastando-os para a janela do QuPath e pressionando Importar com as configurações padrão.
7. Clique duas vezes em uma imagem no painel esquerdo para abri-la. Especifique-o como Fluorescência quando solicitado.
8. Abra a janela Brilho/Contraste pressionando Shift+C.
   NOTA: Aqui, pode-se selecionar quais canais são mostrados e ajustar o brilho e o contraste. Também é possível alterar os nomes e cores dos canais clicando duas vezes nos nomes.
9. Selecione a opção Ferramentas | Polígono e anote a região do tecido. Procure uma nova anotação na guia Anotações . Defina-o como uma classe específica selecionando a anotação, selecionando uma classe (por exemplo, Outro) e pressionando Definir classe.
10. Detectar células: vá para Analisar | Detecção de células | Detecção de células.
    1. Escolha um canal nuclear.
    2. Deixe a maioria das configurações como estão, mas ajuste o Limiar passando o mouse sobre um núcleo e observando a intensidade exibida no canto inferior direito. Passe o mouse sobre uma região de fundo e observe a intensidade novamente. Escolha um valor a meio caminho entre o plano de fundo e o primeiro plano como limite.
    3. Clique em Executar.
11. Inspecione as células e as medições:
12. Ao clicar duas vezes em uma célula ou selecioná-la na guia Hierarquia , inspecione suas medidas no painel inferior esquerdo. Diferentes medições de forma e intensidade devem ser adicionadas para célula, núcleo e citoplasma.
13. Classificar células:
    1. Para classificar as células detectadas de acordo com a intensidade em um canal, vá para Classificar | Classificação de objetos | Crie um único classificador de medição.
    2. Selecione o canal desejado em Filtro de canal e uma medição apropriada em Medição (por exemplo, Célula: Média do canal).
    3. Ajuste o limite passando novamente o mouse sobre uma célula positiva e sobre uma célula negativa e escolhendo um valor entre as duas.
    4. Selecione, por exemplo, Positivo para Acima do Limite e Negativo para Abaixo do Limite. Verifique o resultado marcando a visualização ao vivo.
    5. Pressione Aplicar para classificar as células.
14. Meça a distância até objetos anotados (por exemplo, feixes de nervos):
    1. Selecione a opção Ferramentas | Ferramenta Pincel .
    2. Desenhe sobre regiões de interesse (por exemplo, feixes nervosos).
    3. Vá para a guia Anotações . Selecione todas as novas anotações, selecione uma classe correspondente e pressione Definir classe.
       NOTA: Pode-se criar uma nova classe clicando com o botão direito do mouse na janela da classe e selecionando Adicionar/Remover | Adicione classe.
    4. Vá para Analisar Análise Espacial | Distância assinada para anotações 2D e pressione Sim quando solicitado.
    5. Adicione uma nova medida a cada célula, indicando a distância até a anotação mais próxima de uma determinada classe.
15. Exportar medidas:
    1. Ir para Medir | Mostrar medidas de detecção e aguarde até que uma lista de todas as medições de todas as detecções apareça.
    2. Exporte a tabela como um .txt por meio do botão Salvar .
    3. Importe os dados para o software de processamento de dados de sua escolha para serem analisados posteriormente.

Results

Este método permite a detecção adequada de tipos de células em proliferação, combinando a química EdU Click-iT com IBEX em seções fixas de pele murina congelada. A detecção de tipos de células em proliferação foi comparada usando diferentes metodologias, em particular, marcação de tipos de células em proliferação com anticorpo Ki-67 e detecção de proliferação celular usando a abordagem química EdU Click-iT (Figura 1). Observamos que a marcação do anticorpo Ki...

Discussion

A proliferação celular é um dos quatro principais estágios do reparo da pele, e a transição entre a fase inflamatória e a fase proliferativa é fundamental para um processo de reparo bem-sucedido²⁰. Uma resposta imune bem regulada é essencial, pois a inflamação prolongada pode levar a feridas crônicas, um problema significativo de saúde global ^1,21. A proliferação é um processo biológico chave, importante n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorpos e reagentes & nbsp;	FONTE	IDENTIFICADOR	Comentários
Anticorpos
CD31 Alexa Fluor 647 (Ciclo 2)	BioLegend	Gato#102516	1:100
AB_2161029
CD45 Alexa Fluor 488 (Ciclo 2)	BioLegend	Gato#103122	1:100
AB_493531
Ki-67 FITC (Ciclo 1)	BioLegend	Gato#151212	1:50
AB_2814055
Frango Ki-67 (CK)	LSBio	Gato#LS-C772946	1:800
Ki-67 rat (rt) e nbsp;	BioLegend	Gato#652402	1:100
AB_11204254
Neurofilamento H & M (NF-H/NF-M) Alexa Fluor 647 (Ciclo 3)	BioLegend	Cat#837710	1:300
AB_2734613
p75NTR (Ciclo 1)	Tecnologia de Sinalização Celular	Cat#8238                                            AB_10839265	1:1500
Vimentin Alexa Fluor 488 (Ciclo 3)	BioLegend	Gato#699305	1:100
AB_2888889
Alexa Fluor 647 burro anti-coelho	Jackson ImmunoResearch	Cat#711-605-152
Reagentes
Placa Inferior de Vidro Cellvis de 24 poços	Cellvis	P24-1.5H-N
Gelatina de alúmen cromado	Oferta de Novos Chegados	Cat#1033A
Kit Click-iT EdU	Thermo Fisher Scientific	C10637
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	Cat#14533; CAS# 23491-52-3
LiBH4, Borohidreto de Lítio, 95%	Thermo Fisher Scientific	Gato#10438443
Composto Tissue-Tek O.C.T Sakura	Biossistemas Suíça	Cat#7109-4583
PBS	Thermo Fisher Scientific	Cat#10010-015
Laminas de Microscópio de Adesão Superfrost Plus	Epredia	Gato#J1800AMNZ
Triton X-100	Sigma-Aldrich	Cat#T8787
Equipamento
Escova de cabelo	Faust AG	Cat#9172051 e 9172050
Lâminas de microtomo	Biossistemas Suíça	Gato#207500011
Microscópio	Dispositivos Moleculares, ImageXpress Confocal HT.ai
Forno & nbsp;	Thermo Fisher Scientific	Gato#HBMCR4220
Balançador de balanço	Edmund Bü hler GmbH	Gato#32310015