Perfil de O-glicanos de mucina permetilada usando espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a liberação de O-glicanos das mucinas e a subsequente dessalinização, permetilação e análise usando espectrometria de massa MALDI-TOF.

Resumo

A espectrometria de massa por tempo de voo de dessorção/ionização a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) é uma ferramenta poderosa para o perfil de glicanos de mucina que oferece alta sensibilidade e rendimento. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a análise de glicanos ligados a O de mucinas usando MALDI-TOF MS, abrangendo liberação de glicanos, dessalinização, permetilação e aquisição e análise de dados. Este estudo mostra que a dessalinização baseada em cromatografia de troca iônica leva a uma melhor recuperação de glicanos maiores e melhor qualidade dos espectros produzidos em comparação com a extração em fase sólida usando carbono grafitizado poroso (PGC). Além disso, este trabalho sugere que um tempo de reação de permetilação mais longo do que o empregado atualmente pode ser necessário para a modificação eficiente de estruturas siailiadas. Também demonstramos a importância e a necessidade de dados de fragmentação e conhecimento prévio das vias biossintéticas do O-glicano para a identificação precisa da composição e estrutura do glicano e discutimos os benefícios e limitações inerentes que o MALDI-TOF apresenta na análise da mucina O-glicanos.

Introdução

As mucinas são grandes glicoproteínas que compõem a maioria dos componentes estruturais do muco. Eles são produzidos por células epiteliais especializadas chamadas células caliciformes e sofrem extensa O-glicosilação antes de serem secretadas na superfície da mucosa. A glicosilação das mucinas ocorre no aparelho de Golgi, onde uma família de glicosiltransferases especializadas, polipeptídeo-N-acetilgalactosamina transferases (ppGalNAc-T) inicia o processo ligando um resíduo de GalNAc a uma serina (Ser) ou a uma treonina (Thr)¹. Em seguida, um arsenal de glicosiltransferases estende as estruturas dos glicanos adicionando resíduos de galactose (Gal), N-acetilglucosamina (GlcNAc), GalNAc, ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) e fucose (Fuc), enquanto outras enzimas modificadoras de carboidratos podem realizar reações como a sulfatação dos glicanos¹. Os glicanos que decoram a estrutura da proteína mucina são encontrados principalmente em aglomerados em regiões proteicas ricas em resíduos de Ser e Thr, pois os grupos hidroxila na cadeia lateral desses resíduos servem como locais de O-glicosilação. Essa glicosilação densa dá às mucinas a aparência de uma "escova de garrafa" e é responsável por suas propriedades físicas, como a capacidade de reter grandes quantidades de água, sua capacidade de formação de gel e alta viscoelasticidade ^2,3. Devido a essas propriedades, as mucinas fornecem lubrificação, protegem o epitélio da desidratação e lesões físicas e formam uma barreira física entre o epitélio e seu microambiente ^4,5. Os glicanos de mucina também podem servir como locais de ligação e fonte de carbono para bactérias comensais ou patogênicas ^6,7,8. A organização e a composição do muco são fundamentais para proteger o epitélio, mantendo os micróbios próximos, mas longe da superfície do epitélio. Os glicanos de mucina também participam da comunicação e adesão célula-célula⁹.

Os glicanos de mucina desempenham um papel fundamental na manutenção da homeostase da mucosa, e os perfis aberrantes de glicosilação da mucina estão associados à função de barreira prejudicada, composição alterada da microbiota, aumento da metástase tumoral, doença inflamatória intestinal (DII) e outras doenças 10,11,12. Portanto, o estudo da glicosilação da mucina é importante para entender o papel do muco e das mucinas na saúde humana e pode levar a novas abordagens para o manejo ou tratamento de doenças.

As técnicas baseadas em espectrometria de massa estão entre as opções mais populares para estudar glicanos de mucina. O MALDI-TOF MS é uma técnica de ionização suave que permite a análise de biomoléculas grandes e não voláteis, como glicanos e glicoproteínas¹³. Essa abordagem oferece alta sensibilidade e uma ampla faixa de massa, permitindo a detecção e identificação de misturas de glicanos pouco abundantes e diversas. Além disso, os padrões de fragmentação obtidos a partir de experimentos de espectrometria de massa em tandem (MS / MS) podem fornecer informações estruturais valiosas sobre a composição e sequência de glicanos¹³.

Normalmente, a análise de glicanos ligados a O de mucinas por MALDI-TOF MS envolve um fluxo de trabalho de várias etapas, onde os O-glicanos são primeiro liberados quimicamente da estrutura da proteína usando métodos como eliminação de β redutiva, depois dessalinizados para remover os sais da liberação química e derivatizados para melhorar a ionização e detecção. Os glicanos purificados e derivatizados são então cocristalizados com uma matriz MALDI adequada em uma placa-alvo MALDI e são adquiridos espectros de massa que fornecem informações sobre as massas dos íons glicanos intactos. Em seguida, os glicanos são fragmentados em experimentos de MS / MS para fornecer informações sobre a estrutura dos glicanos¹⁴. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para liberar, dessalinizar e permetilar glicanos e analisá-los por MALDI-TOF MS.

Protocolo

NOTA: Consulte a Figura 1 para obter uma representação esquemática do fluxo de trabalho.

Figura 1: Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. Liberação de glicano

1. Preparação do tampão de eliminação β
   NOTA: Deve ser preparado fresco antes de cada uso.
   1. Pese um pellet de hidróxido de sódio (NaOH) e dissolva-o em uma quantidade adequada de H₂O em um tubo de 50 mL para obter uma solução de 0,1 M.
   2. Num tubo de 5 ml, dissolver 189 mg de boro-hidreto de sódio (NaBH₄) em 5 ml da solução alcalina preparada acima no passo 1.1.1.
      CUIDADO: NaOH é corrosivo e NaBH₄ é corrosivo, tóxico, inflamável e representa um risco à saúde. Ambos os produtos químicos devem ser manuseados sob uma câmara de exaustão usando equipamento de proteção individual adequado. Não dissolva o NaBH₄ diretamente em H₂O, pois ele se decompõe e libera hidrogênio que pode ser autoinflamado.
2. Configuração da reação de eliminação β
   1. Em um frasco de vidro de 4 mL, dissolva até 100 μg de mucinas purificadas em 250 μL de H₂O.
      NOTA: Algumas mucinas podem não se dissolver totalmente e, em vez disso, formar uma suspensão de partículas muito pequenas.
   2. Adicione 250 μL do tampão de eliminação de β e feche bem o frasco com uma tampa revestida de PTFE. Incubar a reação a 45 ^oC por 16 h.
3. Parando a reação
   1. Em um frasco de vidro de 100 mL, adicione 5 mL de ácido acético glacial a 95 mL de H₂O (concentração de 5% (v / v)).
      NOTA: Isso pode ser armazenado em temperatura ambiente e reutilizado.  CUIDADO: O ácido acético é inflamável e corrosivo e deve ser usado em uma capela de exaustão com o equipamento de proteção individual necessário.
   2. No gelo, adicione 1 mL da solução de ácido acético a 5% a cada reação (etapa 1.2.3) de forma gota a gota. Neste ponto, procure a efervescência da liberação de hidrogênio do excesso de NaBH₄. Se a efervescência não tiver parado após a adição de 1 ml de ácido acético a 5%, repita este passo.
      NOTA: Se não houver efervescência após a adição de ácido acético a 5%, a reação de eliminação β pode ser incompleta ou malsucedida.
4. Dessalinização das amostras
   1. Em um frasco de vidro de 100 mL, prepare uma suspensão densa de resina de troca catiônica, forma H⁺ , malha 200-400 em ácido acético a 5% (v / v).
   2. Tampe uma pipeta de vidro com uma pequena quantidade de lã de vidro. Adicione 1,5 mL da suspensão de resina na pipeta de vidro por cima e deixe repousar e escorrer. Isso fará a coluna de dessalinização.
   3. Lave a resina com 2 mL de ácido acético a 5%. Descarte o fluxo.
   4. Adicione a amostra de mucina à coluna de dessalinização. Colete o fluxo em um tubo de 5 mL.
   5. Enxágue os frascos de amostra com 1 mL de ácido acético a 5% e coloque-o na coluna de dessalinização. Colete o fluxo no mesmo tubo.
   6. Lave a coluna 2x com 1 mL de ácido acético a 5%. Colete o fluxo no mesmo tubo.
   7. Utilizar um evaporador centrífugo para remover o ácido acético e concentrar as amostras (5 mbar, 30 ^oC, 2 h).
   8. Congelar as amostras a -80 ^oC e secá-las durante a noite em um liofilizador.
      NOTA: Alternativamente, a evaporação centrífuga pode continuar a secar, mas tornará a redissolução das amostras mais difícil.
   9. Em um frasco de vidro de 100 mL, adicione 5 mL de ácido acético a 95 mL de metanol (concentração de 5% (v/v)).
      CUIDADO: O metanol é inflamável e tóxico. Deve ser usado em uma câmara de exaustão com o equipamento de proteção individual necessário.
   10. Dissolver as amostras em 0,5 ml de ácido metanólico acético e secar as amostras sob uma corrente de azoto. Repita esta etapa 3-5x. Armazenar as amostras secas a 4 ^oC.
5. Permetilação dos glicanos
   1. Em um frasco de vidro de 8 mL, misture a solução de NaOH a 50% (0,2 mL) com 0,4 mL de metanol e vortex completamente. Um precipitado branco se formará que se dissolverá rapidamente novamente.
   2. Usando uma seringa de vidro, adicione 4 mL de dimetilsulfóxido anidro (DMSO) e vortex completamente.
   3. Centrifugue a solução por 2 min a 2.000 × g. Isso formará um gel na parte inferior do tubo, uma fase líquida no meio e sais acumulados na parte superior.
   4. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e os sais, sem perturbar o gel.
   5. Repita as etapas 1.5.2-1.5.4 5x até que não se formem mais sais. Se os sais grudarem nas paredes do tubo, agite suavemente o tubo para colocar os sais em suspensão, sem perturbar o gel no fundo, ou remova-os usando uma pipeta de vidro Pasteur.
   6. Depois que não houver mais formação de sais, ressuspenda o gel em 4 mL de DMSO anidro. Esta suspensão é a base de permetilação.
      NOTA: Esta quantidade de base de permetilação é suficiente para ~ 25 amostras. As quantidades podem ser ajustadas em conformidade.
   7. Às amostras secas, adicionar 100 μL de DMSO anidro e 150 μL da base de permetilação. Usando uma pipeta de vidro, adicione 80 μL de iodometano o mais rápido possível, para evitar a absorção de umidade do ambiente.
      CUIDADO: O iodometano é tóxico e representa um risco para a saúde e o meio ambiente. Deve ser usado em uma câmara de exaustão com o equipamento de proteção individual necessário.
   8. Incubar as reações de permetilação por 30 min à temperatura ambiente com agitação vigorosa.
   9. Adicione 0,5 mL de H₂O para encerrar a reação. As amostras ficarão turvas.
      NOTA: Se as amostras não ficarem turvas, é possível que a reação de permetilação esteja incompleta.
   10. Lave as amostras com nitrogênio até que fiquem claras.
   11. Carregue as amostras em uma placa de extração de 96 poços hidrofílico-lipofílico-balanceado (HLB) (60 mg) ou cartuchos de HLB. Aplique pressão positiva para empurrar as amostras através da fase sólida a uma taxa de fluxo de ~ 1 mL / min. Se estiver usando cartuchos HLB, use uma tetina de borracha ou coletor de vácuo para aplicar pressão nas amostras. Descarte o fluxo.
   12. Lave os poços com 2 x 1 mL de H₂O. Aplique pressão positiva e descarte o fluxo.
   13. Eluir os glicanos da placa HLB usando 1 mL de metanol. A pressão de aplicação é apenas até que o metanol comece a sair da placa. Então, o fluxo de gravidade é suficiente para fornecer a vazão necessária. Colete o fluxo.
   14. Repita a etapa de eluição mais uma vez.
   15. Seque as amostras usando um evaporador centrífugo
   16. Em um frasco de vidro de 4 mL, prepare o tampão TA50 misturando 1 mL de acetonitrila, 998 μL de H₂O e 2 μL de ácido trifluoroacético.
       CUIDADO: A acetonitrila é inflamável e o ácido trifluoroacético é corrosivo. Ambos devem ser usados em uma hotte, usando equipamentos de proteção individual adequados.
   17. Em um tubo de microcentrífuga, prepare a solução da matriz dissolvendo 10 mg de super-DHB [mistura 9:1 (p/p) de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico e ácido 2-hidroxi-5-metoxibenzóico] em 1 mL de TA50.
   18. Dissolver as amostras secas em 10 μL de TA50.
   19. Misture 1 μL da amostra com 1 μL da solução de matriz, coloque-a em uma placa alvo MALDI de aço e deixe secar.

2. Análise MALDI TOF das amostras

1. Configurando para adquirir dados de íons pai
   1. Dispare 1.000 tiros do laser a 50% de intensidade.
      NOTA: Eles podem variar dependendo das configurações globais do instrumento e podem ser ajustados conforme necessário.
   2. Na guia Portadora de laser , defina a configuração de caminhada aleatória para completar a amostra.
   3. Na guia Detecção , defina a faixa de massa para 500 - 3.000; Aumente esse intervalo se picos fortes forem observados em 2.500-3.000 m / z. Defina o ganho do detector para 20x.
      NOTA: O ganho pode variar com base nas configurações globais do instrumento e pode ser ajustado conforme necessário.
   4. Na guia Espectrômetro , defina a polaridade como positiva e a Supressão de matriz como Deflexão, 300 Da.
   5. Clique em Iniciar | quando a aquisição de dados terminar, Salvar como para salvar os dados em um diretório apropriado.
2. Abrindo os espectros pai para adquirir espectros de fragmentação
   1. Depois de clicar com o botão direito do mouse nos espectros, selecione Localizar lista de massas.
   2. Na lista gerada, selecione os íons relevantes para fragmentação e clique em adicionar à lista MS/MS após clicar com o botão direito do mouse nos picos selecionados.
   3. Clique com o botão direito do mouse novamente na lista de massa e selecione Lista MS/MS.
   4. Clique em Enviar para flexControl.
   5. No flexControl, carregue o método LIFT e navegue até a guia LIFT .
   6. Selecione cada pico carregado um por um e adquira os íons pai e fragmento alternando entre os modos Pai e Fragmentos. Ajuste a intensidade do laser e o número de disparos conforme necessário. Clique em Salvar para salvar os dados após a fragmentação de cada íon pai.
   7. Exporte os espectros no formato '.ascII'.
      NOTA: Isso pode ser importado posteriormente para o Glycoworkbench para análise posterior.
3. Análise de dados usando glycoworkbench
   1. No Glycoworkbench, carregue o arquivo .ascII exportado do espectro de massa e execute uma correção de linha de base e filtragem de ruído usando os botões relevantes na parte inferior da janela, antes de calcular os centróides de pico. Na janela pop-up, escolha a faixa de massa apropriada, a relação sinal/ruído mínimo e a intensidade de pico mínima de MS.
   2. Depois que os centróides de pico forem calculados, use a ferramenta Glyco-Peakfinder para encontrar composições de estrutura que correspondam à lista de picos. Selecione perMe como a Derivatização, redEnd como a Extremidade Redutora e o número mínimo e máximo de resíduos esperados.
      1. Para mucinas, selecione Hexose, N-Acetil-Hexosamina, Desoxi-Hexose e N-Acetil-Ácido Neuramínico. Para glicanos sulfatados, use a outra opção de resíduo com uma massa de 87,9. Para dados MALDI-TOF, defina Max # íons Na e Max # cargas são definidas como 1 e a precisão como 0.5 Da.
         NOTA: A precisão pode precisar ser aumentada ainda mais, dependendo da calibração do espectrômetro de massa.
   3. Selecione todas as anotações corretas mantendo pressionada a tecla control e clicando em cada anotação; em seguida, clique com o botão direito do mouse na anotação e clique em Adicionar à lista de picos anotados.
   4. Para gerar um relatório comparando vários espectros anotados, na guia ferramentas , em relatórios, selecione Criar um relatório comparando diferentes perfis. Imprima o relatório como PDF para salvá-lo.
   5. Depois de identificar os picos de glicanos, calcule a abundância relativa de cada estrutura individual como uma porcentagem da área total sob a curva de todos os picos de glicanos.
   6. Para a análise dos espectros de fragmentação, carregue os espectros no Glycoworkbench e gere a lista de picos como na etapa 2.3.1.
   7. Desenhe estruturas de glicanos putativas que correspondam às composições de glicanos anotadas. Gere fragmentos para cada estrutura desenhada selecionando a opção de fragmentos de computação relevantes na ferramenta Fragmentos . Em seguida, selecione todos os fragmentos, clique com o botão direito do mouse neles e clique em Copiar fragmentos para a tela.
   8. Para apoiar ainda mais a análise da fragmentação, selecione um pico de interesse clicando nele no visualizador de espectro. Em seguida, clicando com o botão direito do mouse e selecionando Localizar todas as estruturas que correspondem aos picos, interrogue o m/z do pico selecionado em bancos de dados on-line para estruturas de glicanos putativas.
   9. Selecione as estruturas putativas de interesse e copie-as para a janela de tela do software após clicar com o botão direito do mouse e selecionar a opção apropriada.
   10. Para calcular os possíveis fragmentos que podem ser gerados a partir de cada estrutura de glicano, selecione a estrutura de interesse na tela e, em seguida, na guia Ferramentas , escolha Fragmentos e Calcular fragmentos para a estrutura atual.
   11. Se fragmentos para mais de uma estrutura de glicano tiverem sido calculados, exiba a tabela de comparação na guia de resumo, na exibição da tabela Fragmentos.
   12. Selecione os fragmentos que correspondem à lista de pico para cada estrutura de glicano potencial e selecione Copiar fragmentos para tela no menu suspenso do botão direito do mouse.
   13. Na guia Ferramentas , em criador de perfil, selecione anotar picos com todas as estruturas e clique em Ferramentas | Relatórios | Crie um relatório das anotações. Imprima o relatório como PDF para salvá-lo.

Resultados

Nos resultados a seguir, a mucina gástrica suína (PGM) foi usada para otimizar as etapas de dessalinização e permetilação. Para comparar duas abordagens de dessalinização comumente usadas, após a liberação dos glicanos, as amostras foram dessalinizadas por troca catiônica (conforme descrito no protocolo acima) e co-evaporação de borato com metanol ou por extração em fase sólida com cartuchos de carbono grafitizado poroso (PGC). Isso requer pré-condicionamento do cartucho com 80% de acetonitrila e 100% de H₂O, uma etapa de lavagem com ácido trifluoroacético (TFA) a 0,1% (v/v) e eluição dos glicanos com 2 mL de acetonitrila a 25% em TFA a 0,1%, 2 mL de acetonitrila a 50% em TFA a 0,1% e 2 mL de acetonitrila a 80% em TFA a 0,1%.

Os espectros resultantes após a permetilação foram analisados na faixa de m/z 500 a m/z 2.500. Um total de 33 estruturas de glicanos foram identificadas na amostra dessalinizada por troca iônica e remoção de borato, enquanto 32 estruturas foram identificadas na amostra dessalinizada por extração de PGC (Figura 2A). Uma estrutura de glicano não foi identificada na amostra dessalinizada do PGC (marcada com um asterisco na Figura 2A). Esta análise comparativa mostrou que a recuperação de glicanos maiores não foi tão eficiente após a extração do PGC, em comparação com a troca iônica. Isso também é evidenciado pela abundância relativa de glicanos maiores, que representam 21% do total de glicanos após a extração do PGC, em oposição a 31% para a troca iônica. Além disso, a dessalinização por troca iônica e remoção de borato levou a espectros com relações sinal-ruído aumentadas em comparação com aqueles produzidos após a dessalinização por extração em fase sólida com PGC (Figura 2B).

Para otimizar o tempo de reação de permetilação, alíquotas da mesma reação de permetilação foram temperadas adicionando H₂O em diferentes pontos de tempo (ou seja, 5 min, 30 min ou 90 min). Os resultados mostraram que 33 picos de glicanos puderam ser identificados na faixa m/z 500 a m/z 2.500, nas amostras permetiladas por 30 ou 90 min, com os espectros resultantes sendo semelhantes. Em contraste, apenas 31 picos de glicano puderam ser identificados quando a permetilação foi realizada por 5 min (Figura 3). Curiosamente, as duas estruturas que não foram identificadas neste menor tempo de reação (marcadas com um asterisco na Figura 3) são as duas estruturas sialicadas, sugerindo que a modificação dos ácidos siálicos não é eficiente em 5 min, nas condições testadas.

A fragmentação foi usada para cada pico de glicano PGM para confirmar a composição do glicano e determinar a estrutura do glicano. Dois exemplos são apresentados aqui (Figura 4). Na Figura 4A, o espectro de fragmentação de um pico a 983 m / z é apresentado. A composição do glicano é atribuída como HexNAc₂Hex₂. Existem duas estruturas potenciais para esta composição de glicanos, Gal-(Gal-GlcNAc-Gal-)-GalNAc (glicano 1) ou Gal-GlcNAc-Gal-GalNAc (glicano 2). A fragmentação deste composto produziu um espectro de massa com picos que podem ser atribuídos a diferentes fragmentos do glicano. O pico em m/z 529 e o pico em m/z 708 são característicos das estruturas 1 e 2, respectivamente, e podemos concluir que ambos os glicanos 1 e 2 estão presentes na mistura de glicanos PGM.

Na Figura 4B, o espectro de fragmentação de um pico em m / z 2,026 é apresentado. A Glycoworkbench calculou duas composições potenciais de glicanos para este pico, Hex₃HexNAc₁Neu5Ac₃ e Hex₃HexNAc₄dHex₂. A composição sialilada tem uma precisão menor (~ 160 ppm e 178 ppm, respectivamente), sugerindo que a primeira deve ser a escolha correta. No entanto, o perfil de fragmentação indica a presença de Fuc, não Neu5Ac; portanto, a segunda composição é a correta. Aqui, quatro estruturas putativas de glicanos são apresentadas, e o espectro foi anotado com os fragmentos computados de cada estrutura putativa de glicanos. No espectro anotado, podemos ver que os picos característicos apenas dos glicanos 4 e 6 estão presentes, enquanto nenhum pico característico dos glicanos 3 e 5 foi identificado. Com base nesses dados, podemos concluir que os glicanos 4 e 6 estão presentes.

Figura 2: Comparação dos picos de glicanos de acordo com a dessalinização e extração em fase sólida. (A) Comparação do perfil de glicanos PGM após dessalinização por cromatografia de troca catiônica e remoção de borato ou por extração em fase sólida de PGC. (B) Comparação das duas abordagens de dessalinização na relação sinal-ruído resultante para cada pico de glicano identificado. O asterisco especifica o glicano que só foi identificado nas amostras dessalinizadas por troca catiônica e remoção de borato. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Comparação do perfil de glicano PGM após permetilação por 5, 30 ou 90 min. Os asteriscos indicam os glicanos sialilados que só foram identificados após 30 ou 90 min de permetilação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Exemplos de espectros de fragmentação de glicanos PGM. (A) Fragmentação do pico do glicano em m / z 983. (B) Fragmentação do pico de glicano em m/z 2026. As caixas indicam estruturas potenciais de glicanos. Os números sobre os fragmentos indicam de qual estrutura de glicano eles podem ser derivados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Para estudar glicanos, os pesquisadores empregam uma variedade de metodologias, desde o uso de lectinas para identificar epítopos específicos até cromatografia líquida mais sofisticada - espectrometria de massa em tandem (LC-MS) e ressonância magnética nuclear (RMN) para obter caracterização detalhada das estruturas dos glicanos. As principais vantagens do MALDI-TOF MS sobre as abordagens alternativas são a sensibilidade e a natureza de alto rendimento do método¹³. No entanto, como não há capacidade de separar compostos isobáricos, diferentes estruturas de glicanos com o mesmo valor m/z produzem uma mistura de fragmentos sob MS/MS que é então difícil de desconvoluir¹³. Se for necessário determinar a estrutura exata dos glicanos de mucina, LC-MS deve ser o método de escolha.

Aqui, apresentamos um protocolo para a análise de glicanos de mucina por MALDI-TOF MS que inclui todas as etapas críticas do processo, desde a liberação de glicanos, dessalinização e permetilação, até a aquisição e análise de dados. É importante reconhecer que cada uma dessas etapas pode ser realizada usando abordagens diferentes e todas elas vêm com benefícios e limitações associados.

Neste protocolo, utilizamos a eliminação de β redutora para liberar os glicanos. A reação ocorre sob condições básicas. Se as amostras de mucina já estiverem em suspensão e não tiverem sido previamente purificadas, o pH deve ser verificado com um papel indicador de pH; se ácido, precisa ser aumentado para um pH de ~ 8-9. Uma limitação dessa abordagem é que as condições básicas necessárias para a liberação dos glicanos também levam à hidrólise e, portanto, à perda de grupos O-acetil frequentemente encontrados nos ácidos siálicos, em uma reação conhecida como saponificação.

Embora outros métodos tenham sido descritos na literatura para a liberação de glicanos 15,16,17,18, alguns dos quais podem preservar os grupos O-acetil lábeis, a eliminação β redutora continua sendo o padrão-ouro no campo. Essa abordagem requer uma alta concentração de sais. Sais e outros contaminantes de supressão de íons precisam ser removidos antes da análise MALDI-TOF¹⁹, pois podem afetar a eficiência de ionização e quantificação de glicanos. Aqui, a cromatografia de troca catiônica, seguida pela remoção do borato por evaporação do metanol, mostrou-se a abordagem mais eficiente para dessalinizar os glicanos liberados da mucina. Nesse caso, os glicanos não interagem com a resina e, em vez disso, fluem através dela, enquanto os íons de sódio ficam presos na resina. No entanto, a preparação das colunas de troca iônica é trabalhosa e torna essa abordagem ineficiente para experimentos em larga escala com inúmeras amostras. Nesses casos, a dessalinização PGC pode ser preferida, pois essa resina também está disponível em um formato de placa de 96 poços. No entanto, como apresentado acima, a dessalinização por extração de PGC pode levar a uma eluição ineficiente, particularmente de glicanos maiores, e isso deve ser considerado na interpretação dos resultados.

Embora os glicanos nativos também possam ser analisados por MALDI-TOF, a permetilação é geralmente empregada, pois essa reação aumenta significativamente a sensibilidade de detecção, uma vez que os glicanos nativos têm baixa eficiência de ionização²⁰. Além disso, a permetilação torna os glicanos carregados negativamente, como os glicanos sulfatados ou sialilados, mais fáceis de detectar no modo positivo e preserva os epítopos lábeis dos glicanos, como os ácidos siálicos ou a fucose²⁰. Mais comumente, a permetilação é permitida por 5-10 min^14,21, com alguns relatos permitindo que a reação continue até 40 min²². Aqui, mostramos que, nas condições testadas, os glicanos sialilados não foram detectados de forma eficiente após 5 min de permetilação, sendo necessária uma incubação mais longa.

Além do tempo de reação, outro fator que pode afetar a eficiência da permetilação é o teor de água na reação. A presença de água pode levar à submetilação ou metilação parcial dos glicanos, onde nem todos os grupos hidroxila foram convertidos em grupos metil²³. Isso pode ser facilmente determinado como se a submetilação ocorresse, grupos de picos que diferem em 14 Da (a diferença de massa entre os grupos hidroxila e metil) podem ser observados nos espectros de massa. Esse problema pode ser resolvido repetindo a reação de permetilação e reanalisando os dados.

Um fator limitante na análise de glicanos é a interpretação dos espectros. Apesar dos avanços recentes, esse processo ainda é amplamente manual e requer bom conhecimento e compreensão das vias biossintéticas do glicano para anotar com precisão os espectros. Ferramentas como o Glycoworkbench²⁴ podem ajudar fornecendo possíveis anotações, estruturas de glicanos e composições, mas devido à heterogeneidade inerente das misturas de glicanos, os pesquisadores ainda precisam tomar a decisão de qual escolha é a correta. No exemplo apresentado acima usando PGM, o Glycoworkbench ofereceu duas composições potenciais de glicanos para o pico em mz 2.025,7620 e, com base no perfil de fragmentação, concluímos que a estrutura fucosilada estava presente, e não a sialilada. No entanto, se um espectro de fragmentação não estiver disponível (o que geralmente é o caso de glicanos de baixa abundância), os pesquisadores podem basear a anotação no conhecimento de que glicanos com uma composição de Hex3HexNAc1Neu5Ac3 são encontrados em gangliosídeos, em vez de mucinas, e esta opção não deve, portanto, ser considerada no contexto do PGM. Assim, as estruturas ou composições de glicanos identificadas devem ser cruzadas com publicações anteriores e devem estar de acordo com os princípios da biossíntese de O-glicanos. No geral, este protocolo serve como um recurso valioso, especialmente para pesquisadores que são novos no campo da glicobiologia e com interesse no estudo das interações que ocorrem na interface da mucosa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipetas pasteur de vidro de 150 mm	Fisher Scientific	15202699	Consumíveis Referência no texto (se aplicável): pipeta de vidro
Tubos de 5 mL	Eppendorf	30122305	Consumíveis
Placa de extração HLB de 96 poços	Fisher Scientific	16553290	Consumíveis
ácido acético	Sigma-Aldrich	A6283	Reagente
Acetonitrilo	Fisher Scientific	15624520	Reagente
DMSO anidro	Sigma-Aldrich	5.89569	Reagente
Metanol anidro	Sigma-Aldrich	5.89596	Reagente
Espectrômetro de massa Autoflex	Bruker		Equipamento
DOWEX 50w x8 resina, forma H+, malha 200-400	Sigma-Aldrich	44519	Reagente Referência no texto (se aplicável): resina de troca catiônica
Aquecedor de bloco seco	Subvenção	QBD2	Equipamento
Evaporador/Concentrador para Aquecedores de Bloco	Cole-Palmer	WZ-36610-99	Equipamento
flexAnálise	Bruker		Software, proprietário
flexControl	Bruker		Software, proprietário
Genevac EZ-2	Biofarmacêutica	EZ-2	Equipamento Referência no texto (se aplicável): evaporador centrífugo
frascos de vidro com tampas de PTFE correspondentes (4 mL)	Wheaton	DWKW224582-144EA	Consumíveis
frascos de vidro com tampas de PTFE correspondentes (8 mL)	Fisher Scientific	11587413	Consumíveis
Lã de vidro	Supelco	1.04086	Consumíveis
Bancada de glicotrabalho	NA		Software; Disponível para download de https://glycoworkbench.software.informer.com/
Cartuchos HLB SPE	Supelco	57493-U	Consumível, como alternativa à placa de extração HLB de 96 poços
Iodometano	Sigma-Aldrich	289566	Reagente
Placa alvo MALDI	Bruker		Equipamento
Liofilizador ModulyoD	Thermo Fisher	ModulyoD-230	Equipamento Referência no texto (se aplicável): liofilizador
NaBH4	Sigma-Aldrich	452882	Reagente
Pellets NaOH	Sigma-Aldrich	567530	Reagente
Solução NaOH 50%	Sigma-Aldrich	415413	Reagente
Processador de Pressão-96 positiva	Águas	186006961	Equipamento
super DHB	Sigma-Aldrich	50862	Reagente
Ácido trifluoroacético	Sigma-Aldrich	T6508	Reagente