Artigo de método

Transdução retroviral eficiente e homing competitivo para investigar a localização de células T mediadas por GPCR em diversos microambientes teciduais

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DOI:

10.3791/67754

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28 de março de 2025

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Palo Alto Veterans Institute for Research, 3Veterans Affairs Palo Alto Health Care System

Neste artigo

Resumo

Apresentamos protocolos aprimorados para transdução retroviral de receptores de tráfego e homing competitivo para estudar o posicionamento de linfócitos específicos de órgãos e microambientes mediados por receptores. Este método oferece informações valiosas sobre os mecanismos de tráfego de células imunes e tem aplicações potenciais em futuras pesquisas básicas e terapêuticas.

Resumo

Compreender como a expressão do receptor acoplado à proteína G (GPCR) afeta o posicionamento celular em diversos microambientes teciduais é essencial para elucidar os mecanismos de tráfego de células imunes. Apresentamos um ensaio de homing competitivo projetado para estudar a localização de células T mediadas por GPCR em órgãos que expressam seus ligantes quimioatraentes cognatos, aplicável a estudos de curto e longo prazo. A abordagem envolve um protocolo aprimorado para transdução de células T pelo vírus de células-tronco murinas recombinantes (MSCV) para expressar o GPCR de interesse ou uma construção de controle, seguido de homing competitivo em camundongos receptores. A distribuição celular em diferentes órgãos é analisada usando citometria de fluxo e/ou microscopia confocal. Em experimentos de curto prazo (10-12 h), a microscopia confocal revelou padrões distintos de localização celular, incluindo alvéolos, submucosa brônquica, locais venosos e interstício no pulmão, bem como o epitélio que reveste a traqueia, estômago e corno uterino. Em estudos de longo prazo (1-7 semanas), a citometria de fluxo forneceu informações sobre o acúmulo preferencial de células, revelando mudanças dinâmicas e potencial maturação ou reposicionamento dentro dos tecidos ao longo do tempo. Este ensaio de homing competitivo é uma ferramenta robusta para estudar o posicionamento celular mediado por GPCR, oferecendo informações valiosas sobre a distribuição específica do tecido e aplicações potenciais em imunologia e pesquisa terapêutica.

Introdução

Os receptores acoplados à proteína G (GPCRs) são fundamentais na regulação de uma variedade de processos celulares, incluindo transdução de sinal, neurotransmissão, regulação hormonal e migração de células imunes1. Eles desempenham um papel crucial no controle espaço-temporal da migração e localização de linfócitos2. Durante a fase de preparação das respostas imunes, o microambiente local e as interações celulares levam os linfócitos T a expressar um conjunto único de moléculas de adesão e receptores de quimiocinas conhecidos como receptores de homing. Essa adaptação permite que as células T com experiência em antígeno se envolvam com células endoteliais (CEs) específicas de órgãos e migrem para tecidos-alvo distintos. A capacidade das células T de adquirir tropismo tecidual é vital para respostas efetivas de recordação, particularmente no contexto de infecções recorrentes que afetam o mesmo órgão 3,4.

Os GPCRs guiam as células imunes para tecidos e órgãos específicos, onde desempenham funções críticas - como direcionar as células T CD8 + e NK para locais tumorais para ação citotóxica ou ajudar as células T CD4 + a orquestrar respostas imunes, apoiando a ativação de outras células imunes. Compreender como os GPCRs direcionam as células T para seus locais precisos é essencial para o avanço das imunoterapias direcionadas 5,6. O desafio, no entanto, está em modelar essas interações complexas in vitro, já que é difícil replicar pistas espacialmente restritas e sinais quimiotáticos direcionais simultaneamente.

Elucidar os papéis de receptores leucocitários específicos também é frequentemente desafiador devido à sua frequência limitada de expressão em populações endógenas e ao fato de que esses receptores normalmente decoram tipos de células distintas. Essa complexidade dificulta o isolamento do papel de um receptor específico de outros mecanismos específicos de subconjuntos celulares. Idealmente, os métodos devem comparar populações semelhantes, diferindo apenas no receptor de interesse para fornecer insights claros.

Para superar esses desafios, adotamos um ensaio de homing competitivo que emprega transdução retroviral MSCV recombinante para expressão eficiente de GPCR em células T. Os vetores retrovirais MSCV, que combinam elementos dos vetores MESV baseados no vírus do sarcoma mieloproliferativo (PCMV) e dos vetores LN baseados no vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV), incorporam um sinal de empacotamento híbrido estendido derivado dos vetores LN7. Essa modificação aumenta a eficiência da entrega de genes, permitindo estudos de curto e longo prazo da localização de células T in vivo. Ao utilizar partículas retrovirais de alto título e microscopia confocal, a abordagem permite a visualização precisa do posicionamento e das interações das células T em ambientes complexos de tecidos. Apresentamos protocolos detalhados para a transdução retroviral de receptores de tráfego e a realização de ensaios de homing controlados internamente (chamados competitivos) para estudar o posicionamento de linfócitos específicos de órgãos e microambientes mediados por receptores. O objetivo geral deste método é fornecer informações valiosas sobre os mecanismos de tráfego de células imunes e permitir aplicações futuras tanto na pesquisa básica quanto no desenvolvimento terapêutico.

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Protocolo

Todos os camundongos neste estudo foram mantidos em instalações específicas livres de patógenos (SPF) no Veterans Affairs Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). Os camundongos B6 / SJL Prprc Pep3BoyJ (CD45.1), C57B6 / J (CD45.2) e Rag1-/- foram adquiridos da Jackson Laboratories. Embora tenhamos usado o PepBoy para obter células CD45.1, recomendamos o uso do JAXBoy (C57BL/6J-Ptprcem6Lutzy/J). JAXBoy é uma cepa totalmente coisogênica gerada por CRISPR em vez do retrocruzamento tradicional, o que melhora a consistência genética. Historicamente, os estudos marcados com o alótipo CD45 usando camundongos PepBoy (CD45.1), que não são totalmente congênicos, incluíram ensaios de controle e recirculação com comparações de tipo selvagem (WT / WT) para abordar a variabilidade potencial. Com os camundongos JAXBoy agora disponíveis como uma alternativa totalmente isogênica, esses controles adicionais podem não ser mais necessários. Os pesquisadores ainda devem considerar que as diferenças entre as variantes CD45.1 e CD45.2 - como seus papéis como proteínas tirosina fosfatases - podem influenciar o comportamento celular e os padrões de homing. Todos os protocolos discutidos no texto e abaixo foram aprovados ou atendem às diretrizes do credenciado Departamento de Medicina de Animais de Laboratório e do Painel Administrativo de Cuidados com Animais de Laboratório do VA Palo Alto Health Care System (VAPAHCS). Os animais foram sacrificados usando procedimentos aprovados. Camundongos de ambos os sexos, com idades entre 8 e 12 semanas, foram incluídos nos experimentos.

1. Preparação do vetor MSCV

  1. Compre o vetor retroviral MSCV-IRES-Thy1.1 com a região codificadora do gene de interesse do camundongo (GOI) ou um ORF_Stuffer (controle ORF negativo)
    NOTA: Esta construção inclui o marcador de superfície Thy1.1 ao lado do gene GPCR de interesse. O ligante Internal Ribosome Entry Site (IRES) permite a co-expressão do GPCR com o Thy1.1, facilitando a identificação de células transduzidas por citometria de fluxo ou purificação e isolamento por esferas magnéticas. Isso é particularmente útil quando anticorpos específicos para o GPCR não estão disponíveis, como costuma ser o caso de GPCRs mal estudados.
  2. Adquira o plasmídeo MSCV na forma bacteriana e cultura inoculando o caldo Luria-Bertani (LB) suplementado com seleção antibiótica apropriada com base no gene de resistência codificado pelo plasmídeo (por exemplo, ampicilina, canamicina ou cloranfenicol). O meio LB consiste em triptona (10 g/L), extrato de levedura (5 g/L) e NaCl (10 g/L), ajustado para pH 7,0 e esterilizado em autoclavagem. Incubar a cultura a 37 °C numa incubadora agitável (220 RPM) durante a noite.
  3. Prepare estoques de plasmídeos usando técnicas padrão de biologia molecular usando um kit de preparação de DNA.
  4. Após o isolamento do ADN, medir a concentração de ADN com um espectrofotómetro e preparar soluções de plasmídeos funcionais a uma concentração de 1 μg/μl. Armazenar os plasmídeos a -20 °C para utilização futura.

2. Estabelecimento de cultura de linha celular de embalagem

NOTA: Usamos células Platinum E (Plat-E) da Cell Biolabs. As células Plat-E são uma linhagem celular baseada em 293T com um promotor EF1α, que fornece uma expressão estável e de alto rendimento de proteínas estruturais retrovirais (genes gag, pol e env), permitindo o empacotamento retroviral com uma única transfecção de plasmídeo8. Embora outras linhagens celulares, como NIH-3T3 ou 293T, possam ser usadas, não testamos essas alternativas.

  1. Prepare o meio celular Plat-E adicionando DMEM, 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, blasticidina (10 μg/mL) e puromicina (1 μg/mL). Use blasticidina e puromicina para manutenção celular, mas omita-os durante e após a transfecção.
  2. Células Plate Plat-E enviadas congeladas em 1,0 mL, a >3 x 106 células/mL em DMEM, 20% FBS e 10% DMSO. Descongele-os rapidamente em banho-maria a 37 °C. Transfira todas as células descongeladas para um tubo cônico de 15 mL contendo meio de cultura Plat-E.
  3. Centrifugue a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio Plat-E pipetando suavemente para criar uma suspensão de célula única.
  4. Adicione 9 mL de meio Plat-E a uma placa de cultura de 10 cm e, em seguida, transfira 1 mL de células ressuspensas para a placa. Confirme se as células descongeladas são viáveis misturando um volume igual de suspensão celular e azul de tripano e contando as células viáveis (não coradas) e mortas (coradas com azul) usando um hemocitômetro ou contador de células, visando >70% de viabilidade.
  5. Incubar as células a 37 °C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2. Não troque o meio nos primeiros 3 dias; É normal observar células flutuantes e mortas no primeiro degelo.
  6. Quando as células atingirem 85% -90% de confluência, lave com DMEM / PBS Ca- / Mg-. Separe as células usando 2 mL de tripsina a 0,05% / EDTA 0,5 mM e incube por 3 min a 37 ° C. Adicione 8 mL de meio Plat-E, colete as células em um tubo cônico de 15 mL e centrifugue a 450 x g por 5 min a 4 ° C.
  7. Divida em uma proporção de superfície de 1:10 ou 1:5 (ou seja, semeie novas placas com 1/10 ou 1/5 do volume total do prato original). Ressuspender em um volume final de 10 mL de meio Plat-E e incubar a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO2.
  8. Alíquota do resto das células em 1 mL de FBS com 10% de DMSO e congelar a -80 °C e, posteriormente, em nitrogênio líquido para uso a longo prazo.
    NOTA: Trate as células conforme descrito acima quando estiverem próximas de 85% confluentes. Para manter a saúde celular ideal, evite a confluência excessiva e procure divisões de 3 dias com diluição de 1:10. Se o crescimento diminuir, use uma alíquota nova. O desempenho celular normalmente diminui com as passagens subsequentes. Recomendamos o uso de células para transfecção entre as passagens 4 e 15 para obter melhores resultados.

3. Produção de células transduzidas

  1. Dia 1: Células Seed Plat E
    NOTA: Calcule o número de células e placas Plat E necessárias. Usamos 1 mL de sobrenadante viral por poço em uma placa de 24 poços para transfectar células 2x. Normalmente usamos aproximadamente duas placas transfectadas em placa de Petri de 10 cm com células Plate-E por placa de 24 poços com células T em cultura.
    1. Comece revestindo placas de cultura de tecidos de 10 cm com 5 mL de poli-D-lisina de 50 μg/mL em água estéril. Incubar em temperatura ambiente por 45 min. Lave 2x com PBS Ca-/Mg estéril - para garantir que nenhum resíduo permaneça.
      NOTA: Recomendamos revestir as placas, pois as células Plat-E tendem a se desprender após a transfecção, levando a um desempenho celular ruim e à redução da produção de títulos virais.
    2. Separar as células Plat-E conforme descrito acima no passo 2.6 e realizar um ensaio de exclusão de azul de tripano para garantir a viabilidade. Misture um volume igual de suspensão celular e Trypan Blue. Conte as células viáveis (não coradas) e mortas (coradas de azul) usando um hemocitômetro/contador de células. Semeie 3 x 10⁶ células vivas em uma placa de Petri de cultura de tecidos de 10 cm com meio Plat-E livre de antibióticos.
      NOTA: As placas semeadas devem atingir 85%-90% de confluência no dia seguinte. Se isso não for alcançado, considere usar uma alíquota de célula diferente. Ajuste a densidade de semeadura com base no tempo de revestimento; Para revestimento noturno, podem ser usadas 3,5 x 106 células.
  2. Dia 2: Transfecção de células Plat-E e placas de revestimento para células T com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28
    1. Substitua o meio nas culturas de células Plat-E por 6,5 mL de meio sérico reduzido.
    2. Prepare a mistura de transfecção de acordo com as instruções do fabricante para o reagente de lipofectamina (Lipofectamine 2000 foi usado neste estudo).
    3. Para cada placa, misture 45 μL de Lipofectamine 2000 com 210 μL de meio de soro reduzido em um tubo e 15 μg de DNA com 235 μL de meio de soro reduzido em outro tubo. Combine o conteúdo dos tubos pipetando 3x-4x.
    4. Incube a mistura por 5-20 min em temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de lipofectamina / DNA e, em seguida, adicione gota a gota nas placas. Incubar as placas durante 16 h a 37 °C.
    5. Poços de ativação de células T: Revestir placas de 24 poços com 5 μg/mL de CD28 anti-camundongo (37,51) e 10 μg/mL de CD3 anti-camundongo (145-2c11) em 375 μL/poço PBS durante a noite a 4 °C ou por 3-4 h na incubadora a 37 °C no Dia 3.
      NOTA: Embrulhe as placas em filme transparente se incubar durante a noite para evitar a evaporação. O ativador de camundongo Dynabeads CD3 / CD28 pode ser usado como uma alternativa com resultados comparáveis.
  3. Dia 3: Altere a mídia Plat-E e isole e ative as células T
    1. Troque o meio de transfecção Plat-E para 14 mL de meio completo DMEM pela manhã. Prepare a mídia de células T adicionando RPMI-10: RPMI 1640 com L-glutamina, 10% de FBS, 1% de penicilina/estreptomicina, 1x MEM de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio, 50 μM de β-mercaptoetanol e 1 mM de HEPES.
    2. Eutanasiar camundongos JAXBoy (CD45.1) e C57B6/J (CD45.2) usando inalação de CO2seguida de luxação cervical. Isole os baços e os gânglios linfáticos em condições estéreis.
    3. Amasse suavemente os baços em um filtro de células de malha de nylon de 100 μm com meio RPMI em uma placa de 6 poços usando um êmbolo de seringa.
    4. Transfira a solução através de um filtro de células de malha de nylon de 40 μm para uma suspensão de célula única para um tubo cônico de 50 mL. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C e lavá-los com PBS Ca-/Mg-.
    5. Execute a seleção magnética negativa usando o kit de isolamento T / T CD4 do mouse seguindo as instruções do fabricante ou, alternativamente, classifique as células usando FACS estéril
    6. Conte as células T usando um contador de células e coloque-as nos poços de ativação de células T a 1-1,5 x 106 por poço em 1 mL de meio RPMI-10 por poço. Incubar as células a 37 °C com 5% de CO₂ em uma incubadora umidificada. Aguarde 24-48 h para ativação adequada, conforme avaliado ao microscópio, conforme explicado nas notas abaixo.
      NOTA: A reticulação de CD3 e CD28 ativa efetivamente as células T nesta configuração. Um baço de camundongo normalmente produz aproximadamente 1 x 108 esplenócitos. As células T CD4+ geralmente constituem cerca de 10% da população total de esplenócitos. Portanto, para preparar uma placa de 24 poços com 1-1,5 x 106 células T CD4 + por poço, estima-se que células de 2-3 camundongos sejam suficientes.
  4. Dia 4: Transdução
    1. Verifique as células T após 24 h ao microscópio. Certifique-se de que as células T estejam em um estado de jateamento (formando aglomerados e aparecendo ampliadas devido à ativação) antes da transdução. As células T de explosão garantem que estão em um estado de divisão, o que é crucial para a transdução de MSCV9.
    2. Colete ~ 10 mL de sobrenadante viral das placas de 10 cm em um tubo cônico. Substitua as placas de cultura Plat-E por mais 10 mL de meio Plat-E sem antibióticos para garantir meio suficiente para gerar mais meio para uma segunda transdução no dia seguinte. Ajuste o volume do meio em placas PLAT-E com base no número de poços de células T que precisam ser transfectados no dia seguinte.
      NOTA: A transdução de 2x melhora significativamente a eficiência.
    3. Filtrar o sobrenadante viral passando por um filtro de seringa de 0,45 μm. Adicione 8 μg/mL de polibreno e HEPES 1:100.
    4. Gire a placa de célula T de 24 poços por 7 min a 950 x g. Colete e guarde cuidadosamente o sobrenadante sem desalojar as células. Este sobrenadante contém citocinas e outros fatores secretados pelas células T após a ativação e substituídos por este sobrenadante após a spinfecção para manter o perfil de citocinas e fatores para apoiar a proliferação e o crescimento das células T.
    5. Realize a spinfecção adicionando 1 mL de sobrenadante viral a cada poço e girando a 1.150 x g por 4 h a 32 ° C. Sele as placas com filme plástico durante a infecção.
    6. Após a spinfecção, substitua cuidadosamente o meio pelo sobrenadante de células T salvo anteriormente.
  5. Dia 5: Repita a transdução
    1. Repita a transfecção conforme descrito no Dia 4. Opcionalmente, misture o sobrenadante salvo na etapa 3.4.3 de células T inicialmente ativadas com mídia fresca em uma proporção de 1:1 se a mídia parecer esgotada.
  6. Dia 6: Lave as células e expanda
    1. Lave as células com PBS Ca+/Mg+. e transferi-los para uma nova placa de cultura com 130 U/mL de IL2 de camundongo e 10 ng/mL de IL7 de camundongo. Incube as células durante pelo menos 2 dias ou até atingirem o nível de expansão desejado, com base no número de células necessárias para a injeção.
  7. Dia 8: Colheita e purificação
    1. Colha as células e purifique com um gradiente de densidade Histopaque 1.077.
      NOTA: Esta técnica ajuda a isolar células viáveis (como linfócitos ou outras células imunológicas) de células mortas ou detritos. As células mortas, que têm uma densidade mais alta, se depositam no fundo do tubo, enquanto as células viáveis normalmente permanecem na camada de interface.
    2. Adicione 5 mL de Histopaque 1.077 a um tubo de 15 mL. Colha as células centrifugando a 450 x g durante 5 min a 4 °C para peletar as células.
    3. Ressuspenda o pellet celular em 5 mL de PBS Ca+/Mg+. Coloque a suspensão celular cuidadosamente em cima de 5 mL de Histopaque 1.077 no tubo de centrífuga.
    4. Centrifugue a 400-500 x g por 20 min em temperatura ambiente, garantindo que a quebra/aceleração da centrífuga seja zerada.
    5. Após a centrifugação, as células se separarão em camadas distintas com base na densidade. As células desejadas normalmente estarão na camada de interface entre o Histopaque e o meio superior, enquanto as células mortas se depositarão na parte inferior. Colete cuidadosamente a camada de células na camada de interface usando uma pipeta, evitando a contaminação com outras camadas. As células coletadas agora estão prontas e limpas para injeções.
    6. Avalie a eficiência da transdução realizando coloração Thy1.1 e análise de citometria de fluxo. Veja a estratégia de gating na Figura 1.
      NOTA: Após a transdução, as células podem ser usadas em ensaios de quimiotaxia para avaliar sua migração para quimiocinas específicas em comparação com as células vetoriais de controle para confirmar funcionalmente sua atividade in vitro antes de prosseguir com as injeções.
  8. Ensaio de localização in vivo de longo prazo
    1. Para homing de longo prazo, use CD45.1 para o GPCR de camundongo de interesse e CD45.2 para células transduzidas de vetor vazio (ou vice-versa). Misture as duas populações de células na proporção de 1:1.
    2. Injete por via intravenosa 20-30 x 106 células totais para cada camundongo receptor adulto Rag1 - / - para 1 semana de tropismo e 5 x 106 para tropismo de 7 semanas. Usamos receptores Rag1-/- deficientes em linfócitos para reduzir a competição com células T endógenas.
    3. Após 1 a 7 semanas (dependendo do estudo), injete o anticorpo anti-CD45 por via intravenosa (i.v.) nos camundongos 5 minutos antes da colheita para rotular as células transmitidas pelo sangue.
    4. Eutanasiar os camundongos usando inalação de CO2 seguida de luxação cervical.
      NOTA: Estudos de 1 semana e 7 semanas foram realizados; estudos mais longos podem ser possíveis, mas ainda não foram testados.
    5. Colha células de diferentes órgãos de interesse e controles. Digerir os tecidos de acordo com os protocolos padrão de preparação de linfócitos para cada órgão10,11.
    6. Corar as células coletadas com anticorpos monoclonais (mAbs) para análise por citometria de fluxo.
  9. Homing competitivo de curto prazo: posicionamento e imagem de células T
    1. Recomendamos o uso de camundongos C57B6/J como doadores, uma vez que estaremos marcando as células com fluorescência. No entanto, para ensaios de homing muito curtos de até algumas horas, qualquer cepa pode ser usada.
    2. No 8º dia de cultura, isolar magneticamente as células transduzidas (Thy1.1+) usando microesferas CD90.1, de acordo com as instruções do fabricante12.
    3. Manter apenas as células transduzidas (pureza >95%) em cultura após este ponto durante 2 dias sob IL2 e IL7 conforme indicado acima e deixar expandir. As microesferas são biodegradáveis e após 48 h não prejudicam a função celular normal.
    4. No dia 11, rotule as células que expressam o GPCR de interesse com éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE é um corante de coloração de células fluorescentes). Para células Stuffer, use um corante fluorescente amarelo ou vice-versa. Você pode usar corantes alternativos, se preferir.
      1. Prepare uma suspensão celular na concentração de 1 x 106 células / mL em RPMI com 2% de FBS. Incubar as células com o corante a uma concentração final de 5 μM a 37 °C em banho-maria com agitação suave durante 20 min. Para garantir resultados comparáveis, alterne as atribuições de corante em experimentos separados. Como alternativa, use um único corante para rotular um tipo de célula comum como um padrão interno, incluindo células experimentais e de controle em diferentes recipientes.
      2. Lave as células rotuladas e misture-as na proporção de 1:1. Estime a concentração de células usando um contador de células. Injetar 15-30 x 106 células por via intravenosa em camundongos receptores (WT ou camundongos receptores transgênicos, dependendo do objetivo do experimento).
    5. Aproximadamente 10-12 h depois, injete os camundongos com anticorpo anti-CD31 (por exemplo, DyLight 633 marcado, clone 390), que deve ser 10-15 min antes do sacrifício para delinear os vasos sanguíneos e discriminar as células intravasculares das extravasadas.
    6. Eutanasiar os camundongos usando inalação de CO2 seguida de luxação cervical. Analise a localização celular por FACS de suspensões celulares conforme descrito na etapa 3.8 acima ou por imagens de montagens inteiras de tecido como na etapa 3.9.8 ou etapa 3.9.7 para órgãos de interesse usando microscopia confocal.
    7. Para órgãos finos, como traqueia, corno uterino ou gânglios linfáticos, prepare montagens de abóbora. Coloque o tecido em uma lâmina com fita dupla-face nas laterais, adicione algumas gotas da solução de montagem Fluoromount-G, cubra com uma lamínula e pressione suave e uniformemente para fixar a lamínula à fita usando uma lâmina separada ou outro objeto plano.
    8. Para seções congeladas, incorpore o tecido no composto de temperatura de corte ideal (OCT). Para os pulmões, perfunda com 50% de OCT/PBS antes de incorporar.
    9. Use citometria de fluxo para órgãos de controle, como linfonodo periférico (PLN), baço ou sangue, para avaliar a eficiência da transdução (% Thy1.1+) conforme mostrado na Figura 1 e normalizar os resultados. Visualize PLN com montagens ou seções de squash usando microscopia confocal. Conte as células usando microscopia confocal com o software Imaris.
    10. Determine a proporção de células transduzidas por GPCR para células de controle (transduzidas por Stuffer) em órgãos inteiros ou compartimentos de órgãos específicos. Normalizar para as taxas de entrada determinadas pelo FACS e / ou para a proporção recuperada dos órgãos de controle onde o GPCR é conhecido ou presumido como irrelevante.
    11. Para análise da localização microambiental nos pulmões, meça a distância das células aos pontos histológicos (por exemplo, membranas ou veias basais brônquicas) usando o software Imaris.

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Resultados

Neste estudo, apresentamos um protocolo detalhado para investigar a capacidade de receptores específicos de direcionar a localização de células T in vivo. Como demonstração desse protocolo, utilizamos o GPR2513. Somos capazes de atingir 30%-40% de eficiência de transdução usando este protocolo, conforme avaliado pela coloração Thy1.1 por citometria de fluxo. Realizamos ensaios de quimiotaxia baseados em transwell in vitro usando células transduzidas por GPR25 ao lado de controles de preen...

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Discussão

O ensaio de homing controlado internamente descrito neste estudo é um método abrangente para examinar o tráfego e o posicionamento de células T mediadas por GPCR em diversos órgãos e microambientes teciduais. Essa abordagem integra várias otimizações críticas para melhorar a reprodutibilidade, a precisão e a eficiência.

Um aspecto crítico deste protocolo é a transdução eficiente de células T usando vetores retrovirais MSCV, o que é facilitado pelo uso de célul...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Apoiado pelo NIH concede R01 AI178113 e R01 AI047822, Grant 1903-03787 do The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust e o Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) concede T31IP1880 e T33IR6609 ao ECB; Y.B. foi apoiado por um Prêmio de Bolsas de Pesquisa da Crohn's and Colitis Foundation of America (835171). B.O. foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado da Fundação Ramon Areces (Madri, Espanha) e um Prêmio de Bolsas de Pesquisa da Crohn's and Colitis Foundation of America (574148). A.A. foi apoiado pelo Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (CIRM) - EDUC2-12677.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AF647 anti-mouse CD90.1-Thy1.1 (OX-7)Biolenda 202507
anti-CD31 (DyLight 633, clone 390)InvivoMab BE0377
anti-mouse CD28 37.51eBiociências 
anti-mouse CD3 145-2C11eBiociências 
APCCy7 anti-rato CD3 (145-2c11)Biolenda 100329
BV421 anti mouse CD8b  (Ly-3)Biolenda 126629
BV711 anti-mouse CD4 (RM4-5) Biolenda 100549
Microesferas CD90.1 Miltenyi 130-121-273
CFSE Termocientífico C34554
Mouse anti-mouse FITC CD45.2 (104)BDAB_395041
IL2 do mouse Peprotech 200-02-50UG
mouse IL7 Peprotech   217-17-10UG
Kit de isolamento T CD4 para camundongosTecnologias STEMCELL 18000
MSCV-IRES- Thy1.1 GPR25Construtor de vetores
MSCV-IRES- Thy1.1 StufferConstrutor de vetores
Anticorpo PE-CD45 (30-F11) Biolenda 103105
PECy7 anti mouse TCRb  (H57-597)Tonbo
PercpCy5.5 anti-rato CD45.1 (A20)eBiociências 
Platina-E (Plat-E) Biolabs celulares. Inc RV-101
Corante fluorescente amarelo Termocientífico 

Referências

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