Este estudo avalia a tolerância à seca mediada por Arabidopsis DREB1A em cana-de-açúcar transgênica. Sob estresse, foram observados aumento da fotossíntese, eficiência no uso da água e acúmulo de biomassa. O DR-21 exibiu a maior expressão de DREB1A , melhorando a resiliência à seca. As descobertas fornecem insights sobre mecanismos moleculares e oferecem uma estratégia potencial para o desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar resilientes ao clima em regiões com limitação de água.
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Artigo de investigação
Fotossíntese aprimorada e eficiência no uso da água em cana-de-açúcar transgênica expressando Arabidopsis DREB1A sob estresse hídrico
Neste artigo
Resumo
Resumo
O estresse hídrico impõe uma limitação crítica à produtividade da cana-de-açúcar, necessitando assim do desenvolvimento de cultivares resistentes ao estresse para uma agricultura sustentável. O presente estudo teve como objetivo aumentar a tolerância à seca em cana-de-açúcar por meio da introdução do gene DREB1A de Arabidopsis sob o controle do promotor rd29A induzível por estresse. Linhagens de cana-de-açúcar transgênicas foram geradas por meio de transformação mediada por bombardeio de partículas e posteriormente avaliadas por meio de avaliações moleculares, fisiológicas e agronômicas sob condições controladas e de estresse hídrico.
A análise molecular confirmou a integração estável do transgene, com linhagens transgênicas exibindo um aumento de até 10 vezes na expressão de DREB1A em relação às plantas do tipo selvagem. As avaliações fisiológicas demonstraram que, sob estresse hídrico a 60% da capacidade de campo (FC), as linhagens transgênicas mantiveram taxas fotossintéticas (PN) 224-270% maiores, a condutância estomática (gs) aumentou 84-167% e o teor relativo de água (RWC) foi aumentado em 25-31% em comparação com controles não transgênicos. Além disso, as folhas da cana-de-açúcar transgênica apresentaram melhor regulação osmótica e eficiência no uso da água. As avaliações agronômicas revelaram ainda melhorias significativas no crescimento e produtividade das plantas. Sob estresse hídrico (60% FC), as linhagens transgênicas exibiram altura de cana 76-109% maior, com diâmetro de cana 71-86% maior. A biomassa da parte aérea aumentou 39-87% e a biomassa radicular aumentou 65-103%.
Além disso, a porcentagem de Brix, indicativa de acúmulo de sacarose, aumentou 36-55% nas plantas transgênicas a 60% FC. Esses achados estabelecem uma correlação robusta entre a expressão de DREB1A , maior resiliência fisiológica e melhor desempenho agronômico em condições de seca. A capacidade da cana-de-açúcar transgênica que expressa DREB1A de sustentar maior atividade fotossintética, eficiência superior no uso da água e maior acúmulo de biomassa ressalta seu potencial como estratégia genética para o desenvolvimento de variedades de cana-de-açúcar resistentes à seca. Este estudo oferece novos insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes à tolerância à seca e fornece uma abordagem promissora para garantir o cultivo sustentável de cana-de-açúcar em regiões com escassez de água.
Introdução
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é a segunda maior cultura comercial do Paquistão, cultivada principalmente por seu alto teor de sacarose. No entanto, a produção ideal raramente é alcançada devido à escassez periódica de água 1,2. É um membro da família Poaceae e está agrupado no clado PACCAD da subfamília Panicoideae3. Os membros deste clado são freqüentemente chamados de gramíneas de estação quente e exibem um sistema fotossintético C4 4. O principal modo de fixação de CO2 na cana-de-açúcar é a fotossíntese C4 com fotorrespiração mínima5. As gramíneas C4, como a cana-de-açúcar, podem fixar mais CO2 do que as gramíneas C3, produzindo maiores níveis de sacarose e exibindo melhor eficiência no uso do nitrogênio (NUE) e na eficiência do uso da água (WUE)6,7,8. No entanto, as exigências de umidade do solo para a cana-de-açúcar são bastante altas 9,10,11.
Devido às mudanças climáticas e à disponibilidade limitada de água, a produção de variedades de cana-de-açúcar tolerantes ao estresse hídrico de alto rendimento é crucial 12,13,14. A tolerância das plantas ao estresse hídrico é uma característica multigênica influenciada pela intensidade, tempo e duração do estresse. Devido à localização geográfica do Paquistão (30,3753 ° N, 69,3451 ° E), as práticas convencionais de reprodução não são viáveis devido à baixa floração e viabilidade do pólen15. Portanto, o melhoramento varietal por meio do melhoramento tradicional depende da variação genética e da seleção subsequente das características agronômicas desejadas16. Nesse contexto, a transformação de genes relacionados ao estresse por meio da engenharia genética é uma das abordagens alternativas mais promissoras para melhorar a tolerância ao estresse das plantas 17,18,19.
As respostas ao estresse abiótico em plantas são reguladas por múltiplas famílias de fatores de transcrição (TF) e elementos de ação cis, incluindo WRKY, MYB, bHLH, ERF e NAC. Esses TFs regulam redes em ajuste osmótico, eliminação de espécies reativas de oxigênio (ROS), regulação estomática e vias de sinalização de estresse 20,21,22,23,24,25,26. Por exemplo, os TFs WRKY modulam a sinalização de estresse por meio de vias dependentes de ABA, enquanto as proteínas MYB regulam a biossíntese de flavonóides e a função estomática sob estresse hídrico27. Da mesma forma, os fatores bHLH e ERF interagem com a sinalização do etileno, aumentando assim a resiliência à seca28. Dada a complexidade das respostas ao estresse, direcionar os principais reguladores, como o DREB1A, é uma estratégia promissora para aumentar a tolerância à seca.
Neste estudo, investigamos o papel de ArabidopsisDREB1A na cana-de-açúcar transgênica, com foco em seu impacto na fotossíntese, relações hídricas e características de produtividade em condições de estresse hídrico. O papel das proteínas de ligação a DRE (DREB) na modulação da tolerância ao estresse hídrico foi relatado anteriormente 27,29,30. Por exemplo, Kasuga et al. observaram que o DREB regula positivamente a expressão da sequência DRE em Arabidopsis thaliana31. Além disso, muitos pesquisadores sugeriram que a superexpressão de DREB1A da cana-de-açúcar transgênica exibe expressão constitutiva de genes induzíveis por estresse e níveis mais altos de açúcar do que a cana-de-açúcar do tipo selvagem 17,28,32,33.
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Protocolo
Geração de rd29A: vetor de expressão DREB1A (Figura 1)
O quadro de leitura aberto DREB1A de comprimento total (ORF, 651 pb) foi amplificado a partir do cDNA de Arabidopsis thaliana L. usando primers específicos de genes incorporando locais de restrição BamHI e EcoRI: forward 5 / -GGCGGATCCATGAACTCATTTTCTGCT-3 / e reverse 5 / -GGCGAATTCTTAATAACTCCATAACGA-3 /. Da mesma forma, o promotor rd29A (499 pb) foi amplificado a partir do DNA genômico de Arabidopsis usando primers contendo sítios KpnI e BamHI: forward 5 / -GCGGGTACCCCTATTAGAACGATTAAGGAG-3 / e reverse 5 / -GGCGGATCCGGTGGTTCCTCTGTTTGATCC-3 /. As reações de PCR foram realizadas em volume de 25 μL contendo 2,5 μL de tampão de PCR 10x, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,4 μM de cada primer, 1 U de Taq DNA polimerase e 1 μL de molde de DNA (aproximadamente 100 ng para DNA genômico ou 50 ng para cDNA), com água livre de nuclease adicionada ao volume final. As condições de amplificação para os fragmentos promotores de DREB1A e rd29A foram as seguintes: desnaturação inicial a 95 °C por 3 min; 35 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 58 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 1 min; seguido por uma extensão final a 72 °C por 7 min. Os produtos amplificados foram resolvidos em gel de agarose a 0,7% e purificados em gel usando um Kit de Extração de Gel de acordo com o protocolo do fabricante.
Os produtos amplificados de PCR do promotor DREB1A e rd29A foram clonados no vetor de clonagem, pTZ57R/T, usando clonagem TA, e os produtos foram submetidos ao sequenciamento de Sanger para confirmação. A sequência DREB1A (Access. AM992886) foi submetido ao GenBank (o promotor rd29A foi inserido nos sítios KpnI e BamHI, e a sequência de codificação DREB1A foi inserida a jusante nos sítios BamHI e EcoRI, substituindo assim o promotor 2x35S original e posicionando o DREB1A sob o controle de rd29A. O final (rd29A::DREB1A::CamV) foi excisado usando KpnIe EcoRV e clonado na região T-DNA do vetor binário pGA482 para gerar a construção usada para transformação de plantas (Figura 1). Após o sequenciamento inicial de Sanger para validar os produtos clonados, nenhuma verificação adicional de sequenciamento foi realizada.
Análise de sequência gênica
Usando a ferramenta de bioinformática referenciada, uma análise filogenética das sequências proteicas de AtDREB1A e DREB1 de 13 espécies diferentes de dicotiledôneas e monocotiledôneas foi realizada e comparada por meio do método de junção de vizinhos. As sequências de aminoácidos foram recuperadas de Phytozome (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) e GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). A análise de alinhamento de sequências múltiplas foi realizada usando o programa online Clustal Omega. Uma vez que as sequências essenciais tenham sido adquiridas do Phytozome e do GenBank, não é necessária mais recuperação de sequências.
Preparação de explantes e pistola de indução de calos20,34
A cultivar de cana-de-açúcar foi cultivada no campo experimental do NIBGE, Faisalabad. Após 6 meses, a porção superior da cana sadia foi excisada para recuperar a região apical, que foi aparada até a gema terminal. Em condições estéreis, os rolos de folhas foram descascados em segmentos cilíndricos de ~ 5 mm e a superfície esterilizada com etanol a 70%. A partir da região imediatamente acima do meristema apical, aproximadamente 10-15 discos apicais (~ 3 mm de tamanho) foram preparados por cana. Os discos foram cultivados no meio de indução de calos (CIM) conforme descrito anteriormente 1,20,34. Após 4-6 semanas, os calos embriogênicos resultantes foram subcultivados em CIM fresco para posterior proliferação. NOTA: O uso de etanol a 70% para desinfecção de superfícies foi considerado suficiente, e nenhuma etapa adicional de esterilização foi necessária.
Transformação genética de rd29A: DREB1A em cana-de-açúcar através de Gene Gun20,34
O calo embriogênico proliferado foi disposto no centro da placa de Petri contendo CIM. Após 3 dias, os calos foram bombardeados com um vetor binário expressável de plantas revestido de ouro, pGA482, contendo rd29A: DREB1A, usando uma pistola biolística PDS-1000 / He, conforme descrito em detalhes34. Após o bombardeio, pequenas porções de calos foram cultivadas em CIM por 3 dias e colocadas no escuro a 26 ± 2 oC. Em seguida, os calos foram cultivados em meio de seleção de calos (MSC) contendo 60 mg/L de geneticina, subcultivados em MSC a cada 10 dias e colocados no escuro a 26 ± 2 oC.
Após 30 dias, calos saudáveis foram cultivados em meio de seleção de regeneração (RSM) contendo 60 mg/L de antibiótico para obtenção de brotos. As placas foram colocadas em uma sala de crescimento por 4 semanas a uma temperatura controlada (26 ± 2 °C), fotoperíodo claro/escuro de 16 h/8 h, intensidade de luz de 500 μmol m-2 s-1 e umidade controlada35. As brotações saudáveis regeneradas foram cultivadas em meio de seleção de enraizamento (RtSM) contendo 60 mg/L de antibiótico em potes de vidro e colocadas na sala de crescimento nas condições acima mencionadas. Após 4-6 semanas, os transformantes putativos foram transferidos para pequenos potes de plástico contendo solo arenoso esterilizado e colocados na sala de crescimento nas condições acima mencionadas. Não é necessária mais subcultura em meio de seleção de calos (CSM) além de 10 dias.
Confirmação molecular de plantas transgênicas de cana-de-açúcar
Conforme descrito anteriormente, o DNA genômico foi isolado das folhas jovens de plântulas de cana-de-açúcar transgênicas putativas usando o método de extração CTAB36. A qualidade e a concentração do DNA foram avaliadas usando um espectrofotômetro NanoDrop e eletroforese em gel de agarose. A amplificação por PCR do gene marcador selecionável nptII (750 pb) e do transgene DREB1A (651 pb) foi realizada usando primers específicos do gene listados na Tabela 1. Cada reação de PCR de 25 μL continha 1x tampão de PCR, 2,5 mM de MgCl₂, 0,2 mM de dNTPs cada, 0,4 μM de cada primer, 1 U de Taq DNA polimerase, ~ 100 ng de DNA genômico e água deionizada em volume. As reações foram executadas em um termociclador nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95 °C por 3 min; 35 ciclos de 94 °C durante 30 s, 58 °C durante 30 s, 72 °C durante 45 s; seguido por uma extensão final a 72 °C por 5 min. Os produtos de PCR foram resolvidos em um gel de agarose a 1% e visualizados sob luz UV para confirmar a amplificação. Plântulas transgênicas positivas para PCR (T0) foram então transferidas para grandes vasos de barro e endurecidas em ambiente controlado de estufa até a maturidade. Após a maturação, segmentos de cana de cinco eventos T₁ confirmados por PCR selecionados aleatoriamente foram plantados e propagados em microparcelas por 12 meses para gerar conjuntos clonais suficientes para o experimento de estresse hídrico. NOTA: Uma vez que os genes nptII e DREB1A foram confirmados, nenhuma amplificação adicional de PCR foi realizada.
Estudo de expressão de DREB1A
A expressão relativa de DREB1A em folhas estressadas de plantas de cana-de-açúcar transgênicas e não transgênicas foi quantificada por meio de PCR em tempo real (qPCR). O RNA total foi isolado de ~100 mg de tecido foliar usando o reagente de extração de acordo com o protocolo do fabricante. A qualidade do RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose e quantificada por espectrofotômetro. Para cada amostra, 2 μg de RNA foram transcritos reversamente usando o Kit de Síntese de cDNA seguindo as instruções do fornecedor, com oligo(dT) primers.
O cDNA resultante foi usado como modelo para amplificar um DREB1A de 188 pb usando primers específicos do gene: 5'-ACAGAGGAGTTCGTCGGAGA-3' direto e 5'-GAGTCTCCAAGCCGAGTCAG-3'. Cada reação de qPCR de 25 μL continha 12,5 μL de 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,4 μM de cada primer, 2 μL de cDNA diluído (modelo de ~ 100 ng) e água livre de nuclease para trazer o volume para 25 μL. As reações foram realizadas em triplicata em um termociclador usando o seguinte programa: desnaturação inicial a 95 ° C por 5 min, seguido por 40 ciclos de 95 °C por 30 s, 56 °C por 30 s e 72 °C por 30 s, com uma extensão final a 72 °C por 10 min.
Para confirmar a eficiência e linearidade das reações de qPCR, uma curva padrão foi inicialmente gerada usando diluições seriais de 10 vezes do DNA do plasmídeo contendo o fragmento clonado de DREB1A . No entanto, para análise de expressão, a quantificação relativa foi realizada usando o método 2−ΔΔCt 37. O gene da actina serviu como referência endógena, e o nível de expressão de DREB1A em cada linhagem transgênica foi normalizado para o controle do tipo selvagem. Todos os valores de Ct foram coletados usando configurações automáticas de linha de base e limite recomendadas pelo software do instrumento. Apenas curvas de fusão com picos únicos e agudos foram aceitas, confirmando a especificidade. O RNA não degradado de alta qualidade foi essencial para uma quantificação precisa. Amostras de RNA impuro ou degradado foram excluídas para evitar comprometer a confiabilidade da síntese de cDNA e análise de expressão gênica a jusante.
Estudo das alterações mediadas por DREB1A em cana-de-açúcar: experimento de estresse hídrico20,34
Após 1 ano, três repetições de cinco segmentos de cana (dois nós/segmento) de plantas transgênicas e não transgênicas (tipo selvagem) foram semeadas a 5 cm de profundidade em vasos de barro contendo 18 kg de solo (ECe 1,34; SAR 2,72; pH 7,8). Foram aplicados três regimes de estresse hídrico: 100, 80 e 60% de CA ( Tabela 2). A atividade fotossintética da cana-de-açúcar (PN, E e gs) e as relações hídricas das plantas (Ψw, Ψs e RWC) foram estudadas após 12 meses. Não altere os regimes hídricos estabelecidos, pois isso afetará a consistência dos tratamentos.
Determinação da atividade fotossintética
Após 180 dias de estresse hídrico, os parâmetros de troca gasosa - taxa fotossintética (PN), taxa de transpiração (E) e condutância estomática (gs) - foram medidos em plantas de cana-de-açúcar transgênicas e selvagens usando um sistema portátil de fotossíntese portátil. As medições foram feitas entre 09:00 e 11:00 usando a terceira folha totalmente expandida do topo de cada planta. A folha selecionada foi inserida suavemente na câmara de folhas transparente embutida (área de grampo de 3 cm2 ), garantindo contato completo sem vincos ou obstruções. As condições ambientais foram registradas em tempo real pelo sistema, enquanto a intensidade da luz foi mantida em aproximadamente 1.000 μmol m-2 s-1 sob luz solar natural. O dispositivo foi deixado em equilíbrio por 30-60 s até que as leituras em estado estacionário fossem obtidas para assimilação de CO2 e troca de vapor d'água. Os sensores internos do instrumento registraram automaticamente a temperatura da folha, a umidade relativa e a concentração ambiente de CO2 . Para cada genótipo e tratamento, as medidas foram replicadas em pelo menos três plantas biologicamente independentes, e os dados foram armazenados internamente e posteriormente exportados para análise. Foi tomado cuidado para manter condições ambientais consistentes entre as réplicas para garantir a confiabilidade dos dados.
Determinação do potencial hídrico foliar e do potencial osmótico
O potencial hídrico (Ψw) da terceira folha totalmente expandida do topo das plantas foi determinado usando a câmara de pressão do tipo Scholander. As folhas foram então congeladas a -20 oC em tubos de 1,5 mL, e a seiva celular obtida das folhas congeladas foi utilizada para analisar o potencial osmótico (Ψs) usando o Osmômetro.
Determinação do teor relativo de água foliar
O teor de água das folhas das plantas transgênicas e selvagens foi examinado em detalhes. Os pesos frescos das folhas foram medidos e as folhas foram imersas em água destilada durante a noite. Posteriormente, o peso túrgido das folhas foi registrado, enquanto o peso seco foi determinado incubando as folhas a 70 °C por 72 h. O CRP foliar foi calculado usando a seguinte fórmula:
NOTA: Para analisar com precisão o potencial osmótico usando um osmômetro, as folhas devem ser congeladas a -20 °C uma vez que o potencial de água tenha sido determinado.
Atributos de rendimento
As características de produtividade da cana-de-açúcar foram medidas na fase de colheita, como altura da cana (cm), diâmetro, número de canas moídas, brix (%) e biomassa da parte aérea e da raiz.
Análises estatísticas
Os experimentos de campo (controlados por meio de cerca) foram realizados em delineamento de blocos ao acaso, com três repetições por tratamento (cinco plantas por repetição; n = 15). Uma análise de variância de duas vias foi realizada para analisar as mudanças em diferentes características agronômicas e fisiológicas em um nível de significância de P ≤ 0,05.
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Resultados
Caracterização molecular de linhagens transgênicas de cana-de-açúcar
O de expressão rd29A: DREB1A foi construído e clonado no vetor binário expressável por plantas pGA482 (Figura 1), que foi então transformado no genoma da cana-de-açúcar usando a técnica de transformação mediada por biolística e desenvolveu com sucesso plântulas transgênicas de cana-de-açúcar conforme descrito (Figura 2). A presença de transgenes em linhagens de cana...
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Discussão
O desenvolvimento da tolerância ao estresse hídrico nas plantas é crucial devido à expansão contínua de regiões propensas à seca em todo o mundo. Como uma abordagem biotecnológica potencialmente viável, estudamos o papel do DREB1A na tolerância ao estresse hídrico em linhagens de cana-de-açúcar transgênicas. Estudos anteriores relataram o papel do fator de transcrição DREB1A na indução da expressão de múltiplos genes que conferem tolerância ao estresse abiótico
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.
Agradecimentos
Número do Projeto de Apoio aos Pesquisadores da Universidade Princesa Nourah bint Abdulrahman (PNURSP2025R39), Universidade Princesa Nourah bint Abdulrahman, Riad, Arábia Saudita.
DISPONIBILIDADE DE DADOS:
Todos os dados são fornecidos neste artigo.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Vetor de clonagem, pTZ57R/T | Fermentas, Vilnius, Lituânia | ||
| analisador de troca gasosa infravermelho | Bio-Rad, Califórnia, EUA | ||
| Osmômetro | Bio-Rad, Califórnia, EUA | ||
| Máquina de PCR | Bio-Rad, Califórnia, EUA | ||
| Pistola biolística PDS-1000/He | ThermoFisher Sceintific Inc, EUA | ||
| PCR em tempo real | ThermoFisher Sceintific Inc, EUA | ||
| Kit de síntese de cDNA RevertAid | CI-340, CID Bio-Science, Inc., EUA | ||
| Câmara de pressão tipo escoladeira | Instrumentos Skye, Llandrindod Wells, Birmingham, Reino Unido | ||
| Reagente de TRIzol | Wescor-5500, Logan, Utah, EUA |
Referências
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