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Artigo de método

Coleção de exossomos liberados naturalmente do tecido tumoral

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DOI:

10.3791/67739

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10 de junho de 2025

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1Medicine and Engineering Interdisciplinary Research Laboratory of Nursing & Materials, West China Hospital, Sichuan University/West China School of Nursing, Sichuan University, 2Department of Occupational Diseases, The Second Affiliated Hospital of Chengdu Medical College Nuclear Industry 416 Hospital, 3Department of Plastic and Burn Surgery, West China School of Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este protocolo demonstra um novo método para extrair exossomos de tecidos tumorais, liberando-os naturalmente e coletando-os repetidamente para fornecer uma base experimental para estudar a função dos exossomos no desenvolvimento do tumor.

Resumo

Como vesículas secretadas pelas células, os exossomos envolvem e transferem vários ácidos nucléicos, proteínas e lipídios e participam da comunicação entre diferentes células. Os exossomos no microambiente tumoral desempenham um papel importante nas características biológicas das células tumorais e podem influenciar fortemente os estados de outras células. Portanto, para estudar mais as funções específicas dos exossomos no desenvolvimento de tumores, é sem dúvida necessário extrair e isolar exossomos dos tecidos tumorais. A extração direta de exossomos do tecido tumoral reduz a necessidade de cultura de células in vitro , e os exossomos do tecido tumoral podem ser mais semelhantes aos do estado natural. Portanto, manter o estado natural dos exossomos no tecido tumoral é a chave para o processo de extração. A digestão enzimática é frequentemente combinada com a ultracentrifugação para extrair exossomos dos tecidos tumorais. Aqui, fornecemos um novo método para extrair exossomos do tecido tumoral. Usamos um meio livre de soro para incubar pequenos pedaços de tecido tumoral em uma mesa vibratória, coletamos e extraímos repetidamente exossomos liberados naturalmente do tecido tumoral e identificamos a estrutura, concentração e características do exossomo extraído, fornecendo um novo método para pesquisadores que estudam a função dos exossomos no desenvolvimento do tumor.

Introdução

Os exossomos são um subtipo de vesículas extracelulares secretadas pelas células, geralmente variando em tamanho de 30 nm a 200 nm 1,2. Eles participam da comunicação intercelular e entregam várias moléculas de sinalização, incluindo ácidos nucléicos (por exemplo, ácido desoxirribonucléico (DNA), RNA mensageiro (mRNA), ácido microrribonucléico (miRNA), RNA longo não codificante (lncRNA), RNA circular (circRNA)), proteínas e lipídios 1,3,4,5, para células receptoras para influenciar suas funções fisiológicas 6,7. Inicialmente identificados em reticulócitos de ovelhas8, os exossomos foram identificados em vários fluidos corporais, incluindo sangue, saliva, urina, líquido cefalorraquidiano, ascite, líquido amniótico e leite materno 9,10,11,12,13,14,15,16 . Além disso, os exossomos podem ser secretados por muitos tipos de células, incluindo linfócitos, macrófagos, mastócitos, células de gordura e células tumorais17. Com sua ampla distribuição, os exossomos desempenham um papel crítico em vários processos patológicos, especialmente câncer, e em vários processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento embrionário, reparo e regeneração tecidual e regulação imunológica 18,19,20.

Nos últimos anos, os exossomos demonstraram promover a ocorrência de tumores, invasão, metástase, resistência à quimioterapia e imunidade anti ou pró-tumoral 20,21,22. Os exossomos derivados do câncer podem ativar a expressão gênica em receptores ou células cancerígenas vizinhas para alterar seus fenótipos biológicos, e as células cancerígenas podem interagir com células estromais no microambiente tumoral para promover a proliferação, invasão e angiogênese das células cancerígenas 23,24,25. Os exossomos liberados pelas células tumorais podem ajudá-las a excretar drogas tóxicas, e os exossomos derivados de células estromais podem promover a formação de células cancerígenas20. Os exossomos derivados do câncer estão envolvidos em vários estágios da metástase das células cancerígenas, incluindo invasão de tecidos vizinhos, transferência através do sistema circulatório e disseminação para órgãos distantes20. Finalmente, os exossomos desempenham funções de imunoativação e imunossupressão no câncer, dependendo dos ligantes, proteínas e miRNAs que carregam20. Devido às importantes funções dos exossomos derivados do tecido tumoral, eles mostram valor potencial de aplicação no diagnóstico precoce, tratamento preciso e monitoramento prognóstico de tumores21,22.

Dada a importância dos exossomos derivados do tecido tumoral, muitos pesquisadores tentaram extraí-los para estudar melhor suas propriedades e funções. A extração direta de exossomos de tecidos tumorais não apenas reduz a necessidade de cultura de células in vitro, mas também se assemelha mais ao estado natural dos exossomos. Portanto, manter o estado natural dos exossomos no tecido tumoral é a chave para o processo de extração. As propriedades físicas dos exossomos são a base dos métodos comuns de extração e raramente são consideradas as alterações nos componentes do exossomo causadas pela estimulação durante o processo de extração. De fato, a qualidade dos exossomos é fortemente afetada por diferentes procedimentos de extração de exossomos26,27. Atualmente, os tecidos tumorais são digeridos por enzimas e submetidos a métodos como centrifugação por gradiente de densidade, ultracentrifugação, ultrafiltração, cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), precipitação de polímeros, cromatografia de imunoafinidade e métodos microfluídicos, antes da separação 2,21,28,29 . Aqui, fornecemos um método para extrair exossomos do tecido tumoral. Usamos um meio livre de soro para cultivar pequenos blocos de tecido tumoral em um shaker, depois coletamos e extraímos exossomos liberados naturalmente pelo tecido tumoral e identificamos a concentração e as características dos exossomos extraídos, fornecendo materiais básicos e evidências experimentais para estudar a função dos exossomos no desenvolvimento do tumor.

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Protocolo

Todos os experimentos relacionados ao exossomo do tecido tumoral foram conduzidos de acordo com as diretrizes e regulamentos relevantes. Este estudo foi aprovado e conduzido pelas diretrizes do Comitê de Ética do Hospital da China Ocidental da Universidade de Sichuan (20220301101). Quatro semanas após a inoculação com células SGC-7901, um camundongo nu (BALB/c, macho, 8 semanas de idade, 26 g) foi eutanasiado por luxação cervical.

1. Aquisição de tecido tumoral

  1. Mergulhe em álcool 75% por 5 min.
  2. Vá para uma mesa de operação estéril, use uma tesoura cirúrgica estéril para abrir a pele externa do tumor ectópico.
  3. Retire o tecido tumoral ectópico, corte e pese para obter dois pedaços de igual peso.
    NOTA: Um pedaço de tecido tumoral é usado para extração de exossomos sob este protocolo, e outro pedaço de tecido tumoral de igual peso é usado para extração de exossomos por digestão enzimática30.

2. Pré-condicionamento do tecido tumoral

NOTA: Execute estas etapas no gelo e em um ambiente estéril.

  1. Pipete 10 mL de solução salina tampão fosfato pré-resfriada (PBS) (0,01 M) para lavar o tecido tumoral para remover sangue e gordura da superfície.
  2. Corte o tecido tumoral (~ 400 mm3) em pedaços de 1-2 mm usando uma tesoura oftálmica em 20 mL de PBS com 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em uma placa de Petri estéril de 10 cm. Transfira a mistura acima para um tubo cônico de 50 mL.

3. Liberação de exossomos

  1. Centrifugar o tubo do passo 1.2 a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
  2. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet com 20 mL de meio essencial mínimo α (α-MEM). Incubar a 37 °C a 100 rpm durante 1 h num agitador de temperatura constante.
  3. Centrifugar a 200 × g durante 5 min a 4 °C.
  4. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 10 ml de meio α-MEM. Incubar a 37 °C a 100 rpm durante 6 h num agitador de temperatura constante.
    NOTA: Seja gentil com todas as etapas. Uma incubação curta e uma lavagem com meio α-MEM são suficientes para remover os componentes intracelulares que vazam devido ao corte, incluindo vesículas e organelas intracelulares.
  5. Centrifugar a 200 × g durante 5 min, 4 °C e recolher o sobrenadante num novo tubo.
  6. Ressuspenda o tecido tumoral com 10 mL de meio α-MEM.
  7. Repita a incubação da etapa 2.4 seguida pela etapa 2.5.
  8. Misturar os sobrenadantes médios recolhidos nos passos 2.5 e 2.7.
    NOTA: Seja gentil com todas as etapas. Duas incubações de 6 h induziram a liberação natural de exossomos dos pedaços de tecido tumoral.

4. Ultracentrifugação

  1. Filtrar o sobrenadante através de um filtro microporoso de 0,45 μm.
  2. Centrifugar o sobrenadante a 12.000 × g durante 30 min a 4 °C para remover as vesículas grandes.
  3. Transferir o sobrenadante para um novo tubo e centrifugar a 120.000 × g durante 90 min a 4 °C para recolher os exossomas.
  4. Lave o precipitado do exossomo com PBS (0,01 M) e centrifugue novamente a 140.000 × g por 60 min a 4 ° C.
  5. Suspender os exossomas precipitados em PBS (0,01 M) para utilização imediata ou armazenamento a -80 °C.
    NOTA: Seja gentil com todas as etapas. Execute cada etapa com a menor força centrífuga possível e o menor tempo centrífugo.

5. Apresentação dos resultados da identificação dos exossomas

  1. Identificar a morfologia dos exossomos do tecido tumoral via microscopia eletrônica de transmissão (MET)30.
  2. Determine o tamanho e a concentração de exossomos do tecido tumoral por meio da análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) 30 .
  3. Identificar os marcadores de proteínas exossômicas CD9 e CD63 via western blot (WB)30.
    NOTA: Diretrizes recentes para pesquisa de exossomos, incluindo o uso de CD63, CD9, como critérios para marcadores de exossomos31.

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Resultados

O MET revelou que os exossomos derivados do tecido tumoral por esse método tinham estruturas típicas em forma de taça (Figura 1A), e não houve diferença significativa entre a forma dos exossomos extraídos por esse método e pela digestão enzimática (Figura 1B). Os resultados do NTA revelaram que o diâmetro médio do exossomo era de 172,8 nm, que estava na faixa de 30-200 nm e era consistente com o tamanho dos exossomos; a concentração de partículas foi de 5,9 × 10...

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Discussão

Nesse método, exossomos derivados de tecido tumoral foram extraídos dos tecidos de câncer gástrico ectópico de camundongos nude, e as principais etapas foram a liberação, exsudação, separação e purificação dos exossomos. Vários métodos de separação de exossomos foram projetados e verificados de acordo com as propriedades físicas e composição dos exossomos 2,21,28,29, cada um com vantagens e desvantagens, mas o objetivo é minimizar o impacto de diferent...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Apoio à Ciência e Tecnologia da Província de Sichuan (2024NSFSC0592, 2023YFS0064).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
α-MEMHyCloneSH30265.01B
Anticorpo anti-CD63Biossbsm-43117M
Anticorpo anti-CD9Biossbs-2489R
Tubo de centrífugaThermo339650
Agitador de temperatura constanteThermoMAXQ4450
Pipeta estéril descartável-10 mLJET
EDTABiosharpBS107
Pipeta elétricaThermo9501
Centrífuga de temperatura controlada horizontalThermoSorvall ST1R plus
Analisador de rastreamento de nanopartículasMalvinNanoSight Pro
Tesoura oftálmicaJinzhongY3D010
PBSHyCloneSH30256.01B
Ácido fosfotúngstico   Sigma455970-10G
Tesoura cirúrgicaJinzhongJ21010
Anticorpo secundárioBiossBs-0295GCabra Anti-Coelho IgG H & Microscópio Eletrônico de Transmissão L/FITC
NikonPlan Apo WF
Tubo UltracentrífugoBeckman355618
GSP01001

Referências

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