Artigo de método

Análise unilateral do volume pulmonar usando micro-CT para avaliação aprimorada da fibrose pulmonar em modelos pré-clínicos

DOI:

10.3791/67837

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20 de junho de 2025

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1State Key Laboratory of Respiratory Diseases, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Guangzhou Institute of Respiratory Health, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 2Guangzhou National Laboratory, 3Second Department of Elderly Respiratory, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, Guangdong Provincial Geriatric Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um protocolo para utilizar a microtomografia computadorizada (micro-CT) para quantificar regiões ventiladas em um modelo de fibrose pulmonar unilateral induzida por bleomicina por instilação intratraqueal no lado lesional.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A fibrose pulmonar (FP) é uma doença pulmonar intersticial progressiva e irreversível, caracterizada por mau prognóstico e opções de tratamento limitadas. O modelo tradicional de camundongo de fibrose pulmonar induzida por instilação intratraqueal de bleomicina pode resultar em distribuição desigual do medicamento e altas taxas de mortalidade. O refinado método de instilação intratraqueal unilateral para administração de bleomicina em camundongos permite a criação de um modelo de fibrose pulmonar mais uniforme e controlado, proporcionando uma melhor simulação da doença em humanos. Aqui apresentamos um protocolo para utilizar microtomografia computadorizada (micro-CT) para quantificar regiões ventiladas em um modelo de fibrose pulmonar unilateral induzida por bleomicina por instilação intratraqueal no lado lesional. Essa abordagem permite a quantificação do volume pulmonar geral e das regiões pulmonares ventiladas, fornecendo uma medida sensível e precisa da progressão da doença e da resposta ao tratamento. Este estudo envolve anestesia, administração precisa de medicamentos, microtomografia computadorizada e pós-processamento usando o software 3D Slicer para análise de imagens. A análise unilateral do volume pulmonar após o tratamento com bleomicina demonstrou uma redução significativa no volume pulmonar em comparação com os controles. A coloração tricrômica de Masson confirmou a presença e o aumento da deposição de colágeno nos camundongos tratados com BLM. Aqui, avaliamos a fibrose pulmonar em modelos pré-clínicos realizando análise volumétrica pulmonar unilateral usando micro-CT, fornecendo aos pesquisadores um método de avaliação preciso e completo para avaliar intervenções terapêuticas em estudos de FP.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A fibrose pulmonar (FP) é uma doença pulmonar devastadora e irreversível com métodos de tratamento limitados. A incidência global de FP varia de 1 a 13 por 100.000 indivíduos, com um aumento significativo na prevalência observado com o avanço da idade1. Apesar dos esforços significativos nas últimas décadas, o cenário terapêutico para a FP permanece limitado, com apenas dois agentes antifibróticos, nintedanibe e pirfenidona, atualmente aprovados para o tratamento da FP2. A patogênese subjacente da fibrose pulmonar é altamente complexa, abrangendo vários aspectos da fisiologia molecular e celular3. Modelos animais experimentais in vivo , induzidos por diversos agentes, são atualmente ferramentas essenciais para a investigação de mecanismos patogênicos e fenótipos de doenças.

O modelo de camundongo com fibrose pulmonar induzida por bleomicina, administrado por instilação intratraqueal, é amplamente reconhecido por elucidar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes e por identificar potenciais alvos terapêuticos4. No entanto, a distribuição assimétrica e não seletiva da bleomicina instilada intratraquealmente pode levar a altas taxas de mortalidade, principalmente devido à fibrose não homogênea e lesão pulmonar bilateral 5,6. Para resolver essa questão, propusemos uma abordagem de administração intratraqueal unilateral para garantir a entrega uniforme de agentes experimentais no pulmão esquerdo e para melhor mimetizar o processo patológico observado em pacientes com FP 7,8,9. Além disso, a técnica de administração unilateral também pode ser utilizada para avaliar medicamentos que requerem distribuição localizada ou para outras intervenções experimentais direcionadas a um pulmão específico.

Em modelos pré-clínicos, a microtomografia computadorizada (microtomografia computadorizada) tem se tornado cada vez mais valiosa para a investigação de patologias pulmonares e tem se mostrado uma ferramenta poderosa para estudos longitudinais, capaz de fornecer dados qualitativos e quantitativos para monitorar a progressão da doença, bem como a resposta às intervenções terapêuticas10. A micro-CT tem sido utilizada para avaliar o volume total, regiões ventiladas e não ventiladas, morfologia brônquica e densidade tecidual. Com base em nossos estudos anteriores, desenvolvemos um novo método de imagem no qual a micro-TC foi usada para analisar o volume pulmonar unilateral e avaliar os níveis de fibrose em um modelo murino de fibrose pulmonar 7,8,9. Esse método permite a quantificação das regiões pulmonares aeradas, fornecendo uma medida mais precisa e sensível da progressão da doença e da resposta ao tratamento.

Este estudo apresenta um método de análise do volume pulmonar ventilado unilateral derivado de microtomografias computadorizadas em camundongos tratados com bleomicina. Este método inovador oferece uma avaliação mais precisa e abrangente da fibrose pulmonar, potencialmente transformando a forma como avaliamos a eficácia das intervenções terapêuticas em estudos pré-clínicos. Este estudo contribui com um excelente refinamento na análise de modelos pré-clínicos de fibrose pulmonar, fornecendo um poderoso método de análise quantitativa para avaliar os efeitos do tratamento juntamente com a progressão da doença.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica de Guangzhou. Os experimentos foram conduzidos em camundongos C57BL/6 machos de 6-8 semanas de idade, 25-30 g. Os camundongos foram alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas (claro: 25 lux) com acesso ad libitum a comida e água e foram aleatoriamente designados para grupos controle e BLM.

1. Instilação intratraqueal pulmonar unilateral

  1. Anestesiar camundongos machos C57BL/6 (6-8 semanas de idade, 25-30 g) com uma injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico a 1% (50 mg/kg).
  2. Monitore o nível de anestesia observando a frequência respiratória e o reflexo de retirada dos membros.
  3. Prenda o mouse em decúbito dorsal em uma placa de plástico inclinada a 70 ° -90 °, restringindo pelos incisivos e membros.
  4. Use uma pinça estéril sem corte para retrair suavemente a língua.
  5. Insira uma agulha romba personalizada de 22 G na traqueia usando um laringoscópio de pequenos animais para visualizar as estruturas da epiglote e da orofaringe. Gire a placa no sentido anti-horário para -70° para alinhar o brônquio principal esquerdo paralelo ao brônquio principal. Avance a agulha até sentir resistência.
    NOTA: Meça previamente o comprimento do cateter usando um mouse de prática de tamanho semelhante para garantir o comprimento ideal de inserção.
  6. Gire rapidamente para um ângulo de 30 ° e infunda 40 μL de solução de bleomicina (0,02 mg). Remova a agulha.
  7. Mantenha o mouse na posição por pelo menos 30 s para garantir a distribuição adequada do medicamento.
  8. Deixe o rato se recuperar de bruços em um cobertor de aquecimento.

2. Microtomografia computadorizada (micro-CT)

NOTA: Os camundongos foram escaneados usando o sistema micro-CT de acordo com as instruções do fabricante.

  1. Realize micro-CT em camundongos por 3 semanas após a instilação de bleomicina.
  2. Adicione uma quantidade adequada de isoflurano ao vaporizador da máquina de anestesia com gás para pequenos animais, ligue o vaporizador, ajuste a concentração de indução para 3% e coloque os ratos na caixa de indução até que percam o reflexo do flip-flop e exibam respiração lenta e profunda.
  3. Remova os camundongos da caixa de indução e coloque-os em decúbito dorsal na mesa de varredura para que os camundongos tenham seus membros estendidos e seus corpos alinhados ao longo da linha média.
  4. Defina a concentração de manutenção de isoflurano na tabela de varredura para 1%.
  5. Defina o modo de digitalização Micro-CT: campo de visão transversal 43 mm, resolução 2K x 2K, tamanho do pixel 0,042 mm, espessura do corte 0,042 mm.
  6. Após a digitalização, coloque os ratos em um cobertor quente até que eles despertem.

3. Pós-processamento de micro-CT: Segmentação pulmonar seletiva unilateral e análise de volume

NOTA: O processamento das imagens e a análise quantitativa foram realizados utilizando o software gratuito e de código aberto 3D Slicer (http://www.slicer.org), seguindo as instruções do fabricante. As faixas clínicas da Unidade Hounsfield (HU) para a janela pulmonar foram aplicadas para normalizar as imagens de HU, segmentando o parênquima pulmonar em regiões normo-aeradas ([-1000, -350] UH), conforme relatado anteriormente 8,9,11. O procedimento de processamento de imagem é descrito a seguir:

  1. Abra o 3D Slicer. A interface operacional é ilustrada na Figura 1.
  2. Clique em Carregar para importar dados de imagem no formato DICOM. Imagens axiais, coronais e sagitais serão exibidas na interface principal (Figura 2).
  3. Ajuste os parâmetros relacionados à visão sagital conforme mostrado na Figura 3 (opcional). (1: mostrar opções ocultas; 2: escolha Renomear volume atual; 3: Digite Novo nome).
  4. No módulo Editor de segmentos , clique em Adicionar para criar uma segmentação para análise pulmonar seletiva (pulmão direito) (Figura 4) (1: Volumes; 2: Editor de segmentos; 3: Adicionar segmento; 4: Definir limite; 5: Ajustar intervalo de limite; 6: Usar para mascaramento; 7: Definir pincel de esfera).
  5. Ajuste o intervalo de limite para [-1000, -350] HU e ative a opção Usar para mascaramento .
  6. Use a ferramenta Pintura com um pincel esférico para segmentar as regiões pulmonares desejadas.
  7. Selecione a ferramenta Ilha e escolha Manter Ilha Selecionada. Realce o pulmão direito e clique em Mostrar 3D para exibir o modelo 3D no painel de visualização (Figura 5) (1: Editar ilhas (componentes conectados); 2: Escolha 'Manter ilha selecionada'; 3: Mostrar modelo 3D).
  8. No painel Terminologia , altere a cor do modelo 3D para azul (opcional).
  9. Repita as etapas 3.4-3.6 para o pulmão esquerdo. Processe as imagens axiais de TC de tórax camada por camada para calcular o volume pulmonar esquerdo ventilado e criar um modelo 3D (Figura 6).
  10. Altere a cor do modelo 3D do pulmão esquerdo para amarelo (opcional).
  11. Defina a opacidade da segmentação do pulmão direito para 0,2.
  12. Exporte o modelo 3D conforme necessário (Figura 7).
  13. Capture capturas de tela da visualização 3D ou corte imagens e salve-as (Figura 8) (1: Captura de tela de anotação; 2: Escolha o formato da imagem; 3: Modifique o caminho de salvamento).
  14. Use o módulo Segment Statistics para calcular o volume pulmonar (mm3) para cada segmento e realizar análises quantitativas das regiões normo-aeradas (Figura 9).

figure-protocol-1
Figura 1: A interface do software 3D Slicer. A figura exibe a principal interface operacional do software 3D Slicer. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-2
Figura 2: Imagens de TC de fibrose pulmonar induzida por instilação intratraqueal unilateral em camundongos. Incidências axial, coronal e sagital, juntamente com reconstrução pulmonar 3D pós-instilação de bleomicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-3
Figura 3: Ajuste dos parâmetros da visão sagital. A figura ilustra o ajuste dos parâmetros, permitindo visualização e análise precisas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-4
Figura 4: Edição de segmentação e ajustes de parâmetros. A figura demonstra o processo de edição de segmentação e os ajustes de parâmetros correspondentes. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-5
Figura 5: Segmentação 3D do pulmão direito. O processo envolve três etapas sequenciais: editar componentes conectados para segmentação pulmonar (Etapa 1), selecionar Manter ilha selecionada para isolar o pulmão direito (Etapa 2) e clicar em Mostrar 3D para renderizar o modelo no painel de visualização (Etapa 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-6
Figura 6: Reconstrução 3D do pulmão esquerdo com base na análise de micro-TC. As imagens axiais de TC de tórax foram processadas camada por camada para segmentar regiões aeradas, quantificar o volume ventilado e reconstruir um modelo 3D. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-7
Figura 7: Reconstrução pulmonar 3D baseada na análise micro-CT do volume pulmonar ventilado em um modelo de fibrose pulmonar unilateral. Modelos reconstruídos foram exportados em formatos especificados para diretórios predefinidos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-8
Figura 8: Guia para salvar imagens. A figura descreve as etapas sequenciais para salvar imagens, começando com o início da função de salvamento por meio do menu Captura de tela de anotação até a seleção de formatos e a definição de caminhos de armazenamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-protocol-9
Figura 9: Análise estatística baseada em micro-CT em um modelo de fibrose pulmonar unilateral. Foram analisados dados quantitativos derivados de regiões normo-aeradas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Coloração de tricomas de Masson

  1. Fixe a amostra de pulmão com paraformaldeído a 4% à temperatura ambiente (RT) durante a noite, desidrate usando uma série graduada de etanol e embebido em parafina. Preparar fatias com uma espessura de 5 μm com um micrótomo rotativo.
  2. Execute a coloração tricrômica de Masson nas seções da seguinte maneira.
    1. Enxágue as seções desparafinizadas e reidratadas em água destilada, seguido de tratamento mordente em fluido Bouin pré-aquecido a 56-60 ° C por 1 h ou durante a noite em RT.
    2. Após a lavagem, manche as seções com solução de hematoxilina de ferro de Weigert por 10 min, enxágue em água morna corrente da torneira por 10 min e mergulhe em solução de fucsina de ácido escarlate Biebrich por 10-15 min.
    3. Obtenha a diferenciação usando solução de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico por 10-15 min e monitore até que as regiões ricas em colágeno passem de vermelho para claro.
    4. Em seguida, transfira diretamente as lâminas para a solução de azul de anilina por 5-10 min, enxágue em água destilada e diferencie em solução de ácido acético a 1% por 2-5 min.
    5. Após a desidratação por meio de etanol graduado (95% de álcool absoluto) e limpeza de xileno, montar as seções com um meio resinoso.

5. Análise de aprendizado de máquina de coloração tricrômica de Masson

  1. Avalie histopatologicamente a análise da composição do colágeno em pulmões controle e tratados com bleomicina usando a coloração Tricrômica de Masson.
  2. Para reduzir os vieses dependentes do observador, adquira imagens digitais de alta resolução de seções pulmonares coradas usando um scanner de imagem de lâmina inteira.
  3. Em seguida, analise quantitativamente as áreas de colágeno com análise automatizada de imagens orbitaispor software 8,9,12. O processo de treinamento é brevemente descrito abaixo.
    1. Delinear manualmente várias anotações representativas para cada categoria de tecido (por exemplo, colágeno, tecido normal e tecido fibrótico). Use os recursos de pixel extraídos de regiões de treinamento anotadas para construir o conjunto de treinamento para a máquina de vetores de suporte (SVM).
    2. Para seções coradas com Masson, defina a classificação do tecido em três categorias: colágeno, tecido normal e fundo.
      NOTA: O modelo de aprendizado de máquina passa por treinamento iterativo em imagens de lâminas inteiras (WSIs) por meio de anotações e refinamentos repetidos até que as avaliações validadas pelo patologista confirmem a categorização precisa do tecido. Uma vez alcançada a precisão satisfatória da classificação, o processo se torna totalmente automatizado: os recursos são extraídos de cada pixel dentro de regiões de interesse (ROIs) válidas e, posteriormente, o SVM prevê a categoria de tecido correspondente com alta precisão.

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Resultados

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A Figura 10A-D mostra os resultados das alterações do volume pulmonar e da análise da coloração.

Para avaliar o impacto da bleomicina (BLM) no tecido pulmonar, realizamos uma análise comparativa dos volumes pulmonares entre os grupos tratados com solução salina (Ctrl) e os grupos tratados com BLM usando técnicas de imagem 3D. O volume do pulmão esquerdo é significativamente reduzido no grupo BLM em comparação com Ctrl. A quantific...

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Discussão

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A fibrose pulmonar é uma doença devastadora caracterizada pela cicatrização progressiva do tecido pulmonar, levando a um declínio da função pulmonar e, em última análise, à insuficiência respiratória1. O modelo de camundongo com fibrose pulmonar, induzido por vários agentes farmacológicos e métodos de administração, é uma ferramenta essencial para entender a progressão da doença e avaliar a eficácia de potenciais terapêuticas, particularmente na instilação intratr...

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Divulgações

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Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82300092) e Pesquisa Independente do Laboratório Estadual de Doenças Respiratórias (SKLRD-Z-202302) e Financiamento para Projeto de Capacitação em Inovação dos Institutos de Pesquisa Provinciais de Guangdong (KD032024001).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Solução salina a 0,9%EsperançaHBPP008-100
Agulha romba 22GBD383922
Fatiador 3D  Plataforma de computação de imagemFatiador 3D https://www.slicer.org/
BleomicinaMCEHY-17565
IsofluranoRWDR510-22
Kit de Mancha MassonYeasenNº 60532ES58
Microtomografia computadorizadaPinsengSNC-100
ÓrbitaAnálise de imagem de órbitahttps://www.orbit.bio/
Pentobarbital sódicoSigmaPág. 3761
Laringoscópio para pequenos animaisInstrumentos YuyanCG-02M
SPSSIBMVersão 19.0 
Cobertor quenteLaboratório Anim TechLAT-16-0323

Referências

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