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Artigo de método

Marcação in vivo de isótopos estáveis para identificação por espectrometria de massa de metabólitos paternos transferidos do espermatozoide para o oócito durante a fertilização

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DOI:

10.3791/67765

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17 de junho de 2025

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1Biogem Scarl, Institute of Molecular Biology and Genetics Research, 2Department of Experimental Medicine, University della Campania Luigi Vanvitelli, 3Department of Biology, University of Naples "Federico II ", 4Department of Pharmacy, School of Pharmacy, University of Salerno, 5Department of Pharmacy, University of Naples "Federico II "

Neste artigo

Resumo

Este procedimento visa identificar metabólitos transferidos do espermatozoide para os oócitos durante a fertilização por meio da marcação isotópica estável com glicose 2H2O ou U13C seguida de análise metabolômica. Os touros marcados com deutério são acasalados com mães não marcadas. Os embriões pré-implantação coletados são analisados por espectrometria de massa para separar os metabólitos paternos (deuterados) dos maternos (não deuterados).

Resumo

A contribuição paterna para a genética embrionária até agora tem sido limitada a sequências alélicas por décadas. Uma década de resultados sugere, em vez disso, que fatores epigenéticos - metilação do DNA, modificações de histonas, organização cromossômica e RNAs reguladores - desempenham papéis cruciais na herança paterna e influenciam o desenvolvimento embrionário e a expressão gênica do zigoto. Juntamente com os ácidos nucléicos, o metaboloma espermático (lipídios, carboidratos, aminoácidos livres) pode atuar como sinal epigenético. Este protocolo visa identificar metabólitos transferidos de espermatozoides para oócitos por espectrometria de massas. O procedimento inclui a marcação de isótopos estáveis de espermatozóides com glicose 2H2O ou U13C para rastrear, por metabolômica, metabólitos paternos transferidos para o oócito durante a fertilização. O objetivo geral do protocolo é revelar o papel do metaboloma do esperma paterno na suscetibilidade da prole ao dismetabolismo, e pode ser adaptado para fornecer informações sobre como as condições ambientais, como dieta e exposição a poluentes, alteram as mensagens metabólicas paternas, afetando potencialmente a saúde da prole e a predisposição a diabetes, obesidade e doenças cardiovasculares.

Introdução

O epigenoma paterno influencia a suscetibilidade da prole ao dismetabolismo
Diferentemente da infinidade de papéis pré e pós-concepcionais explorados pelas mães durante o desenvolvimento embrionário, a contribuição dos espermatozoides tem sido considerada há décadas como exclusivamente genética. De acordo com a teoria da herança genética, a contribuição paterna para a variabilidade fenotípica de um indivíduo (incluindo sua suscetibilidade a doenças) deve ser atribuída exclusivamente à sequência genética de variantes alélicas herdadas paternalmente e às suas interações com aquelas herdadas maternalmente1. Hoje em dia, está claro que os alelos não são as únicas mensagens genéticas transmitidas pelo pai à prole durante a fertilização e que, em vez disso, uma infinidade de sinais epigenéticos contribuem para a herança paterna 2,3,4. Os sinais epigenéticos até agora identificados incluem: (1) grupos metil adicionados covalentemente às citosinas do genoma parental 5,6,7, (2) modificações pós-traducionais (acetilação, metilação) de histonas associadas aos cromossomos espermáticos e entregues aos oócitos8, (3) a organização 3D dos cromossomos paternos levando à interação intracromossômica (também conhecida como domínios de associação topológica, TAD) persistindo no zigoto9,10 e (4) moléculas de RNA reguladoras (miRNAs, fragmentos derivados de tRNA e RNAs de interação com piwi)11,12, bem como rRNAs13 e tRNAs14 liberados do espermatozoide para o oócito durante a fertilização.

O epigenoma paterno é um importante veículo de informação para a progênie. A informação paterna influenciará o zigoto, o embrião durante seu desenvolvimento e, após o nascimento, a propensão da prole ao dismetabolismo e doenças. Essa herança não mendeliana (referida como intergeracional ou transgeracional, dependendo se afeta uma ou várias gerações consecutivas), é considerada por muitos autores um dos fatores contribuintes ocultos responsáveis pelo aumento drástico de doenças dismetabólicas que ocorrem nos países ocidentaisdesenvolvidos15. De fato, de acordo com as teorias PoHaD (Origem Paterna da Saúde e da Doença) e DoHaD (Origem do Desenvolvimento da Saúde e da Doença), a contribuição epigenética dos pais é um dos fatores predisponentes aos filhos a desenvolver diabetes, obesidade e doenças cardiovasculares na idade adulta16,17. Curiosamente, o epigenoma parental é excepcionalmente suscetível a estímulos ambientais e pode ser influenciado por condições metabólicas (como uso de drogas, hábitos alimentares e aptidão metabólica)18, bem como parâmetros estritamente ambientais (como exposição a poluentes, relações sociais e estresse mental e relacional)5,11. Cada um dos estímulos acima mencionados pode, portanto, alterar os epigenomas das células germinativas (espermatozóides e oócitos) e influenciar as gerações futuras.

O consumo de dieta hiperlipídica (HFD) representa um dos estímulos ambientais mais amplamente estudados, capaz de alterar o epigenoma paterno e levar a mensagens deletérias entregues à prole19. Esse estímulo afeta o fenótipo da prole (até a terceira geração), que muitas vezes apresenta maior propensão a desenvolver dismetabolismo, independentemente da ingestão calórica. Descendentes de pais que consomem HFD manifestam retardo de crescimento, intolerância à glicose e resistência à insulina em camundongos e ratos20,21. Em humanos, a herança epigenética tem sido estudada principalmente em gerações nascidas durante e imediatamente após períodos de fome ou superalimentação22. Na coorte de Överkalix, a disponibilidade de alimentos dos avós paternos durante o período de crescimento lento foi correlacionada com o risco geral de mortalidade, doenças cardiovasculares, IMC, circunferência da cintura e massa gorda de seus netos23. Recentemente, evidências de transmissão intergeracional paterna foram confirmadas em outras coortes24.

Metabólitos paternos envolvidos na herança intergeracional
Apesar das evidências clínicas e epidemiológicas, os detalhes moleculares da herança intergeracional paterna permanecem obscuros. A princípio, a identificação de todos os transdutores moleculares de informação epigenética ainda não foi concluída. Evidências científicas sugerem que o componente nucleico dos espermatozóides, por si só, não pode explicar a complexidade da herança intergeracional. Variações na metilação do DNA foram de fato medidas nos espermatozóides de camundongos e ratos alimentados com HFD, mas em uma porcentagem tão baixa da população de espermatozóides que isso não pode explicar a alta penetrância do fenótipo dismetabólico observado na prole25. Por outro lado, o pool de RNAs sinalizadores transferidos do esperma para os oócitos tem uma meia-vida muito curta e, embora capaz de influenciar a expressão gênica zigótica, parece improvável que seja mantido em concentrações efetivas pós-fertilização, no zigoto em embriões de dia 2, dia 3, em mórulas e em blastocistos. Assim, parece evidente que novos determinantes moleculares devem estar envolvidos no mecanismo de herança intergeracional.

Junto com os ácidos nucléicos, o esperma também contribui com componentes metabolômicos para o zigoto, como lipídios, carboidratos e aminoácidos 26,27,28,29. Esses metabólitos, particularmente aqueles dotados de atividades modulatórias, podem influenciar a expressão gênica zigótica e o desenvolvimento embrionário e, portanto, podem atuar como sinais epigenéticos30. Além disso, da mesma forma que os ácidos nucléicos, a concentração e a abundância relativa desses metabólitos no esperma podem ser influenciadas pelas condições ambientais vivenciadas pelo pai e, portanto, representam veículos de informação para a prole 28,30,31,32,33,34. De fato, o metaboloma espermático de espermatozóides maduros demonstrou depender do estado de saúde do pai e ser influenciado por fatores ambientais, como dieta, exercícios físicos, substâncias tóxicas e desreguladores endócrinos.

Compreender o papel dos metabólitos do esperma no desenvolvimento embrionário é complicado por várias limitações técnicas: (1) a diferença de tamanho entre o espermatozóide e o oócito, o que resulta em uma contribuição mínima de massa metabólica do espermatozoide para o zigoto, e (2) as várias variações metabolômicas que o espermatozoide sofre durante seus estágios de produção (espermatogênese), maturação epididimal, ejaculação e fusão com o oócito.

Flutuação do metaboloma espermático durante a maturação espermática
Nos mamíferos, os espermatozóides são produzidos no testículo por meio da espermatogênese, um processo dependente de células-tronco espermatogônicas pelo qual as espermatogônias comprometidas se desenvolvem em espermatócitos primários que entram na meiose e produzem espermátides haplóides redondas. A morfogênese dessas células em espermatozóides ocorre por meio da espermiogênese, uma remodelação morfofuncional maciça das espermátides, de células redondas para células alongadas/condensadas/altamente especializadas, correspondendo à última fase da espermatogênese. No entanto, os espermatozóides resultantes são imóveis e ainda não são capazes de fertilização35. Após a espermiação, à medida que os espermatozóides são liberados da rede testicular para o epidídimo, os espermatozoides interagem com as células epididimais epiteliais e se envolvem com proteínas e vesículas exossômicas secretadas por essas células (epidídimoso, ricos em esfingomielina e ácido araquidônico). A passagem pelo epidídimo permite que os espermatozoides atinjam a maturidade plena e, mesmo que mantidos em estado pré-capacitado, adquiram competência para a motilidade36. Durante o trânsito epididimal, a membrana espermática torna-se mais carregada negativamente e enriquecida em esfingomielina. A membrana espermática também se torna mais fluida devido a uma redução progressiva do colesterol e um aumento concomitante de ácidos graxos poliinsaturados (principalmente ácidos araquidônico, docosapentaenóico e docosahexaenóico). Após a ejaculação, no trato genital feminino, as proteínas do fluido seminal e a albumina promovem a capacitação dos espermatozoides, promovendo a hiperpolarização e o influxo de cálcio para ativar a motilidade dos espermatozoides. A membrana plasmática dos espermatozoides capacitados apresenta maior fluidez, baixa relação colesterol/fosfolipídio e redução do conteúdo de ácido siálico, gangliosídeo GM1 e triglicerídeos31,37.

Antes de encontrar o oócito, o espermatozoide sofre a reação acrossômica, uma fusão do acrossomo (uma organela membranosa derivada de Golgi que cobre a parte anterior do núcleo do espermatozóide e é formada durante a espermiogênese) com a membrana plasmática do espermatozoide, que facilita a reorganização da membrana plasmática do esperma e a competência para penetrar na zona pelúcida (ZP), uma matriz de glicoproteínas ao redor do oócito35, 38. Como etapa final, a hemifusão entre o espermatozoide e a membrana do oócito, promovida pelas proteínas espermáticas IZUMO1, SPACA6 e TMEM9539, resulta na incorporação de lipídios espermáticos nas membranas do oócito e na transferência do conteúdo nucleico e metabólico para o oócito.

Fundamentação do procedimento
O objetivo deste procedimento é identificar metabólitos transportados pelo espermatozoide e transferidos para o oócito na fertilização (Figura 1). Para distinguir entre metabólitos derivados de espermatozóides e oócitos no zigoto, os espermatozoides são marcados com deutério (2H, um isótopo de hidrogênio) ou 13C (um isótopo de carbono) usando marcação metabólica in vivo com óxido de deutério, 2H2O40 ou uniformemente marcado com U13C glicose41. Camundongos machos marcados com isótopos são então acasalados com fêmeas não marcadas para coletar zigotos, mórulas e blastocistos. Os embriões em estágio inicial são processados para extrair (1) metabólitos polares, (2) não polares e (3) esteróis. Os metabolomas são então analisados usando técnicas de espectrometria de massa. Os metabólitos marcados isotopicamente (paternos) serão identificados e distinguidos dos não marcados (maternos), demonstrando inequivocamente sua origem paterna.

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Nápoles Federico II, Itália. Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Seleção e agrupamento de machos C57BL/6J

  1. Selecione machos C57BL / 6J de cerca de 12 semanas.
  2. Divida os machos em dois grupos e nomeie-os ROTULADOS (submetidos à marcação de isótopos estáveis) ou NÃO MARCADOS (usados como controle e para medir a eficácia da marcação de isótopos em espermatozóides e mórulas).
  3. Para esvaziar o epidídimo dos espermatozoides não marcados, permita que os machos acasalem com fêmeas emparelhadas.

2. Marcação isotópica estável de machos C57BL / 6J

  1. Se estiver usando 2H2O para rotulagem in vivo , prepare água enriquecida a 10% v / v 2H2O para ser usada como água potável misturando 100 mL de 2H2O com 900 mL de água da torneira. Se estiver usando U13C-Glucose para rotulagem in vivo , prepare 5%-15% de água U13C-Glucose para ser usada como água potável, dissolvendo 50-150 g de U13C-Glucose em 1 L de água da torneira;
    CUIDADO: O consumo prolongado de 2H2O é tóxico para camundongos. Defina para cada cepa específica de camundongo, a quantidade máxima de 2H2O para adicionar água potável para atingir a máxima eficiência de rotulagem e efeitos colaterais mínimos. O consumo prolongado de glicose causa hiperglicemia e diabetes em camundongos. Defina a quantidade máxima de U13C-Glucose para adicionar à água potável para obter a máxima eficiência de rotulagem e efeitos colaterais mínimos.
  2. Substitua as garrafas de água por aquelas que contêm água potável marcada com isótopos e deixe os ratos beberem por 2,5 a 5 semanas (cobrindo pelo menos metade da espermatogênese), renovando o líquido duas vezes por semana.
  3. No final do período de tratamento, permita que os machos marcados acasalem com fêmeas superovuladas.

3. Superovulação de fêmeas C57BL/6J

  1. Selecione fêmeas de cerca de 4 semanas com peso entre 12,5-14 g, em idade pré-púbere.
  2. Induza a maturação do folículo por injeção intraperitoneal de 5 UI/50 μL/camundongo de PMSG (soro de égua grávida).
  3. Após 47 h, injetar por via intraperitoneal da hormona luteinizante HCG (gonadotrofina coriónica humana, 5 UI/50 μL/ratinho) para promover a conclusão da maturação do folículo e induzir a ovulação e a formação do corpo lúteo.
  4. Após a injeção de HCG, permita que as fêmeas acasalem com camundongos MARCADOS e NÃO MARCADOS, de acordo com a etapa 1 da Figura 1.
  5. Após o acasalamento, execute o controle do plugue vaginal42. Separe as fêmeas positivas e enjaule-as.

4. Coleta de embriões pré-implantação por lavagem

  1. Sacrifique mulheres positivas para tampão vaginal seguindo protocolos aprovados institucionalmente (2,5 dias após o coito para coletar mórulas).
  2. Coloque os animais em decúbito dorsal sobre a mesa; molhe o abdômen com etanol a 70% e faça uma laparotomia ampla.
  3. Remova o útero de um lado beliscando o colo do útero e cortando a extremidade caudal do colo do útero; do outro lado, cortando no final do corno uterino (porção infundibular).
  4. Coloque os úteros na placa de Petri com PBS para enxaguá-los e depois transfira-os para outra placa de Petri limpa para evitar a presença de resíduos.
  5. Para lavar o útero, carregue uma seringa de 2,5 mL com o meio de cultura e conecte-a a uma agulha Hamilton de ponta romba de 33 G.
  6. Insira a agulha no infundíbulo do oviduto preparado conforme descrito acima e lave todo o útero.
  7. Colete as mórulas em uma gota de meio de cultura para lavá-las de qualquer mucosa residual e sangue.
  8. Transfira as amostras coletadas em novos tubos de coleta e agrupe-as em MÓRULAS MARCADAS e MÓRULAS NÃO ROTULADAS, dependendo se elas derivam de eventos de acasalamento envolvendo touros ROTULADOS ou NÃO ROTULADOS. Congele as amostras em nitrogênio líquido.
  9. Sacrifique um grupo de fêmeas superovuladas não acasaladas (seguindo protocolos aprovados institucionalmente) para coletar oócitos não fertilizados. Transfira as amostras coletadas para novos tubos de coleta e rotule-as como OÓCITOS NÃO MARCADOS. Congele as amostras em nitrogênio líquido.

5. Coleta de esperma da cauda do epidídimo

  1. Sacrifique touros ROTULADOS ou NÃO ROTULADOS.
  2. Coloque os animais em decúbito dorsal sobre a mesa, molhe o abdômen com etanol a 70% e faça uma laparotomia ampla.
  3. Remova o epidídimo e mergulhe-o imediatamente em 3 mL de PBS (pH 7,6) e corte-o frouxamente para drenar o esperma dos dutos.
  4. Filtre as amostras de esperma através da gaze.
  5. Centrifugue os espermatozóides a 800 x g por 10 min (à temperatura ambiente).
  6. Ressuspenda o pellet em 1 mL de água desionizada fria. Apenas os espermatozoides resistirão à solução hipotônica, enquanto os não espermatozóides estourarão.
  7. Centrifugue os espermatozoides a 800 x g por 10 min em temperatura ambiente.
  8. Rotule os tubos e agrupe-os como ESPERMA MARCADO e ESPERMA NÃO ROTULADO, dependendo se foram coletados de touros ROTULADOS ou NÃO MARCADOS.
  9. Congele as amostras em nitrogênio líquido e armazene as amostras a -80 °C.

6. Extração de lipídios e metabólitos polares

  1. Equilibre a amostra das etapas 1-5 a 4 ° C no gelo.
  2. Adicione 225 μL de metanol gelado (MeOH) às amostras e incube a -30 °C por 1 min e, em seguida, coloque-as em um banho sônico por 10 min.
    1. Opcional: ao definir a condição experimental, adicione 0,1-2 ppm de cloridrato de C16-Ceramida-13 C3-15 N e L-lisina-ε-15N como padrões internos para medir a eficiência de extração de metabólitos não polares e polares, respectivamente.
  3. Adicione 750 μL de éter metil terc-butílico (MTBE) gelado em um termomisturador por 1 h a 4 ° C (550 rpm).
  4. Adicionar 188 μL de H2O às amostras depois de centrifugá-las. Separe as fases superiores (lipídios) da fase inferior (metabólitos polares) e seque-as.
    CUIDADO: MeOH causa cegueira e danos ao fígado, rins e coração se ingerido. A superexposição tem um efeito cumulativo no sistema nervoso central. O MTBE pode causar irritação na pele, nos olhos e nas vias respiratórias. Trabalhe sob uma coifa.
  5. Seque a amostra usando um concentrador de vácuo. Armazenar amostras secas a -80 °C até à análise de massa/espectrometria.
    NOTA: As amostras secas podem ser armazenadas a -80 °C por até 6 meses, aguardando análise de massa/espectrometria. Para a identificação de metabólitos menos representados em embriões pré-implantação, pode ser necessário agrupar amostras obtidas do mesmo par de acasalamento e evento de acasalamento.

7. Extracção de esteróis

NOTA: Evite o uso de tubos e pontas de plástico [serão dissolvidos pelo solvente orgânico apolar]; em vez disso, use tubos de vidro e pipetas de vidro Pasteur para dispensar líquidos.

  1. Equilibre a amostra das etapas 1 a 5 a 4 °C no gelo. Ressuspender as amostras recolhidas a 500 μL de uma solução de metanol/h20 70% v/v e transferir a suspensão para um tubo de vidro.
    1. Homogeneizar por vórtice por 30 s. Deixar o homogeneizado durante 16 h a 4 °C.
    2. Opcional: ao definir a condição experimental, adicione 0,1-2 ppm do esterol vegetal Sitostanol-5,6,22,23-d4 como padrões internos para medir a eficiência da extração de esteróis.
      CUIDADO: MeOH causa cegueira e danos ao fígado, rins e coração se ingerido. A superexposição tem um efeito cumulativo no sistema nervoso central.
  2. Centrifugue a amostra a 3.220 x g por 15 min em temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para um tubo de vidro limpo e complementá-lo com 500 μL de PBS.
  3. Adicione 7 mL de éter dietílico gelado e vórtice por 1 min. Deixe a amostra repousar por 1-2 minutos e aguarde a separação de fases. Congele submergindo o tubo em um banho de gelo seco/acetona. Transfira a fase de éter dietílico descongelada para um tubo de vidro recém-rotulado.
    CUIDADO: O éter dietílico é um líquido e vapor extremamente inflamável e se decompõe em peróxidos explosivos no ar e na luz. Não trabalhe em contato próximo com chamas. O éter dietílico é perigoso se ingerido e prejudicial à pele.
  4. Descongelar a fase aquosa a 37 °C e repetir o passo 4.3. Combinar as fases do éter dietílico recolhidas nos passos 4.3-4.4 num único tubo de vidro.
  5. Seque a amostra usando um concentrador de vácuo. Armazene amostras secas a -80 ° C até a análise de massa / espectrometria.

8. Derivatização da amostra

NOTA: As amostras se beneficiariam da derivatização TMS para a análise de metabólitos específicos (colesterol, ácidos graxos, aminoácidos).

  1. Equilibre as amostras à temperatura ambiente
    CUIDADO: O equilíbrio incompleto pode causar condensação da água atmosférica nas paredes e amostras do tubo. A água compete severamente pela derivatização do TMS.
  2. Solubilize as amostras em 50 μL de piridina e derivatize-as adicionando 25 μL de N,O-Bis(trimetilsilil(TMS)trifluoroacetamida (BSTFA). Incubar as amostras durante 90 min a 60 °C. Gire as amostras e prossiga imediatamente com a análise GC-MS.
    CUIDADO: A piridina é inflamável, irritante e tóxica. O BSTFA é inflamável, corrosivo e irritante. Trabalhe sob uma coifa e use luvas de proteção.

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Resultados

A fim de monitorar a transferência de metabólitos do espermatozóide para o oócito, mórulas isoladas de fêmeas C57 BL/6J acasaladas com touros dos grupos MARCADO e NÃO MARCADO são coletadas e analisadas por Metabolômica baseada em Espectrometria de Massa. Os metabólitos foram extraídos conforme descrito nas etapas 6-7 e derivatizados com TMS conforme descrito na etapa 8. Foi realizado o perfil metabolômico e lipidômico de mórulas MARCADAS, mórulas NÃO MARCADAS, oócitos NÃO MARCADOS, MARCADOS e espermatozóides NÃO MARCADOS...

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Discussão

O protocolo descrito permite a identificação de metabólitos transferidos de espermatozoides para oócitos durante a fertilização por meio de marcação isotópica estável de camundongos machos com glicose 2H2O ou U13C seguida de análise metabolômica. Os metabólitos marcados isotopicamente encontrados nas mórulas são de origem paterna.

Embora o hidrogênio e o deutério sejam isótopos, eles não são totalmente idênticos em termos de co...

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Divulgações

Os autores declaram não haver interesses conflitantes.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
2H2O filtrado, 99,8 átomos % 2HSigma Aldrich756822
AcetonaSigma Aldrich179124
A Agilent  SIL-8Agilent (Santa Clara, CA, EUA)
C16-Ceramida-13C3-15NPadrão LGCTRC-C342770-25MG
DiclorometanoSigma Aldrich34856
Éter dietílicoSigma Aldrich673811
etanolSigma Aldrich1,11,727
HCG (gonadotrofina coriônica humana,Sigma AldrichCG5-1VL
Cloridrato de L-lisina-&épsilon;-15NSigma Aldrich608971
Masculino e feminino  Camundongos C57BL/6JOlaHsdInotiv C57BL/6JOlaHsd
éter metil terc-butílico (MTBE)Sigma Aldrich306975
MetOHSigma Aldrich1,06,035
N,O-bis(trimetilsilil(TMS)
trifluoroacetamida (BSTFA)		Supelco15238
PBSAplicativoA0965-9010
PMSG (égua grávida' soro)Lee Biosoluções493-10
PiridinaSigma Aldrich360570
Shimadzu GCMS 2010plus Shimadzu
Sitostanol-5,6,22,23-d4Sigma Aldrich680028
Trifluoracetato de sódioSigma Aldrich1615138
SolariX XR 7T Bruker Daltonics
TimsTOF Pro Q-TOF Bruker Daltonics
Glicose U13C Sigma Aldrich389374
Ultimate RS3000 UHPLC Thermo Fisher Científico
Pré-coluna VanGuard CSHTM (5,0 &vezes; 2,1 mm; 1,7 μ m, 130 &)Águas

Referências

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