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Artigo de método

Um método QuEChERS-HPLC modificado para detecção de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos em embriões de peixe-zebra expostos a partículas finas

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DOI:

10.3791/67757

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13 de junho de 2025

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1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Desenvolvemos um método QuEChERS-HPLC modificado para avaliar os níveis internos de 16 PAHs em embriões de peixe-zebra.

Resumo

A exposição materna a partículas finas (PM2,5), com diâmetro aerodinâmico de 2,5 μm ou menos, tem sido associada ao aborto espontâneo e a várias doenças congênitas em humanos. No entanto, os mecanismos subjacentes permanecem obscuros. Os embriões de peixe-zebra são amplamente utilizados para estudar a toxicidade do desenvolvimento do PM2.5 , mas medir os níveis internos de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (PAHs), os principais constituintes tóxicos do PM2.5, representa um desafio. Neste estudo, desenvolvemos um método de cromatografia líquida de alta eficiência (QuEChERS-HPLC) rápido, fácil, barato, eficaz, robusto e seguro para avaliar os níveis internos dos 16 PAHs listados na lista de poluentes prioritários da Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA). Os embriões de peixe-zebra foram tratados com matéria orgânica extraível (MOE) de PM2,5 por 2-72 h após a fertilização (hpf). O método QuEChERS foi empregado para o preparo das amostras, e o HPLC-FLD/DAD (HPLC com detector de fluorescência e detector de arranjo de diodos) foi empregado para as análises qualitativas e quantitativas dos HPAs. Detectamos com sucesso seis PAHs (fenantreno, antraceno, flúor, acenafteno, fluoreno e pireno) em embriões de peixe-zebra expostos ao PM2.5. Este método é crucial para investigar os mecanismos de toxicidade do desenvolvimento induzida por PM2.5.

Introdução

Partículas finas (PM2,5), com um diâmetro aerodinâmico igual ou inferior a 2,5 μm. é um dos principais fatores de risco ambiental. Devido ao seu pequeno tamanho, o PM2,5 é capaz de entrar no sistema circulatório e permear a barreira materno-fetal. Estudos epidemiológicos têm associado a exposição materna ao MP2,5 ao aborto espontâneo e a várias doenças congênitas 1,2,3,4. No entanto, os mecanismos subjacentes da toxicidade embrionária do PM2.5 não são bem compreendidos. Os PAHs, o principal componente tóxico do PM2,5, são altamente tóxicos para os seres humanos devido às suas propriedades mutagênicas e carcinogênicas 5,6. Entre as centenas de PAHs, 16 foram designados como poluentes de alta prioridade pela Agência de Proteção Ambiental dos EUA (EPA).

O peixe-zebra, Danio rerio, é um poderoso organismo modelo de vertebrado devido à sua semelhança genética com os humanos, rápido desenvolvimento, alta taxa reprodutiva e facilidade de manutenção. A transparência dos embriões de peixe-zebra permite a observação direta de todo o corpo ao microscópio, possibilitando estudos detalhados. Os PAHs dissolvidos podem entrar em embriões de peixe-zebra por difusão7. Muitos estudos usaram embriões de peixe-zebra para explorar os efeitos tóxicos e os mecanismos da Matéria Orgânica Extraível (MOE) do PM2.5 8,9,10,11. No entanto, a maioria desses estudos caracterizou apenas os 16 HPAs prioritários na MOE, sem detectar os níveis internos de HPAs em embriões de peixe-zebra12. Esse desafio pode ser devido ao pequeno tamanho dos embriões de peixe-zebra e à complexidade da matriz embrionária.

O método Rápido, Fácil, Barato, Eficaz, Robusto e Seguro (QuEChERS) é uma técnica inovadora de preparação de amostras usada para a análise de resíduos de pesticidas, medicamentos veterinários e outros contaminantes em amostras de alimentos e ambientais13,14. Quando associado à cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), este método tem sido utilizado para detectar pesticidas em peixe-zebra15. Os PAHs, que contêm dois ou mais anéis de benzeno, têm fortes propriedades de fluorescência, tornando-os particularmente adequados para detecção usando detectores de fluorescência. Neste estudo, desenvolvemos um método QuEChERS-HPLC modificado para avaliar os níveis de 16 PAHs em embriões de peixe-zebra expostos ao EOM.

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Protocolo

1. Tratamento da amostra

  1. Coleção PM2.5
    1. Colete PM2.5 em filtros de membrana de quartzo de 47 mm.
      NOTA: PM2.5 foi coletado na área urbana de Suzhou, China.
  2. Extração de MOE
    1. Corte o filtro em pedaços e coloque em um frasco de vidro cônico com 150 mL de acetonitrila.
    2. Ultrassonicar o balão a 35 °C durante 1 h e transferir o extracto para quatro tubos de 50 ml.
    3. Centrifugue a 7.000 × g por 20 min, depois transfira o sobrenadante para um evaporador rotativo e concentre-o em aproximadamente 5 mL.
    4. Evaporar até à secura sob fluxo de azoto em banho-maria a 35 °C e dissolver o resíduo em dimetilsulfóxido (DMSO).
  3. Tratamento com embriões de peixe-zebra
    1. Manter o peixe-zebra num sistema de recirculação de água num ciclo de 14 h de luz e 10 h de escuridão a 28 °C16.
    2. Coletar óvulos fertilizados (200 embriões por grupo) e transferi-los para placas de Petri de vidro (vidro sodo-cálcico, 80 x 15 mm) com 30 mL de água do sistema de recirculação de água.
    3. Adicione 30 μL de EOM (10 mg / mL) a uma placa de Petri de vidro contendo 200 embriões 2 h após a fertilização (hpf). Grupos não tratados servem como controles em branco.
      NOTA: A concentração final de MOE é de 10 mg/L, com base na taxa de malformação cardíaca (Figura Suplementar S1).
    4. Colocar a loiça numa incubadora a 28 °C.

2. Preparação de amostras QuEChERS

  1. Retire os pratos com embriões a 72 hpf da incubadora. Lave os embriões 3x com água pura.
  2. Transfira os embriões para tubos de 1,5 mL (de acordo com os diferentes grupos) e remova o excesso de água.
  3. Coloque os tubos em um freezer a -80 ° C por 30 min para liofilizar os embriões17 e liofilizá-los. Em seguida, triture os embriões usando uma haste de vidro.
  4. Adicione 25 μL de solução padrão mista de 16 PAH (2,0 μg/mL) ao grupo de controle DMSO para testar a recuperação de picos.
  5. Adicione 1 mL de n-hexano e vórtice por 30 s, depois ultrassonice a 35 ° C por 30 min.
  6. Centrifugar a 7.000 × g durante 5 min e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
  7. Repita as etapas 2.5 e 2.6.
  8. Evaporar os sobrenadantes recolhidos até à secura sob fluxo de azoto em banho-maria a 35 °C.
  9. Adicione 1 mL de acetonitrila e vórtice por 30 s.
  10. Adicione 10 mg de amina secundária primária (PSA), 45 mg de sulfato de magnésio e 15 mg de empacotamento de C18 e, em seguida, vórtice por 30 s.
  11. Centrifugar a 7.000 × g durante 5 min e transferir o sobrenadante para um novo tubo.
  12. Repita a etapa 2.9 e centrifugue a 7.000 × g por 5 min. Transfira o sobrenadante para um novo tubo.
  13. Evaporar o sobrenadante a 0,5 ml sob azoto.
  14. Filtrar através de uma membrana microporosa de 0,22 μm.

3. Determinação dos HAP por HPLC

  1. Preparar uma série de soluções de trabalho (variando de 1 a 500 ng/ml) para o padrão misto de 16 PAH com acetonitrilo e injectá-las num cromatógrafo líquido utilizando acetonitrilo/água como fase móvel.
    1. Injete 20 μL e use o seguinte procedimento de eluição: 0-18,5 min, acetonitrila a 40% a 100% de acetonitrila; 18,5-28 min, 100% acetonitrila; 28-29,5 min, acetonitrila de 100% a 40%; Tempo de parada: 32 min; Temperatura da coluna: 25 °C; vazão: 1,8 mL/min. Traçar uma curva padrão com as concentrações mássicas das soluções de trabalho padrão no eixo x e as áreas de pico correspondentes no eixo y, cobrindo uma gama de 5 ng/ml a 500 ng/ml.
      NOTA: Os comprimentos de onda de excitação/emissão de PAHs podem ser encontrados na Tabela Suplementar S1.
  2. Injectar a amostra purificada (do passo 2.14) no cromatógrafo líquido com um detector de fluorescência (FLD) e um detector de díodos (DAD).
  3. Identifique a presença de HAPs comparando os tempos de retenção e meça as áreas de pico associadas.
    NOTA: As concentrações mássicas dos HAP foram determinadas utilizando a curva padrão previamente gerada do passo 3.1.1.
  4. Calcular as concentrações internas dos 16 HAP com base nas concentrações mássicas medidas das amostras.

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Resultados

Todo o procedimento para exposição EOM, preparação de amostras e detecção de PAH é ilustrado na Figura 1. Para HPLC-FLU/DAD, uma relação sinal-ruído de 3:1, com faixa de detecção de 0,3 a 5,0 ng/mL, foi considerada aceitável. Os limites de detecção do método variaram de 3,0 × 10-4 a 5,0 × 10-3 ng/organismo. Todas as curvas de calibração exibiram alta linearidade (r2 > 0,999). Os valores de precisão determinados usando extratos obtidos de amostras de matriz...

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Discussão

Os embriões de peixe-zebra são um poderoso modelo de vertebrado para estudos de toxicidade no desenvolvimento, mas seu pequeno tamanho complica a detecção de compostos orgânicos semivoláteis (SVOCs), como os PAHs. Durante a preparação da amostra, é crucial evitar a contaminação de embriões de peixe-zebra. A limpeza adequada das amostras é um passo fundamental para evitar a transferência de compostos do meio de exposição para o extrato da amostra. A lavagem incompleta pode levar à superes...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número da concessão: 81972999) e pelo Plano de Desenvolvimento de Ciência e Tecnologia de Suzhou (Pesquisa Básica em Aplicações Médicas, SKY2023036 e SKY2023115).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
16 soluções padrão mistas de PAHs o2si Smart Solutions (Carolina do Sul, EUA)110124-0616 PAHs soluções padrão mistas  inclui naftaleno (Nap), acenaftileno (Acy), ace-nafteno (Ace), flúor (Flo), fenantreno (Phe), antraceno (Ant), fluoranteno (Flu), pireno (Pyr), benzo [a] antraceno (BaA), criseno (Chr), benzo [b] fluoranteno (BbF), benzo [k] fluoranteno (BkF),benzo [a] pireno (BaP), indeno [1,2,3-cd] pireno (IcdP), dibenz [a, h]antraceno (DahA), benzo [g,h,i] perileno (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (Santa Clara, EUA)FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)
AcetonitrilaScharlab (Barcelona,Espanha)AC03661000solvente
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Xangai, CHINA)SBEQ-CA0801A embalagem C18 é uma embalagem de fase reversa com um bom equilíbrio entre hidrofílico e hidrofóbico, que pode adsorver e separar bem os compostos orgânicos polares e não polares.
Terra de diatomáceasAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, EUA)12214013Para separação, purificação e remoção de impurezas orgânicas‌
SPE Dispersivo 15 mL, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, EUA)5982-5056Filtro de purificação de amostras
ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.(Shanghai, CHINA)SCAA-104Filtro de agulha de fase orgânica (nylon),0.22µ m
HexanoScharlab (Barcelona, Espanha)HE02481000
solvente MilliporeMerck (New Jersey, EUA)Preparar água ultrapura
Organomation - N-EVAP Nitrogen EvaporatorsOrganomation (Massachusetts,EUA)Evaporar solventes
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (Waltham, EUA)centrifugação
  Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (Nova York, EUA)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, EUA)959990-918Esta coluna é comumente usada em sistemas HPLC para obter análises precisas e confiáveis de PAHs.

Referências

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  19. Alegbeleye, O. O., Opeolu, B. O., Jackson, V. A. Polycyclic aromatic hydrocarbons: A critical review of environmental occurrence and bioremediation. Environ Manage. 60 (4), 758-783 (2017).

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