Estabelecimento e avaliação de um modelo avançado de fibrose pulmonar in vitro baseado em humanos

Summary

Um método de imagem foi desenvolvido para avaliar a ativação de fibroblastos em fatias pulmonares humanas cortadas com precisão com base na proteína de ativação de fibroblastos (FAP). Esta metodologia estabelece uma plataforma robusta e reprodutível para estadiar a progressão fibrótica, avançando modelos translacionais in vitro para o desenvolvimento terapêutico, mantendo a fidelidade do microambiente do tecido humano.

Abstract

A fibrose pulmonar é caracterizada por destruição irreversível da estrutura alveolar e deposição excessiva de matriz extracelular. Embora os modelos animais tenham sido amplamente utilizados na pesquisa da fibrose pulmonar, nenhum dos modelos atualmente disponíveis recapitula totalmente a natureza progressiva da FPI ou sua característica histológica definidora, como focos fibroblásticos. Modelos in vitro avançados, incluindo fatias pulmonares de corte preciso (PCLS), são frequentemente considerados o sistema de teste pulmonar fisiologicamente mais relevante e têm sido empregados com sucesso para triagem de drogas. No entanto, a incapacidade de diferenciar o grau de fibrose no pulmão da FPI resultou em cegamento e incerteza no PCLS obtido. Pesquisas anteriores demonstraram que a proteína de ativação de fibroblastos (PAF) pode avaliar a atividade pró-fibrótica da DPI, contribuindo potencialmente para o diagnóstico precoce e a seleção de janelas terapêuticas apropriadas. Neste estudo, 600 μm de PCLS serão obtidos de doadores saudáveis e pacientes com FPI usando um cortador de choque e avaliados usando sondas moleculares direcionadas à PAF para determinar o grau de atividade dos fibroblastos com base na intensidade do sinal fluorescente. Essa abordagem fornece um modelo avançado in vitro e uma técnica de avaliação para pesquisa de fibrose pulmonar, aumentando a capacidade de estudar os mecanismos da doença e avaliar intervenções terapêuticas.

Introduction

A fibrose pulmonar (FP) é uma forma comum de etiologia desconhecida e prognóstico particularmente ruim, com sobrevida mediana em cinco anos de apenas 25%¹. O modelo de administração intratraqueal de bleomicina é atualmente o modelo animal mais utilizado para estudos pré-clínicos². No entanto, a fibrose induzida pela bleomicina é transitória e se resolve com o tempo, o que contrasta fortemente com a natureza irreversível da FPI³. Além disso, o modelo de bleomicina intratraqueal apresenta desafios significativos devido à gravidade heterogênea da fibrose resultante da administração endotraqueal, seja cirúrgica ou não cirúrgica. Essas limitações dos modelos animais atuais contribuem para a alta taxa de falha dos ensaios clínicos direcionados à FPI⁴.

Os cortes pulmonares de corte preciso (PCLS) têm sido usados em uma variedade de doenças porque preservam fielmente as redes de diafonia celular específicas da doença e o microambiente ^5,6,7. Na fibrose pulmonar, a PCLS dos pulmões da FPI retém a arquitetura do tecido nativo e a heterogeneidade celular, permitindo a observação de vários tipos celulares e interações célula-matriz extracelular ^8,9, estabelecendo-os como um modelo ex vivo representativo para a investigação da fisiopatologia pulmonar. No entanto, como a fibrose pulmonar é caracterizada por lesões fibróticas heterogêneas nos pulmões, a amostragem do PCLS é inerentemente cega. Não é possível distinguir visualmente se os cortes obtidos representam áreas fibróticas na fase quiescente, fase ativa ou tecido pulmonar normal. Essa limitação ressalta a necessidade de ferramentas de avaliação visual e triagem. Pesquisas anteriores descobriram que a proteína de ativação de fibroblastos (FAP) foi alta e especificamente expressa no tecido pulmonar de pacientes com FPI, indicando que a FAP poderia avaliar a atividade pró-fibrótica da DPI¹⁰.

Neste estudo, um anticorpo de cadeia única contra FAP foi marcado com indocianina verde (ICG) para desenvolver uma sonda de imagem molecular direcionada com maior penetração tecidual. Os PCLS de 600 μm obtidos de doadores saudáveis e pacientes com FPI foram fotografados usando esta sonda, e a atividade dos fibroblastos foi avaliada com base na intensidade do sinal fluorescente. Essa modalidade de imagem supera as técnicas convencionais de avaliação de fibrose (Western blotting, qPCR, coloração tricrômica de Masson ou imunofluorescência) pela simplicidade de operação, mantendo a integridade e a viabilidade da citoarquitetura, permitindo o rastreamento longitudinal da progressão patogênica. Mais importante, é fácil de operar e requer apenas 90 min. Isso fornece uma ferramenta de triagem avançada para o modelo PCLS in vitro , facilitando a pesquisa de fibrose pulmonar.

Protocol

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Primeiro Hospital da Universidade Médica de Guangzhou (2021G-29). A FPI foi diagnosticada com base no exame físico e nos achados da tomografia computadorizada de alta resolução de tórax, seguindo os critérios diagnósticos estabelecidos pela ATS/ERS/JRS/ALAT (2022). Todas as amostras de pacientes com FPI foram obtidas de transplante pulmonar ou biópsia pulmonar. Amostras de tecido pulmonar saudável foram obtidas de doadores de órgãos com diagnóstico de morte encefálica10. O consentimento por escrito para a coleta de tecidos foi obtido de cada paciente ou da família do paciente antes da coleta. Para obter detalhes sobre todos os materiais, soluções e instrumentos usados neste protocolo, consulte a Tabela de Materiais.

1. Preparação de PCLS humano

NOTA: Os pacientes são rotineiramente rastreados para vírus como HIV, HCV ou sífilis antes do transplante de pulmão ou biópsia e devem testar negativo antes de prosseguir com experimentos subsequentes para garantir a segurança ocupacional do pessoal do laboratório.

1. Preparação de soluções
   1. Preparar a solução tamponada com fosfato (1× PBS) e pré-arrefecer a 4 °C.
   2. Prepare a solução de agarose a 2%. Pesar 2 g de agarose e transferi-los para um erlenmeyer. Adicione 100 mL de PBS, misture bem e aqueça no micro-ondas até que a mistura atinja uma fervura vigorosa (≥95 °C), tornando-se completamente límpida, homogênea e livre de partículas ou estrias visíveis. Agite o frasco ocasionalmente durante o aquecimento para evitar a ebulição excessiva. Colocar a solução em banho-maria a 37 °C até à utilização.
2. Fatias de pulmão cortadas com precisão
   1. Lave a superfície externa do tecido pulmonar com PBS para remover o excesso de impurezas e sangue.
   2. Use uma seringa de 20 mL (agulha de 1,2 mm) para aspirar um volume apropriado de agarose e insira-o na traqueia. Injete agarose nos lobos pulmonares lentamente até que esteja totalmente inflado. Interrompa a injeção ao encontrar resistência acentuada para evitar vazamento de agarose.
      NOTA: São necessários aproximadamente 10 mL de agarose para cada bloco de tecido de 5 × 2 × 1 cm, evitando transbordamento. Para pedaços de tecido menores, use uma seringa de 5 mL e moldes de incorporação (por exemplo, moldes de silicone, bandejas de plástico ou tubos de centrífuga cortados no tamanho certo) para auxiliar na incorporação. Despeje uma camada de base de agarose de 1-2 mm de espessura no molde e deixe-o semi-solidificar. Coloque suavemente o tecido pulmonar sobre a agarose semi-sólida e, em seguida, despeje lentamente agarose adicional para cobrir totalmente o tecido, evitando bolhas. Deixe a agarose solidificar completamente.
   3. Coloque os pulmões no gelo por aproximadamente 30 min para permitir a polimerização da agarose. Verifique a pleura quanto à dureza e frieza para confirmar a polimerização; Continue resfriando se necessário.
   4. Corte o tecido pulmonar em placas de 1-2 cm usando uma lâmina afiada.
   5. Centralize a bandeja de banho de gelo na bancada de corte e encha-a com cubos de gelo com antecedência para pré-resfriamento.
   6. Ligue o interruptor de alimentação e pressione e segure o botão UP para elevar o sample stage para uma posição adequada.
   7. Carregue cuidadosamente a lâmina no porta-navalhas.
      NOTA: Manuseie a lâmina com cuidado para evitar ferimentos. Descarte as lâminas usadas em recipientes designados para objetos cortantes.
   8. Corte um pedaço de fita adesiva com aproximadamente 3 cm de comprimento e 1 cm de largura. Prenda o lado adesivo à bandeja e cubra uniformemente o lado não pegajoso com adesivo de cianoacrilato.
   9. Pegue um pedaço de tecido pulmonar usando uma pinça. Seque a superfície com papel absorvente e coloque-a sobre a fita revestida com cola. Pressione suavemente para garantir uma aderência firme.
   10. Depois que a cola endurecer, coloque a bandeja na bandeja de banho de gelo. Encha com PBS pré-resfriado até que o bloco de tecido esteja submerso.
   11. Defina a frequência de vibração para "10" e a velocidade de corte para "2". Pressione o botão FWD para começar a fatiar. Depois que a primeira fatia estiver totalmente cortada, pressione o botão STP para parar e, em seguida, pressione o botão RVE para retrair a lâmina. Descarte a primeira fatia.
   12. Gire manualmente a mesa giratória 6 vezes para definir a espessura da seção para 600 μm. Pressione o botão FWD para retomar o corte e pressione o botão STP após o corte da seção. Pressione RVE para retrair a faca e recuperar a fatia do pulmão usando uma pinça. Coloque a fatia em PBS contendo 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) e mantenha-a no gelo.
   13. Repita as etapas de corte acima para obter PCLS adicional, cada um com aproximadamente 600 μm de espessura.
   14. Quando o bloco de tecido atual estiver quase esgotado, substitua-o por um novo bloco de tecido e repita as etapas 1.2.4 a 1.2.13.

2. Purificação do anticorpo FAP

NOTA: Gere o anticorpo de domínio único específico para FAP contendo uma tag His C-terminal conforme descrito anteriormente ^11,12.

1. Execute a exibição de fagos para permitir a seleção de alto rendimento de fragmentos de anticorpos específicos de FAP (scFv) por meio de bibliotecas combinatórias repetidas contra alvos imobilizados ou em fase de solução. Recupere fagos ligados por meio de lavagem e eluição rigorosas. Amplifice os fagos reinfectando E. coli e enriqueça os aglutinantes alvo ao longo de 3-4 ciclos. Validar clones usando ELISA de fago e sequenciamento de DNA para identificar anticorpos de alta afinidade¹².
2. Clone a sequência de DNA que codifica o fragmento variável de cadeia única anti-FAP no vetor pET-28a (+) fundido com uma tag His para expressão em E. coli¹³.
3. Transforme o plasmídeo recombinante em células E. coli BL21 (DE3). Induzir a expressão proteica utilizando isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) em culturas de balão agitado incubadas durante a noite a 20 °C¹⁴.
4. Purifique o anticorpo FAP do sobrenadante usando grânulos de ácido nitrilotriacético (Ni-NTA). Execute a troca de buffer com PBS para aplicativos downstream.
5. Avalie a pureza do anticorpo por eletroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). Uma única banda dominante com o peso molecular esperado indica alta pureza.

3. Avaliação da afinidade do anticorpo FAP

1. Cultura de células 293T de rim embrionário humano (HEK 293T) em meio de Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina.
2. Adicione a proteína de ativação de fibroblastos humanos (hFAP) com superexpressão de lentivírus às células 293T a 90% de confluência. Incubar por 96 h para gerar uma linhagem celular 293T-hFAP estável.
3. Digerir as células 293T e 293T-hFAP com 0,25% de tripsina-EDTA e recolher as células.
4. Lave as células com PBS e incube com anticorpo FAP seguido de Alexa Fluor 488-conjugado anti-His IgG.
5. Analisar a intensidade da fluorescência com citômetro de fluxo NovoCyte ^15,16.

4. Marcação da sonda de molécula scFv-FAP-ICG

1. Ajustar a concentração de FAP-scFv para 2 mg/ml utilizando PBS.
2. Adicione éster NHS verde de indocianina (ICG-NHS) para obter uma proporção molar de 5:1 (ICG-NHS:FAP-scFv).
3. Misture bem por vórtice e agitação.
4. Incubar a reação no escuro à temperatura ambiente por 2 h.
5. Remova o corante não ligado usando uma coluna de dessalinização. Conservar o produto final conjugado a 4 °C no escuro.

5. sonda molecular scFv-FAP-ICG para avaliação do grau de atividade de fibroblastos em PCLS

1. Depois de cortar o PCLS, coloque uma seção por poço em uma placa de 12 poços. Enxágue cada poço duas vezes com 1 mL de PBS para remover sangue residual e detritos.
2. Mergulhe o PCLS em 1 mL de DMEM sem FBS. Adicionar scFv-FAP-ICG a uma concentração final de 5 μg/ml. Incubar num shaker à temperatura ambiente durante 1 h com agitação suave, protegido da luz.
3. Lave as amostras com PBS três vezes, cada uma por 5 min.
4. Adquira imagens de fluorescência ICG de PCLS usando o sistema de imagem animal in vivo com as seguintes configurações: comprimento de onda de excitação em 785 nm e comprimento de onda de emissão em 810 nm.
5. Avalie a atividade de fibrose do PCLS com base na intensidade da fluorescência. Defina regiões de interesse (ROI) usando software compatível, com radiância de fluorescência expressa como fótons/s/cm²/sr.
   1. Clique no botão Selecionar ROI para permitir que o software contorne automaticamente a área pseudocolorida. Se o posicionamento do ROI for impreciso, ajuste manualmente. Clique em Calcular para determinar a intensidade do sinal na região. Se várias sub-regiões forem selecionadas, some os valores de todas as sub-regiões.

Results

O procedimento de preparação para PCLS de tecido pulmonar humano é representado na Figura 1. O tecido pulmonar humano foi embebido em agarose e posteriormente aparado em blocos de tecido de aproximadamente 1 cm³ de tamanho usando uma lâmina de barbear. Os tecidos aparados e achatados foram afixados a uma plataforma para secção com 600 μm de espessura usando um micrótomo (Figura 1A,B). Os PCLS foram incubados em placas de 12 poços (

Discussion

Por meio dos métodos de pesquisa acima, foram preparados PCLS de doadores saudáveis e pacientes com FPI. Simultaneamente, células de mamíferos foram usadas para expressar fragmentos variáveis de cadeia única de FAP, e sua pureza e especificidade foram verificadas. Uma sonda molecular direcionada à FAP e marcada com ICG foi empregada para detectar os níveis de expressão de FAP, refletindo o grau de ativação dos fibroblastos. Essa abordagem fornece um método de avaliação avançado para o tr...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% tripsina-EDTA	Gibco	15050-057
2× Cor SYBR Green qPCR Master Mix (ROX2)	EZBioscience	A0012-R2
seringa de 20 ml	Winner	V532159
293T célula	Beyotime	C6008
502 cola	Zhuolide	D-40
Agarose, baixa temperatura de gelificação	Sigma Aldrich	A9414-25G
anticorpo	abcam abcam	ab138492
Anticorpo anti-fibronectina	abcam	ab2413
Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488	MBL	D291-A48
BL21	Beyotime	D1009S
Blade	Gillette	7in83a7Q
Color Reverse Transcription Kit (com removedor de gDNA)	EZBioscience	A0010CGQ
Coomassie Blue Super Fast Solução de coloração	Beyotime	P0017F
DMEM	Gibco	12800017
frasco Erlenmeyer	Sichuan Shunbo	GG-17
FAP Rabbit mAb	CST	66562
FBS	Gibco	10099-141
Fórceps	Roboz	RS-5135
ICG-NHS	Ruixibio	R-TE-157
IPTG	MCE	367-93-1
microbalança	Secura	Secura225D-1CN
micro-ondas	Mideo	PM2002
Multi-Mode In Vivo Animal Imaging System	BioLight	AniView600
Ni-NTA	Genscript	L00250
NovoCyte citômetro de fluxo	ACEA	Biosciences Novocyte
PBS	Gibco	10010023
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122
SDS-PAGE	Beyotime	P00528
Purificação Universal de RNA	EZBioscience	EZB-RN4
Vibratome	DOSAKA	DTK-1000N
β-actina Coelho pAb	Yeasen	30102ES
Primer
β-actina primer-F	iGenebook Biotech		CATGTACGTTGCTATCCAGGC
β-actina primer-R	iGenebook Biotech		CTCCTTAATGTCACGCACGAT
FAP primer-F	iGenebook Biotech		TTGAGTGGATGGGAGGGAT
FAP primer-R	iGenebook Biotech		GCTGTGCTCGTGGATTTGT
Colágeno-I primer-F	iGenebook Biotech		GAGGGCCAAGACGAAGACATC
Colágeno-I primer-R	iGenebook Biotech		CAGATCACGTCATCGCACAAC
Fibronectina primer-F	iGenebook Biotech		CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
Fibronectina primer-R	iGenebook Biotech		AAACCTCGGCTTCCTCCATAA