Modelo de obstrução ureteral unilateral para investigação de fibrose intersticial renal

Resumo

Este protocolo descreve um método para induzir obstrução ureteral unilateral (UUO) em camundongos para estudar a progressão da fibrose tecidual na nefropatia obstrutiva. Inclui procedimentos cirúrgicos, cuidados pós-operatórios e métodos para avaliação da fibrose.

Resumo

A fibrose renal é o desfecho patológico final da doença renal crônica progressiva (DRC). O modelo de obstrução ureteral unilateral (UUO) é amplamente utilizado para elucidar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes à fibrose intersticial renal e para identificar potenciais alvos terapêuticos. Este modelo é estabelecido em camundongos por meio da ligadura cirúrgica de um ureter unilateral, um procedimento relativamente simples e fácil de realizar. No entanto, sabe-se que o modelo de camundongo UUO exibe variabilidade e inconsistência significativas, influenciadas por fatores como tensão do camundongo, idade, sexo, tipo de anestesia, duração da cirurgia, temperatura corporal durante o procedimento, habilidades cirúrgicas do operador, condições de alimentação e o estado geral de saúde dos camundongos. Variações nas técnicas cirúrgicas, colocação de sutura e duração da obstrução contribuem para a variabilidade nos resultados. Além disso, a amostragem inconsistente de rins obstruídos aumenta ainda mais a variabilidade na avaliação da fibrose renal. Este estudo descreve o processo de desenvolvimento do modelo de camundongo UUO e avaliação da fibrose intersticial, discute os desafios técnicos que contribuem para a imprevisibilidade do modelo e propõe possíveis soluções. Esses insights visam estabelecer uma abordagem mais padronizada e universalmente aplicável para investigar a fibrose renal.

Introdução

A doença renal crônica (DRC) afeta mais de 10% da população mundial, e sua prevalência está aumentando¹. Várias condições do trato urinário, incluindo anomalias anatômicas congênitas, nefrolitíase, hiperplasia prostática e tumores vesicais, podem levar à obstrução ureteral². Como resultado, o modelo de camundongo com obstrução ureteral unilateral (UUO) é uma ferramenta fundamental para identificar novos mecanismos de fibrose intersticial renal, entender a progressão da doença e avaliar possíveis estratégias de tratamento. Tem sido amplamente utilizado para investigar a origem de miofibroblastos, subaglomerados de (mio)fibroblastos, metabolismo celular tubular e parada do ciclo celular, transição epitelial-mesenquimal parcial e outros processos relacionados 3,4,5,6,7,8.

Além da fibrose intersticial renal induzida por UUO, outros modelos de fibrose intersticial renal comumente usados em roedores incluem modelos induzidos por toxinas, como aqueles que usam ácido aristolóquico, ácido fólico e adenina, bem como modelos induzidos cirurgicamente como nefrectomia 5/6 e lesão de isquemia-reperfusão (IRI). O modelo UUO oferece várias vantagens sobre os modelos alternativos de fibrose renal. Por exemplo, a fibrose renal induzida por toxina requer um período de modelagem relativamente longo (aproximadamente 1-2 meses), e seus efeitos colaterais tóxicos em outros órgãos podem complicar a investigação dos mecanismos de fibrose ^9,10,11. Modelos induzidos cirurgicamente, como nefrectomia 5/6, podem levar a sangramento renal significativo e infecção, aumentando o risco de mortalidade pós-operatória. Além disso, a extensão da fibrose intersticial induzida está diretamente correlacionada com o volume de tecido renal ressecado, tornando difícil reproduzir consistentemente o mesmo grau de fibrose em cada camundongo¹².

O modelo renal IRI é um método primário para induzir lesão renal aguda à DRC e tem relevância clínica significativa. A gravidade da fibrose pode ser modulada ajustando-se o tempo isquêmico e a temperatura corporal; no entanto, em comparação com o modelo UUO, é mais complexo cirurgicamente, e a indução de fibrose intersticial requer maior duração¹³. Comparado a esses modelos, o modelo UUO tem várias vantagens, incluindo uma curta duração de modelagem, variabilidade mínima, repetibilidade e um procedimento cirúrgico relativamente simples. O modelo de camundongo UUO, que não envolve toxinas, é criado pela ligação de um ureter, levando à nefropatia obstrutiva em duas semanas. Isso resulta em hidronefrose, dilatação tubular e fibrose intersticial, muito semelhante ao processo patológico observado em humanos¹⁴. A gravidade da fibrose - leve, moderada ou grave - pode ser controlada ajustando a duração do experimento.

Embora o modelo de camundongo UUO seja mais simples de executar do que outros modelos induzidos por insulto para investigar a DRC, vários fatores podem afetar significativamente sua estabilidade. Esses fatores incluem a linhagem do camundongo, idade, sexo, tipo de anestesia, duração da cirurgia, temperatura corporal durante a cirurgia, habilidades cirúrgicas do operador e as condições de alimentação e estado de saúde dos camundongos^15,16.

Minimizar o estresse cirúrgico e a infecção durante a realização do procedimento de maneira constante e organizada sob anestesia é essencial para criar um modelo de camundongo UUO reprodutível. Além disso, a pesquisa sobre os mecanismos e potenciais alvos terapêuticos da DRC pode ser comprometida por operadores inexperientes, levando ao aumento da perda de camundongos e maior heterogeneidade do modelo. Para enfrentar esses desafios, os principais aspectos técnicos do processo cirúrgico - antes, durante e depois do procedimento - são delineados, destacando questões críticas que requerem atenção. Além disso, a metodologia de avaliação para o modelo de camundongo UUO é detalhada para fornecer aos pesquisadores uma abordagem consistente e confiável.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais são conduzidos de acordo com as diretrizes da agência e aprovados pelo Comitê Institucional de Ética Animal da Universidade Médica de Nanjing. Para eliminar as diferenças de sexo e cepa e garantir a comparabilidade dos resultados, apenas camundongos CD1 machos com idade entre 8 e 10 semanas e pesando 22 a 25 g são usados. Os detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de animais e instrumentos

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia.
2. Pesar e anestesiar os camundongos (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Conecte adequadamente o dispositivo de anestesia inalatória e coloque os camundongos na câmara de indução com isoflurano a 2% misturado com oxigênio a 1-2 L/min. Em seguida, coloque o nariz do rato no cone do nariz com um suprimento constante de anestesia. Confirme o nível apropriado de sedação avaliando a falta de resposta a um beliscão do dedo do pé.
   NOTA: Verifique regularmente a frequência respiratória e avalie o nível de anestesia usando o reflexo pedal dos camundongos. Ajustar o isoflurano conforme apropriado.
3. Coloque o mouse em uma almofada térmica eletrônica em decúbito dorsal com a cabeça e o pescoço estendidos para manter as vias aéreas abertas. Prenda as patas com fita adesiva baixa.
4. Use um termômetro para monitorar a temperatura ambiente e mantê-la em 37-38 °C. Insira uma sonda retal e mantenha a temperatura corporal central dos camundongos em torno de 36,5-37 ° C durante o procedimento.
5. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar lesões por xerose da córnea.
6. Raspe o cabelo sobre a área cirúrgica com creme depilatório e desinfete-o com solução de betadina três vezes.

2. Procedimento cirúrgico

NOTA: Assim que a temperatura corporal se estabilizar no ponto de ajuste e o reflexo de pinça do dedo do pé estiver ausente, inicie os seguintes procedimentos cirúrgicos.

1. Use uma lâmina cirúrgica para fazer uma incisão cirúrgica vertical de aproximadamente 1 a 1,5 centímetros da bexiga até a borda inferior esquerda das costelas para expor a cavidade abdominal.
2. Mova o intestino para o lado direito da cavidade abdominal usando um cotonete umedecido com solução salina normal estéril para expor o rim esquerdo, localizado abaixo da parte posterior do baço e adjacente à coluna.
3. Use uma pinça de íris curva para limpar a gordura e o tecido conjuntivo ao redor do ureter esquerdo. Após um isolamento suave, ligue o ureter esquerdo próximo ao polo inferior do rim usando uma sutura trançada de seda 3/0. Faça uma segunda ligadura do ureter esquerdo entre a primeira ligadura e a bexiga.
   NOTA: Para minimizar a variabilidade entre os camundongos, certifique-se de que a posição de ligação permaneça consistente em todos os indivíduos. Use a pinça esquerda para colocar a sutura nas pontas da pinça direita e deslize a sutura de volta sob o ureter¹⁷. Evite incluir excesso de gordura e tecido conjuntivo na ligadura, pois isso pode levar à obstrução renal incompleta. Consiga isso acariciando suavemente o ureter com cotonetes secos.
4. Reposicione cuidadosamente os intestinos na cavidade peritoneal. Suturar as camadas muscular e cutânea separadamente usando uma sutura trançada de seda 3/0.
   NOTA: Suturar a pele e as camadas musculares juntas pode causar ruptura da ferida da sutura e danos nas vísceras abdominais.
5. Ao operar em vários camundongos, limpe os instrumentos cirúrgicos com água corrente e etanol a 75% antes de prosseguir para o próximo camundongo.

3. Cuidados e acompanhamento pós-cirúrgico

1. Injete 0,5 mL de solução salina normal quente por via intraperitoneal para evitar a desidratação.
2. Coloque os ratos de volta em uma gaiola limpa até que eles recuperem a consciência total.
3. Administre buprenorfina (50 μg/kg) por injeção subcutânea durante 3 dias. Monitore os ratos diariamente em busca de sinais de falta de higiene, diminuição da alimentação e postura anormal.

4. Avaliações pós-operatórias

1. Histologia
   1. Eutanasiar os camundongos com uma overdose de isoflurano (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Colha os rins obstruídos e contralaterais não obstruídos¹⁸ após a eutanásia.
   2. Use a maior área de seção transversal da seção renal para exame histológico.
   3. Fixe os tecidos renais em paraformaldeído a 4% e corte as amostras obtidas em seções de 4 μm.
   4. Coloração renal com ácido periódico de Schiff (PAS), coloração tricrômica de Masson (MTS) ou coloração vermelha de Sirius para detectar lesão tubular renal e fibrose renal.
   5. Selecione dez campos aleatórios das seções renais sob um microscópio óptico com uma ampliação de 200×.
   6. Calcule a proporção da área azul positiva para colágeno usando o software ImageJ.
2. Western blot
   1. Extrair aproximadamente 20 mg de tecido renal do mesmo pólo dos rins UUO usando tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA)¹⁸.
   2. Quantificar a concentração de proteínas usando um ensaio de ácido bicinconínico¹⁹.
   3. Carregue quantidades iguais de amostras de proteína em géis Bis-Tris a 4% a 10% para eletroforese e transfira-os para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF).
   4. Bloqueie as membranas de PVDF com leite a 5% em Tris-Buffered Saline Tween (TBST) e incube-as com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C.
   5. Lave as membranas de PVDF com TBST e incube-as com anticorpos secundários à temperatura ambiente por 1 h.
   6. Detecte os níveis de proteína usando um método de quimioluminescência aprimorada (ECL) e analise-os usando o software ImageJ, com gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) como controle de carga.
3. Função renal
   1. Anestesiar os ratinhos com isoflurano inalado (ver passo 1.2).
   2. Colete amostras de sangue retroorbitalmente após a anestesia.
   3. Centrifugue amostras de sangue a 3.000 x g por 15 min em temperatura ambiente.
   4. Meça a creatinina sérica e o nitrogênio ureico no sangue (BUN) usando um analisador químico seco automático para monitorar a função renal.

Resultados

Histologia
A coloração com ácido periódico de Schiff (PAS) revelou dilatação tubular, perda de bordas em escova, formação de cilindros e edema epitelial tubular. A coloração tricrômica de Masson e vermelho de Sirius mostrou fibrose intersticial após UUO, em contraste com os túbulos compactos normais com lúmens discerníveis observados no grupo simulado. O grau de fibrose intersticial renal, indicado por áreas azuis na coloração tricrômica de Masson e áreas vermelhas na coloração vermelha Sirius, aument...

Discussão

Um procedimento abrangente para estabelecer o modelo UUO, uma abordagem amplamente utilizada para investigar a fibrose intersticial renal, é fornecido. Além disso, a identificação e avaliação do modelo, incluindo avaliações da função renal e alterações histológicas, são demonstradas. As variáveis que contribuem para a heterogeneidade do modelo e os fatores técnicos modificáveis são discutidos.

A suscetibilidade ao UUO varia significativamente com base na idade...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL Seringa	Mingankang	/
4/0 sutura cirúrgica	Jinhuan Medical	F401
75% Etanol	Lircon	6303060031
Anestesia Bomba de Ar	RWD Life Science	R510-29
Câmaras de Indução de Anestesia	RWD Life Science	V102-V
Máquina de cortar pêlos de animais	Jinke	/
Solução de betadine	Lircon	6303030036
Buprenorfina (analgésico)	RWD Life Science	/
Pinça de íris curva	jinke	/
Almofada térmica eletrônica	Reptizoo	AHM23
pinça reta fina	Jinke	/
Recipiente de filtro de gás	RWD Ciências da vida	R510-31-6
Almofadas de Gaze	Winner Medical	601-026576
Tesoura de Íris	Jinke	/
Isoflurano (anestésico)	multi-saída RWD Life Science	R510-22-10
	RWD Life Science	R550IE
Porta-agulha	jinke	/
pomada oftálmica	Dechra NDC	17033-211-38
Cotonete estéril	Winner Medical	601-015213
Soro fisiológico estéril	Shimen	H20066533

Máquina de anestesia animal