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Artigo de método

Aquisição de rim em um modelo animal pré-clínico de grande porte

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DOI:

10.3791/67835

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2 de maio de 2025

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1Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular and Comparative Pathobiology, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Visceral, Transplant and Thoracic Surgery, Innsbruck Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo que detalha um modelo cirúrgico para aquisição de rim em um modelo suíno pré-clínico para subsequente perfusão ou transplante por máquina.

Resumo

A perfusão por máquina evoluiu como uma estratégia viável para avaliação, monitoramento, tratamento, otimização de órgãos ex vivo , bem como para prolongar os tempos de preservação. Modelos animais de grande porte têm sido primordiais para o desenvolvimento e otimização dessas tecnologias. No entanto, para garantir a qualidade do enxerto e a reprodutibilidade dos dados, técnicas cirúrgicas padronizadas e clinicamente traduzíveis para a captação de órgãos e tecidos devem ser seguidas. Assim, descrevemos um protocolo otimizado para aquisição de rim em um modelo pré-clínico de suínos. A recuperação renal é realizada usando porcos de raça mista (Yorkshire cross/mix). Resumidamente, após a desinfecção estéril e o drapeado do campo cirúrgico, uma incisão completa na linha média é realizada para obter acesso ideal a ambos os rins. O ureter, a veia renal e a artéria são dissecados até sua origem da veia cava inferior e da aorta, respectivamente. Após a dissecção renal completa, o ureter é amarrado e cortado distalmente. O animal dador é então totalmente heparinizado com 100 UI por kg/peso corporal. Em seguida, a artéria renal é pinçada perto da aorta e a veia renal é pinçada perto da veia cava usando uma pinça vascular de Satinsky. O enxerto renal é então ressecado e a artéria renal é imediatamente canulada na mesa traseira. O rim será então lavado com uma solução de preservação gelada e armazenado no gelo até a perfusão da máquina ou transplante. Finalmente, o coto da artéria renal é ligado com uma ligadura de seda 2-0 e a veia cava é fechada com uma sutura de polipropileno 6-0. Essa técnica recupera rins e simula uma configuração de doador vivo (rim único) ou falecido (rim duplo). A recuperação renal única oferece a vantagem de realizar um autotransplante subsequente. No modelo de doador falecido, o sangue pode ser coletado antes da eutanásia, inserindo agulhas de bolsa de sangue diretamente na aorta, exsanguinando o animal e fornecendo sangue para perfusão ex vivo da máquina.

Introdução

O transplante renal é o tratamento ideal para a doença renal terminal (DRT), proporcionando melhor qualidade de vida e resultados a longo prazo em comparação com a diálise1. Apesar dos avanços na preservação de órgãos, dezenas de pessoas morrem todos os dias de DRT enquanto estão na lista de espera para um transplante de rim2. A perfusão por máquina é um campo em crescimento que aumenta os tempos de preservação, permitindo redes de doadores estendidas e alocação mais eficiente de órgãos. Essa tecnologia também permite o monitoramento e otimização ex vivo de órgãos, minimizando assim os efeitos da lesão de isquemia-reperfusão (IRI). Quando comparada ao armazenamento refrigerado estático (SCS), a perfusão da máquina demonstrou reduzir significativamente a incidência de função tardia do enxerto 3,4. A perfusão por máquina também demonstrou revitalização de enxertos marginais, que de outra forma não teriam atendido aos critérios para transplante5. Apesar dos avanços tecnológicos, a técnica de preservação mais comum continua sendo o SCS no gelo. Outros experimentos e dados pré-clínicos podem ajudar a tornar a perfusão da máquina um dos pilares da preservação do rim.

O modelo suíno para transplante renal está bem estabelecido e tem sido parte integrante do desenvolvimento da tecnologia de preservação renal, especialmente a perfusão por máquina. Ao contrário dos rins unilobulares de roedores, os rins suínos e humanos são multilobulares, semelhantes em tamanho e compartilham anatomia arterial, venosa e urinária análoga 6,7. Portanto, o rim suíno facilita uma tradução direta para o ambiente clínico, especialmente em termos de dispositivos médicos e terapias medicamentosas. Além disso, os rins suínos apresentam uma fisiopatologia da IRI semelhante à dos rins humanos8, tornando-os ideais para estudos de preservação renal.

Para garantir a qualidade do enxerto e a reprodutibilidade dos dados, técnicas cirúrgicas padronizadas e clinicamente traduzíveis para obtenção de órgãos e tecidos devem ser seguidas. Assim, descrevemos um protocolo otimizado para aquisição de rim em um modelo pré-clínico de suínos. Este protocolo permite a recuperação de rins e simula um ambiente de doador vivo (rim único) ou falecido (rim duplo). A recuperação renal única oferece a vantagem de realizar um autotransplante subsequente. No modelo de recuperação renal dupla, a coleta de sangue antes da eutanásia é possível inserindo agulhas de bolsa de sangue diretamente na aorta, exsanguinando o animal e fornecendo sangue para perfusão ex vivo da máquina.

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Protocolo

Todos os procedimentos descritos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso Institucional da Universidade Johns Hopkins, uma instituição credenciada pelo Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA), pelo Escritório de Bem-Estar de Animais de Laboratório (OLAW) e pela Associação para Avaliação e Acreditação de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC). Os animais foram mantidos de acordo com a Lei de Bem-Estar Animal do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos, o Guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e a Política do Serviço de Saúde Pública dos Estados Unidos sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório.

1. Animais e alojamento

  1. Use porcos Yorkshire (Sus scrofa domesticus) clinicamente saudáveis de 3 a 6 meses de idade e 20 a 40 kg, ou comparáveis, para este protocolo.
  2. Alojar os animais em cercas de arame com piso de ripas.

2. Procedimento pré-operatório e anestesia

  1. Jejue o animal pelo menos 12 h antes do tempo de sedação.
  2. Administre simeticona oral (20 mg / kg) pelo menos 12 h antes da cirurgia e repita a dosagem pelo menos 1 h antes da sedação para reduzir a dilatação intestinal.
  3. Administre cetamina (20-30 mg / kg) e xilazina (2-3 mg / kg) em uma única seringa por via intramuscular para evitar injeções múltiplas.
  4. Transfira o porco para a área de estadiamento pré-operatório. Coloque um cateter intravenoso em uma veia marginal da orelha. Administre 3-10 mg/kg/h de solução salina a 0,9% ou solução de Ringer com lactato durante todo o procedimento.
  5. Assim que o porco estiver adequadamente sedado, coloque um tubo endotraqueal (tubo endotraqueal com balonete de 6,0-6,5 mm para animais de 20-30 kg; 6,5-7,0 mm com balonete para 30-40 kg) para administração de anestesia gasosa e ventilação mecânica. Se necessário, facilite com uma dose de propofol (0,8-1,66 mg / kg) por via intravenosa, administrada para efeito.
  6. Remova os pelos no local da cirurgia e ao redor dele usando uma tesoura, bem como uma esfoliação suja do local da cirurgia, antes de mover o animal para a sala de cirurgia.
  7. Transfira o animal para a mesa de operação. Administre cefazolina (20-22 mg/kg) por via intravenosa 10 minutos antes do início da cirurgia e novamente a cada 90 minutos no intraoperatório. Administre pantoprazol (0,5-1 mg / kg) por via intravenosa no início da cirurgia.
  8. Administre um bloqueio local por via subcutânea com lidocaína (até 2 mg/kg) para facilitar a analgesia adicional antes da incisão.
  9. Prepare assepticamente o local da cirurgia, alternando entre clorexidina ou betadina e etanol ou solução salina a 70%, pelo menos três vezes.
  10. Monitore continuamente o volume de fluidos, frequência cardíaca, pressão arterial, oximetria de pulso, capnografia, eletrocardiografia e temperatura retal. Registre esses valores a cada 10-15 minutos. Use uma almofada aquecida na parte inferior da carroceria e um cobertor de ar quente para evitar hipotermia.
  11. Antes do início da cirurgia, confirme se o animal está dentro do plano apropriado de anestesia cirúrgica, utilizando uma combinação de tônus da mandíbula, reflexo palpebral e parâmetros listados na etapa anterior.

3. Procedimento de colheita renal

  1. Prepare o animal para a cirurgia, seguindo os passos descritos na Secção 2.
  2. Após a desinfecção estéril e o drapeado do campo cirúrgico, realize uma laparotomia mediana (25-30 cm) para obter acesso ideal a ambos os rins. Insira um afastador abdominal padrão.
  3. Cubra o cólon e o intestino delgado com toalhas embebidas em solução salina morna. Retraia os intestinos para o lado direito para acesso ao rim esquerdo ou para o lado esquerdo para acesso ao rim direito.
  4. Abra o peritônio que cobre o rim e disseque ao redor do rim para liberar quaisquer aderências. Disseque o ureter até obter 10-12 cm de comprimento.
  5. Dissecar a veia e a artéria renal até sua origem na veia cava inferior e na aorta, respectivamente.
  6. Após a dissecção renal completa, amarre o ureter distalmente com ligadura de seda 2-0 e corte proximalmente à gravata. Deixe a extremidade proximal do ureter aberta para permitir a drenagem da urina.
  7. Heparinizar o animal com heparina intravenosa (100 UI/kg) e aguardar 2 min para garantir a heparinização adequada do rim. Esta etapa deve ser repetida antes da ressecção de cada rim.
  8. Pinçar a artéria renal e a veia renal próximas à aorta e à veia cava inferior, respectivamente, com duas pinças vasculares de Satinsky. Remova o enxerto renal cortando a artéria renal e a veia perto das pinças.
  9. Canule imediatamente a artéria renal com uma cânula de perfusão de ponta romba de 3 mm. Lave o rim com solução gelada da Universidade de Wisconsin (UW) ou solução de preservação de Custodiol Histidina-triptofano-cetoglutarato (HTK).
  10. Remova a cânula de perfusão após a lavagem com UW ou HTK e coloque o rim em uma bolsa de órgãos estéril cheia da mesma solução de preservação gelada que foi usada para lavar o rim. Coloque este saco dentro de um segundo saco de órgão estéril. Posteriormente, armazene o órgão ou inicie a perfusão da máquina.
  11. Ligue o coto da artéria renal com uma ligadura de seda 2-0. Feche o coto da veia renal com uma sutura contínua de duas camadas com polipropileno 6-0.

4. Procedimento de colheita de sangue

  1. Se o procedimento for terminal e todas as outras intervenções cirúrgicas tiverem sido realizadas, prossiga com a coleta de sangue para perfusão mecânica e eutanásia por exsanguinação.
  2. Retraia os intestinos para o lado direito e identifique a aorta abdominal infrarrenal. Libere quaisquer aderências grandes ou tecido cobrindo o vaso.
  3. Insira a agulha da bolsa de coleta de sangue diretamente na aorta. Pendure o saco abaixo do animal para facilitar o enchimento. Quando a bolsa estiver cheia (aproximadamente 450 mL de sangue), remova a agulha da aorta e mantenha a pressão no local da punção.
  4. Para uma segunda bolsa de sangue, insira a nova agulha 1-2 cm proximalmente ao local da punção anterior. Repita com várias bolsas de sangue conforme necessário, movendo-se 1-2 cm proximalmente com cada agulha.
  5. Após a coleta de todo o sangue necessário, induza a parada cardíaca com injeção intravenosa de pentobarbital sódico / fenitoína sódica na dose de pelo menos 78 mg / kg do componente pentobarbital. Se houver preocupação de que o pentobarbital interfira nos ensaios subsequentes do rim, use cloreto de potássio (KCl) (75-100 mg / kg IV) como um método alternativo de eutanásia química se for administrado a porcos sob anestesia. Verifique a morte por falta de batimentos cardíacos, ausência de reflexo corneano e diminuição significativa da temperatura corporal.
    NOTA: Os órgãos e tecidos restantes do porco sacrificado podem ser usados para outros fins de pesquisa ou educacionais, em conformidade com os princípios 3R.

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Resultados

Nosso grupo de pesquisa tem ampla experiência de quase 15 anos com modelos suínos de transplante de órgãos sólidos e alotransplante composto vascularizado 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Aqui,...

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Discussão

O modelo suíno para transplante renal tem sido vital para o desenvolvimento e otimização da tecnologia de perfusão por máquina. Dadas as semelhanças anatômicas, imunológicas e fisiopatológicas com os rins humanos 6,7,8, os rins suínos oferecem uma tradução facilitada para testes clínicos e práticas.

O modelo de aquisição de rim suíno pode ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer aos muitos técnicos veterinários da Escola de Medicina da Universidade Johns Hopkins por sua assistência técnica. Também gostaríamos de expressar nossa gratidão às Dras. Jessica Izzi e Amanda Maxwell, e aos numerosos residentes veterinários, incluindo os Drs. Mallory Brown, Jessica Plunkard e Alexis Roach por fornecer aos nossos animais excelentes cuidados clínicos e supervisão veterinária. Finalmente, gostaríamos de agradecer a todos os membros do Laboratório de Alotransplante Composto Vascularizado (VCA) da Johns Hopkins School of Medicine que ajudaram em qualquer capacidade com a aquisição de rins ou outros procedimentos de aquisição de órgãos realizados em nosso laboratório. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (NIDDK) R44DK136396.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução de Etanol 70%Fisher Scientific04-355-122
Adson Tissue ForceA2:D30ps, 4,75", 1 x 2 dentesWexler SurgicalFL0081.1
Cobertor Bair Hugger para a Saúde Animal sobre o Corpo3M53777
Unidade de Aquecimento Bair Hugger3M77500
Retrator abdominal Balfour com lâminas laterais fixas, 4" de profundidade, 10" de largura máximaMPM Suprimentos Médicos124-7017
Solução de Betadina (5% de Providona-iodo)Saúde Animal do MWINDC-67618-155-01
Cefazolina para Injeção, USPSaúde Animal do MWINDC-63323-237-10
Solução de ClorexidinaSaúde Animal do MWINDC-30798-624-31
Custodial  Solução de Preservação de Órgãos HTKProdutos Farmacêuticos Essenciais25767073545
Pinça de tecido DeBakey, 7,75", 2 mm PontasWexler SurgicalFL0789.1
EUTHASOL (pentobarbital sódico e fenitoína sódica)VirbacNDC-051311-050-01
Injeção de Heparina Sódica, USPSaúde Animal do MWINDC-71288-402-10
Controlador de Gerenciamento de Temperatura de Cachorro-QuenteAugustine Surgical Inc.WC71V
Colchão de aquecimento veterinário para cachorro-quenteAugustine Surgical Inc.V106
Bolsa de isolamento Invisishield, 20" x 20"MedlineDYNJSD1003
Suporte para agulha micro Jacobson, mandíbulas retas, cabo redondo, 7,25"Wexler SurgicalNL0729.11
Solução Injetável de Cloridrato de KetaminaNexGen PharmaceuticalsNC-0256
Esponjas de colo 18" x 18"MedlineMDS231318LF
Tesoura de Dissecação Metzenbaum, 7" CurvaWexler SurgicalSL5011.1S
Tubo de sucção não condutor com conectores escalonados, 1/4" x 10'MedlineDYND50251
Pantoprazol sódico para injeçãoSaúde Animal do MWINDC-55150-202-00
Cânula de Perfusão, Fluxo Livre, Ponta Romba de 3 mmSoluções da Aliança MEDPER-3003S
Yankauer com ponta rígida de bulboMedlineDYND50130
Grampo Satinsky, mandíbulas atraumáticas DeBakey inclinadas de 30 mm, hastes curvas, 10"Wexler SurgicalAL2150.1
Cabo de Bisturi #3Instrumentos de Precisão Mundial500236
Servator B UW (Universidade de Wisconsin)Soluções Globais de TransplanteJFISERB10A r2
Unidade de Coleta Única pré-preenchida CPDA-1, 450 mLLaboratórios JorgensenJO520
Amarração de Sutura de Sofsilk, 2-0, Preta, 18"CovidienS-195
Lâmina de Bisturi Cirúrgico nº 10Instrumentos de Precisão Mundial500239
Sutura Surgipro II, 6-0, azul, 30", braço duplo, agulha CV-22CovidienVP-733-X
Drape cirúrgico de três quartosMedlineDYNJP2414
Lápis eletrocirúrgico Valleylab com eletrodos de aço inoxidávelCovidienCVNE2516H
Gerador eletrocirúrgico Valleylab Force FXcCovidienMFI-MDT-FORCE-FXC
Eletrodo de Retorno de Paciente Polihesivo Valleylab para AdultosCovidienE7507-SD
Solução Injetável de Cloridrato de XilazinaNexGen PharmaceuticalsNC-0334

Referências

  1. Merion, R. M., et al. Deceased-donor characteristics and the survival benefit of kidney transplantation. JAMA. 294 (21), 2726-2733 (2005).
  2. Lentine, K. L., et al. OPTN/SRTR 2022 annual data report: Kidney. Am J Transplant. 24 (2S1), S19-S118 (2024).
  3. Hosgood, S. A., et al. Normothermic machine perfusion versus static cold storage in donation after circulatory death kidney transplantation: a randomized controlled trial. Nat Med. 29 (6), 1511-1519 (2023).
  4. Malinoski, D., et al. Hypothermia or machine perfusion in kidney donors. N Engl J Med. 388 (5), 418-426 (2023).
  5. Hamar, M., Selzner, M. Ex vivo machine perfusion for kidney preservation. Curr Opin Organ Transplant. 23 (3), 369-374 (2018).
  6. Pereira-Sampaio, M. A., Favorito, L. A., Sampaio, F. J. Pig kidney: anatomical relationships between the intrarenal arteries and the kidney collecting system. Applied study for urological research and surgical training. J Urol. 172 (5 Pt 1), 2077-2081 (2004).
  7. Bagetti Filho, H. J., Pereira-Sampaio, M. A., Favorito, L. A., Sampaio, F. J. Pig kidney: anatomical relationships between the renal venous arrangement and the kidney collecting system. J Urol. 179 (4), 1627-1630 (2008).
  8. Giraud, S., et al. Contribution of large pig for renal ischemia-reperfusion and transplantation studies: the preclinical model. J Biomed Biotechnol. 2011 (21), 532127(2011).
  9. Girard, A. O., et al. Hickman catheter use for long-term vascular access in a preclinical swine model. J Vis Exp. (193), e65221(2023).
  10. Gerling, K. A., et al. A novel sutureless anastomotic device in a swine model: A proof of concept study. J Surg Res. 291, 116-123 (2023).
  11. Etra, J. W., et al. Latissimus Dorsi myocutaneous flap procedure in a swine model. J Invest Surg. 34 (12), 1289-1296 (2021).
  12. Etra, J. W., et al. A skin rejection grading system for vascularized composite allotransplantation in a preclinical large animal model. Transplantation. 103 (7), 1385-1391 (2019).
  13. Al-Rakan, M., et al. Ancillary procedures necessary for translational research in experimental craniomaxillofacial surgery. J Craniofac Surg. 25 (6), 2043-2050 (2014).
  14. Santiago, G. F., et al. Establishing cephalometric landmarks for the translational study of Le Fort-based facial transplantation in Swine: enhanced applications using computer-assisted surgery and custom cutting guides. Plast Reconstr Surg. 133 (5), 1138-1151 (2014).
  15. Ibrahim, Z., et al. Cutaneous collateral axonal sprouting re-innervates the skin component and restores sensation of denervated Swine osteomyocutaneous alloflaps. PLoS One. 8 (10), e77646(2013).
  16. Ibrahim, Z., et al. A modified heterotopic swine hind limb transplant model for translational vascularized composite allotransplantation (VCA) research. J Vis Exp. (80), e50475(2013).
  17. Wachtman, G. S., et al. Biologics and donor bone marrow cells for targeted immunomodulation in vascularized composite allotransplantation: a translational trial in swine. Transplant Proc. 43 (9), 3541-3544 (2011).
  18. Kaths, J. M., et al. Heterotopic renal autotransplantation in a porcine model: A step-by-step protocol. J Vis Exp. 108, e53765(2016).
  19. Liu, W. J., et al. Orthotopic kidney auto-transplantation in a porcine model using 24 hours organ preservation and continuous telemetry. J Vis Exp. (162), e61591(2020).
  20. Steinhauser, C., et al. Assessment of hemodynamic and blood parameters that may reflect macroscopic quality of porcine kidneys during normothermic machine perfusion using whole blood. World J Urol. 42 (1), 471(2024).
  21. Kaths, J. M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion for graft quality assessment prior to transplantation. Am J Transplant. 18 (3), 580-589 (2018).
  22. Urcuyo, D., et al. Development of a prolonged warm ex vivo perfusion model for kidneys donated after cardiac death. Int J Artif Organs. 40 (6), 265-271 (2017).
  23. Vallant, N., et al. A comparison of pulsatile hypothermic and normothermic ex vivo machine perfusion in a porcine kidney model. Transplantation. 105 (8), 1760-1770 (2021).
  24. Hosgood, S. A., Saeb-Parsy, K., Hamed, M. O., Nicholson, M. L. Successful transplantation of human kidneys deemed untransplantable but resuscitated by ex vivo normothermic machine perfusion. Am J Transplant. 16 (11), 3282-3285 (2016).
  25. Vallant, N., Wolfhagen, N., Sandhu, B., Hamaoui, K., Papalois, V. Delivery of mesenchymal stem cells during hypothermic machine perfusion in a translational kidney perfusion study. Int J Mol Sci. 25 (9), 5038(2024).
  26. Uzarsk, J. S., et al. Sustained in vivo perfusion of a re-endothelialized tissue engineered kidney graft in a human-scale animal model. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1184408(2023).
  27. Anand, R. P., et al. Design and testing of a humanized porcine donor for xenotransplantation. Nature. 622 (7982), 393-401 (2023).
  28. Pan, W., et al. Cellular dynamics in pig-to-human kidney xenotransplantation. Med. 5 (8), 1016-1029 (2024).
  29. Golriz, M., et al. Pig kidney transplantation: an up-to- date guideline. Eur Surg Res. 49 (3-4), 121-129 (2012).

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