Detecção de infecção por Helicobacter pylori e resistência a antibióticos por meio da análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase nas fezes

Resumo

O protocolo emprega uma amostragem de fezes não invasiva combinada com uma reação em cadeia da polimerase quantitativa para oferecer um método de diagnóstico conveniente e rápido para a infecção por Helicobacter pylori e sua resistência à claritromicina e quinolonas.

Resumo

O Helicobacter pylori (H. pylori) é amplamente prevalente em todo o mundo, com aproximadamente 50% da população global com histórico de infecção por H. pylori. Na China, a taxa de infecção varia de 40% a 70%. O H. pylori está associado principalmente a doenças gastrointestinais, como gastrite crônica, úlceras gástricas e úlceras duodenais. Atualmente, o tratamento clínico para a infecção por H. pylori envolve terapia tripla ou quádrupla. No entanto, o uso extensivo de antibióticos levou ao desenvolvimento de resistência a antibióticos em H. pylori. Portanto, detectar tanto o H. pylori quanto sua resistência a antibióticos é crucial para orientar o tratamento clínico.

Os métodos diagnósticos para H. pylori incluem teste respiratório de ureia (UBT), teste de antígeno, teste sorológico de anticorpos, endoscopia, teste rápido de urease (RUT) e cultura bacteriana. Embora os três primeiros métodos sejam não invasivos, eles não permitem a recuperação bacteriana e, portanto, não podem ser usados para testes de resistência. Os três últimos métodos são invasivos, caros, exigem alto conhecimento técnico e podem causar danos aos pacientes.

Portanto, um método rápido e não invasivo para detecção simultânea de infecção por H. pylori e resistência a antibióticos é de extrema importância clínica para a erradicação efetiva de H. pylori. Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo específico que combina reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) com a tecnologia de sonda fluorescente TaqMan para detectar rapidamente a infecção por H. pylori e a resistência a antibióticos. Este método fornece uma maneira conveniente, rápida e não invasiva de diagnosticar a infecção e resistência ao H. pylori , ao contrário da cultura bacteriana tradicional e de outras técnicas. A qPCR é usada para identificar a infecção e detectar mutações nos genes 23S rRNA e gyrA , que estão ligados à resistência à claritromicina e quinolonas, respectivamente. Em comparação com as técnicas de cultura convencionais, essa abordagem oferece um método não invasivo, econômico e eficiente em termos de tempo para detectar a infecção por Helicobacter pylori e determinar sua resistência a antibióticos.

Introdução

O Helicobacter pylori é uma bactéria gram-negativa, em forma de espiral, que pode infectar persistentemente o epitélio gástrico humano¹. Em 1994, a Organização Mundial da Saúde classificou o H. pylori como cancerígeno do Grupo 1 para câncer gástrico, com ~ 3% dos indivíduos infectados desenvolvendo a doença². Uma revisão sistemática publicada recentemente indicou que uma tendência geral de aumento da taxa de resistência a antibióticos do H. pylori foi observada na última década, que atingiu níveis alarmantes em todo o mundo, especialmente a resistência à claritromicina³. Na China, os dados da pesquisa mais recente mostraram que a prevalência agregada de H. pylori entre os chineses urbanos é de 27,08%; as taxas de resistência à claritromicina e levofloxacina foram de 50,83% e 47,17%⁴, superiores às dos Estados Unidos (levofloxacino 37,6%, claritromicina 31,5%)⁵e Europa (levofloxacino 15,8% e claritromicina 21,4%)⁶. Consequentemente, o diagnóstico e o tratamento precoces e precisos são cruciais. No entanto, o aumento da resistência a antibióticos do H. pylori reduz consideravelmente a eficácia do tratamento, destacando a necessidade urgente de pesquisas contínuas sobre seu diagnóstico e tratamento.

Os métodos diagnósticos por H. pylori são categorizados em técnicas invasivas e não invasivas⁷. Os métodos invasivos incluem exame histopatológico, teste rápido de urease (RUT) e cultura bacteriana⁸. O exame histopatológico depende do processamento e da observação microscópica de amostras de biópsia, com precisão limitada pelo preparo histológico e pela experiência patológica⁹. O RUT detecta o H. pylori por meio da atividade da urease, que hidrolisa a uréia para produzir amônia, resultando em um deslocamento alcalino no reagente, indicando a presença da bactéria⁹. É simples e econômico. A cultura bacteriana, considerada o "padrão ouro", geralmente tem uma taxa de sucesso abaixo de 50% devido às características fisiológicas únicas do H. pylori¹⁰.

Os métodos não invasivos incluem o teste respiratório da ureia 13C/14C (UBT), o diagnóstico sorológico e o teste do antígeno fecal (SAT)¹¹. O teste respiratório opera com base em um princípio semelhante ao do RUT, detectando CO₂ marcado isotopicamente no ar exalado para confirmar a infecção¹². O diagnóstico sorológico detecta anticorpos, que podem persistir após a erradicação bacteriana, dificultando a avaliação da eficácia do tratamento¹³. O teste de antígeno fecal detecta antígenos específicos de H. pylori em amostras fecais, fornecendo um método não invasivo confiável com menor taxa de falsos positivos e boa acurácia para o diagnóstico de infecções ativas¹⁴.

Cada método diagnóstico tem suas vantagens e limitações¹⁵. Além da cultura bacteriana, outros métodos lutam para detectar a resistência aos antibióticos, enquanto a cultura é prejudicada por baixas taxas de sucesso¹⁶. Recentemente, métodos de diagnóstico molecular, como PCR quantitativo em tempo real (qPCR), têm sido amplamente aplicados à detecção microbiana¹⁷. A qPCR pode detectar com precisão o H. pylori e analisar mutações genéticas de resistência, oferecendo uma visão mais abrangente da infecção¹⁸.

As sondas fluorescentes são projetadas para se ligar especificamente a uma sequência alvo no DNA durante o processo de qPCR. Essas sondas são normalmente marcadas com um corante fluorescente, que emite um sinal quando a sonda se liga ao seu alvo e é clivada pela polimerase durante a amplificação. Isso fornece uma medição em tempo real do processo de PCR. As sondas fluorescentes são conhecidas por sua alta especificidade devido ao design exclusivo da sonda, que garante que apenas a sequência de DNA alvo seja detectada, reduzindo as chances de ligação não específica e melhorando a especificidade do ensaio. Isso torna a tecnologia de sonda fluorescente especialmente útil para detectar alvos de baixa abundância, como o DNA de Helicobacter pylori em amostras de fezes. Embora o SYBR Green seja um corante de ligação ao DNA comumente usado em PCR, ele pode se ligar a qualquer DNA de fita dupla, o que pode resultar em amplificação não específica e falsos positivos.

A cultura de Helicobacter pylori a partir de amostras clínicas não fornece dados diretos sobre resistência a antibióticos. Em contraste, a qPCR baseada em sonda fluorescente é mais rápida, mais conveniente e pode ser adaptada para detecção simultânea de H. pylori e marcadores de resistência a antibióticos. Este método não apenas fornece resultados mais rápidos do que os métodos tradicionais de cultura, mas também permite a detecção simultânea de genes de resistência a antibióticos, aumentando muito a eficiência e a conveniência da detecção. Este método fornece uma maneira conveniente, rápida e não invasiva de diagnosticar a infecção e resistência ao H. pylori , ao contrário da cultura bacteriana tradicional e de outras técnicas.

Existem duas questões cruciais que precisam ser consideradas para a resistência a antibióticos de H. pylori : i) a consistência do genótipo e fenótipo, ii) a multirresistência. Um estudo multicêntrico em larga escala na China constatou que os padrões de dupla resistência para claritromicina/levofloxacino foram de 26.1%. Os fenótipos e genótipos de H pylori resistentes à claritromicina e levofloxacino apresentaram concordância satisfatória (coeficiente kappa = 0,810 e 0,782, respectivamente)¹⁹. Portanto, é viável usar o método qPCR para detectar infecção por H. pylori e resistência a drogas. Os métodos de teste de antígeno fecal (SAT) e qPCR são cada vez mais usados devido à conveniência da amostragem. A sensibilidade, especificidade e acurácia dos métodos de detecção de H. pylori são as seguintes: qPCR > UBT > SAT > RUT> IgG > cultura²⁰. Todos os métodos não invasivos são adequados para triagem primária. Como a qPCR também pode detectar genes de resistência a medicamentos, a qPCR e a cultura serão mais adequadas para orientar o tratamento.

Outras abordagens inovadoras, como algoritmos de inteligência artificial (IA) combinados com imagens endoscópicas²¹, microfluídica digital²² e RPA-CRISPR / Cas12a²³, teoricamente mostram boa eficiência diagnóstica e perspectivas de aplicação promissoras. No entanto, a qPCR é atualmente a técnica de biologia molecular mais sofisticada com potencial para fornecer uma solução superior para o diagnóstico e tratamento de infecções por H. pylori .

Protocolo

Este estudo segue as diretrizes éticas estabelecidas pelo Comitê de Ética do Hospital Popular da Província de Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou, China (Aprovação nº: KY2024-445-01). Informações detalhadas sobre os materiais utilizados nesta pesquisa (reagentes, produtos químicos, equipamentos e softwares) podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

1. Seleção dos participantes

1. Escolha participantes na faixa etária de 18 a 60 anos.
2. Escolha participantes que possam ser submetidos à triagem de infecção por Helicobacter pylori , como pacientes que apresentem sintomas como gastrite, úlceras pépticas ou dispepsia, bem como indivíduos assintomáticos.
3. Exclua do estudo pacientes que usaram antibióticos, agentes contendo bismuto (como cápsulas de citrato de bismuto de potássio, cápsulas de pectina de bismuto coloidal ou comprimidos compostos de bismuto-alumínio) ou medicamentos chineses antimicrobianos no último mês, ou aqueles que usaram inibidores da bomba de prótons ou antagonistas do receptor H2 (como omeprazol, pantoprazol, rabeprazol, cimetidina ou nizatidina) nas últimas 2 semanas. Exclua também do estudo as mulheres durante o período menstrual.

2. Coleta de amostras fecais

NOTA: Forneça a seção 2 como instruções aos participantes.

1. Confirmar se a embalagem exterior do kit de recolha de amostras não está danificada e dentro do prazo de validade. Remova os materiais do kit.
2. Coloque um papel coletor fecal branco no vaso sanitário e defece (para evitar contaminação com urina).
3. Usando uma espátula, colete uma porção de fezes aproximadamente do tamanho de uma fava (~ 5 g) e transfira-a para o recipiente de amostra.
4. Coloque a espátula de amostragem, juntamente com a amostra fecal, no tubo de coleta, garantindo que o nível do líquido suba para perto da linha de amostragem indicada no tubo.
5. Aperte firmemente a tampa do tubo. Inverta o tubo várias vezes para garantir a mistura completa da amostra com a solução conservante.
6. Armazenar a amostra sob refrigeração até a entrega ao laboratório clínico para a seguinte identificação de H. pylori e avaliação dos perfis de resistência a antibióticos via qPCR.

3. Extração de ácido nucleico

NOTA: Conclua todos os procedimentos dentro de um gabinete de biossegurança para evitar contaminação.

1. Inverter o tubo de conservação da amostra e misturar bem. Transfira 1,0 mL da solução da amostra fecal para um tubo de microcentrífuga.
2. Depois de misturar os tubos da centrífuga, colocá-los em um banho de metal a 80 °C por 10 min, com mistura intermitente por 30 s no quinto minuto. Depois que os tubos esfriarem à temperatura ambiente, centrifugue a 10.000 × g por 5 min e colete o sobrenadante para processamento posterior.
3. Inverta a placa de 96 poços várias vezes para ressuspender as esferas magnéticas. Remova cuidadosamente a vedação da folha de alumínio, tomando cuidado para evitar tremores para evitar derramamento.
4. Adicione 200 μL da amostra preparada (da etapa 3.2) a cada poço da placa de 96 poços contendo tampão de lise, garantindo que cada poço corresponda a uma única amostra. Coloque a placa de 96 poços no compartimento de amostra designado do instrumento de extração de ácido nucleico para extração automatizada.
5. Armazene quaisquer amostras restantes e as amostras de ácido nucleico extraídas a -20 °C para preservação a longo prazo e uso futuro.

4. qPCR Detecção de ácidos nucléicos Helicobacter pylori e mutações de resistência à claritromicina e quinolonas

1. Retire os reagentes da área de armazenamento de reagentes e descongele-os à temperatura ambiente.
   NOTA: Este kit foi usado para a detecção qualitativa do ácido nucleico H . pylori , incluindo mutações no gene 23S rRNA (A2143G, A2143C, A2144G) e no gene gyrA (261A, 261G, 260T, 271A, 271T, 272G). Os primers, as sondas, a enzima Taq, a enzima UNG e os dNTPs estavam disponíveis no kit. Os genes-alvo de H. pylori e β-actina humana foram incluídos no controle de qualidade positivo. O geneda β-actina humana foi escolhido como controle de qualidade interno.
2. Com base no número de amostras a serem testadas, use N + 2 cópias do reagente liofilizado, onde N representa o número de amostras a serem testadas e 2 representa os CCs negativos e positivos.
3. Centrifugue brevemente para garantir que o pó liofilizado assente no fundo dos tubos. Abrir a tampa do reagente liofilizado (tendo o cuidado de evitar qualquer derrame do pó) e adicionar 25 μL por alvéolo dos ácidos nucleicos extraídos das amostras a ensaiar, bem como os controlos positivo e negativo. Feche bem os tubos.
4. Vortex os reagentes de PCR por 8-10 s, depois centrifugue brevemente por 3-5 s para evitar a formação de bolhas.
5. Coloque a placa qPCR de 96 poços na máquina qPCR. Defina o programa de ciclagem da seguinte forma: primeiro, incube a mistura de reação (contendo primers, sondas, Taq polimerase, enzima UNG, dNTPs, etc.) a 42 ° C e 95 ° C (ambas as etapas em um ciclo) por 2 min; em seguida, cicle 10x com 10 s a 95 °C e 45 s a 65 °C; finalmente, ciclo 35x com 10 s a 95 ° C e 45 s a 58 ° C para desnaturação, recozimento e extensão.
6. Defina os parâmetros de detecção do sinal de fluorescência da seguinte forma: Marcação fluorescente ROX de genes conservados de H. pylori ; Marcação fluorescente FAM de genes de resistência à claritromicina de H. pylori ; Marcação fluorescente HEX de genes de resistência a quinolonas de H. pylori ; e marcação fluorescente CY5 do gene da β-actina humana foram usados como controle interno do kit. Coletar dados a 58 °C. Após a conclusão da reação, certifique-se de que os dados sejam salvos para análise futura.
7. Analise os dados usando um software específico para qPCR, pois o instrumento seleciona automaticamente o limite da linha de base. Defina todos os critérios diagnósticos, incluindo a presença de infecção ou resistência ao Helicobacter pylori , para um valor de TC ≤30; confirmam que eles exibem uma curva característica em forma de S.

Resultados

Aplicação de qPCR para detecção de infecção por Helicobacter pylori e resistência a antibióticos em amostras fecais
Projetamos primers e sondas com base em mutações pontuais nos genes conservados de Helicobacter pylori, bem como no gene 23S rRNA e no gene gyrA . Esses primers e sondas foram marcados com diferentes corantes fluorescentes e depois usados para detecção de qPCR. Os resultados do controle de quali...

Discussão

Nos últimos anos, os métodos de detecção molecular têm sido amplamente aplicados no campo da microbiologia, alterando significativamente o manejo clínico de diversas doenças infecciosas. Esses métodos operam no nível genético, permitindo não apenas a confirmação da presença bacteriana, mas também a tipagem genética e o teste de resistência a antibióticos. A PCR quantitativa de fluorescência em tempo real (qPCR) é cada vez mais favorecida devido ao seu curto tempo de processamento, alta s...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA	Armário de biossegurança
Tubo descartável de coleta e armazenamento de fezes	Mole		Coleta de amostras fecais
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuga o líquido residual da parede do tubo
Kit de detecção de mutação de resistência a ácido nucleico, claritromicina e quinolona Helicobacter pylori	Mole		Detecção de infecção por Helicobacter pylori e resistência a antibióticos; reagente de H. pylori liofilizado (contendo primers, sondas, Taq polimerase, enzima UNG, dNTPs, etc.), um controle positivo para H. pylori (contendo Helicobacter pylori e genes-alvo de β-actina humana) e um controle negativo para H. pylori (contendo genes-alvo de μt;-actina humana)
Extrator automatizado de ácidos nucleicos Mole 96M	Mole		Para extração de DNA
Kit de extração de ácido nucleico	Mole		Para extrair ácido nucleico; contém tampão de lise (sal de guanidina, tris hidroximetil aminometano, Tween-20, cloreto de sódio), Wash Buffer 1 (cloreto de sódio), Wash Buffer 2 (tris hidroximetil aminometano, Tween-20), Wash Buffer 3 (esferas magnéticas, Tween-20), Wash Buffer 4 (água sem nuclease) e Elution Buffer (tris hidroximetil aminometano), juntamente com um rack magnético
SLAN Sistema de análise de PCR médico totalmente automático	Amplificação
DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091-20	& C para armazenar reagentes
Vortex-5	Kylin-bell		Para misturar reagentes

20143222263 quantitativa fluorescente da temperatura Ultra-baixa da amplificação do PCR da máquina do PCR da análise de dados SLAN-96S de HONGSHI (