Um método QuEChERS-HPLC modificado para detecção de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos em embriões de peixe-zebra expostos a partículas finas

Summary

Desenvolvemos um método QuEChERS-HPLC modificado para avaliar os níveis internos de 16 PAHs em embriões de peixe-zebra.

Abstract

A exposição materna a partículas finas (PM_2,5), com diâmetro aerodinâmico de 2,5 μm ou menos, tem sido associada ao aborto espontâneo e a várias doenças congênitas em humanos. No entanto, os mecanismos subjacentes permanecem obscuros. Os embriões de peixe-zebra são amplamente utilizados para estudar a toxicidade do desenvolvimento do PM_2.5 , mas medir os níveis internos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), os principais constituintes tóxicos do PM_2.5, representa um desafio. Neste estudo, desenvolvemos um método de cromatografia líquida de alta eficiência (QuEChERS-HPLC) rápido, fácil, barato, eficaz, robusto e seguro para avaliar os níveis internos dos 16 PAHs listados na lista de poluentes prioritários da Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA). Os embriões de peixe-zebra foram tratados com matéria orgânica extraível (MOE) de PM_2,5 por 2-72 h após a fertilização (hpf). O método QuEChERS foi empregado para o preparo das amostras, e o HPLC-FLD/DAD (HPLC com detector de fluorescência e detector de arranjo de diodos) foi empregado para as análises qualitativas e quantitativas dos HPAs. Detectamos com sucesso seis PAHs (fenantreno, antraceno, flúor, acenafteno, fluoreno e pireno) em embriões de peixe-zebra expostos ao PM_2.5. Este método é crucial para investigar os mecanismos de toxicidade do desenvolvimento induzida por PM_2.5.

Introduction

Partículas finas (PM_2,5), com um diâmetro aerodinâmico igual ou inferior a 2,5 μm. é um dos principais fatores de risco ambiental. Devido ao seu pequeno tamanho, o PM_2,5 é capaz de entrar no sistema circulatório e permear a barreira materno-fetal. Estudos epidemiológicos têm associado a exposição materna ao MP_2,5 ao aborto espontâneo e a várias doenças congênitas 1,2,3,4. No entanto, os mecanismos subjacentes da toxicidade embrionária do PM_2.5 não são bem compreend....

Protocol

1. Tratamento da amostra

1. Coleção PM_2.5
   1. Colete PM_2.5 em filtros de membrana de quartzo de 47 mm.
      NOTA: PM_2.5 foi coletado na área urbana de Suzhou, China.
2. Extração de MOE
   1. Corte o filtro em pedaços e coloque em um frasco de vidro cônico com 150 mL de acetonitrila.
   2. Ultrassonicar o balão a 35 °C durante 1 h e transferir o extracto para quatro tubos de 50 ml.
   3. Centrifugue a 7.000 × g por 20 min, depois transfira o sobrenadante para um evaporador rotativo e concentre-o em aproximadamente 5 mL.

Results

Todo o procedimento para exposição EOM, preparação de amostras e detecção de PAH é ilustrado na Figura 1. Para HPLC-FLU/DAD, uma relação sinal-ruído de 3:1, com faixa de detecção de 0,3 a 5,0 ng/mL, foi considerada aceitável. Os limites de detecção do método variaram de 3,0 × ^10-4 a 5,0 × ^10-3 ng/organismo. Todas as curvas de calibração exibiram alta linearidade (r² > 0,999). Os valores de precisão determinados usando extratos obtidos de amostras de matriz.......

Discussion

Os embriões de peixe-zebra são um poderoso modelo de vertebrado para estudos de toxicidade no desenvolvimento, mas seu pequeno tamanho complica a detecção de compostos orgânicos semivoláteis (SVOCs), como os PAHs. Durante a preparação da amostra, é crucial evitar a contaminação de embriões de peixe-zebra. A limpeza adequada das amostras é um passo fundamental para evitar a transferência de compostos do meio de exposição para o extrato da amostra. A lavagem incompleta pode levar à superes.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 soluções padrão mistas de PAHs	o2si Smart Solutions (Carolina do Sul, EUA)	110124-06	16 PAHs soluções padrão mistas  inclui naftaleno (Nap), acenaftileno (Acy), ace-nafteno (Ace), flúor (Flo), fenantreno (Phe), antraceno (Ant), fluoranteno (Flu), pireno (Pyr), benzo [a] antraceno (BaA), criseno (Chr), benzo [b] fluoranteno (BbF), benzo [k] fluoranteno (BkF),benzo [a] pireno (BaP), indeno [1,2,3-cd] pireno (IcdP), dibenz [a, h]antraceno (DahA), benzo [g,h,i] perileno (BghiP).
1260 Infinity II LC System	Agilent Technologies (Santa Clara, EUA)		FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)
Acetonitrila	Scharlab (Barcelona,Espanha)	AC03661000	solvente
CNWBOND HC-C18 SPE	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Xangai, CHINA)	SBEQ-CA0801	A embalagem C18 é uma embalagem de fase reversa com um bom equilíbrio entre hidrofílico e hidrofóbico, que pode adsorver e separar bem os compostos orgânicos polares e não polares.
Terra de diatomáceas	Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, EUA)	12214013	Para separação, purificação e remoção de impurezas orgânicas‌
SPE Dispersivo 15 mL, EN	Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, EUA)	5982-5056	Filtro de purificação de amostras
	ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(Shanghai, CHINA)	SCAA-104	Filtro de agulha de fase orgânica (nylon),0.22µ m
Hexano	Scharlab (Barcelona, Espanha	)HE02481000
solvente Millipore	Merck (New Jersey, EUA)		Preparar água ultrapura
Organomation - N-EVAP Nitrogen Evaporators	Organomation (Massachusetts,EUA)		Evaporar solventes
Sorvall ST4 Plus	Thermo Fisher Scientific (Waltham, EUA)		centrifugação
Vortex- Genie 2 (G560E)	Scientific Industries (Nova York, EUA)		Vortex
ZORBAX Eclipse PAH	Agilent Technologies, Inc (Santa Clara, EUA)	959990-918	Esta coluna é comumente usada em sistemas HPLC para obter análises precisas e confiáveis de PAHs.