Artigo de método

Plataforma de imagem óptica multimodal para estudar o metabolismo celular

DOI:

10.3791/67906

⸱

6 de junho de 2025

 ,  ,  , 
1Shu Chien-Gene Lay Department of Bioengineering, University of California San Diego, 2Aiiso Yufeng Li Family Department of Chemical and Nano Engineering, University of California San Diego, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of California San Diego, 4Institute of Engineering in Medicine, University of California San Diego, 5Synthetic Biology Institute, University of California San Diego

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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Utilizando uma plataforma multimodal que combina modalidades de imagem óptica sem rótulo, desenvolvemos um protocolo para visualizar e quantificar a dinâmica e o metabolismo celular. Por meio de imagens via fluorescência multifotônica, geração de segundo harmônico e microscopia de espalhamento Raman estimulada, podemos gerar uma visão holística do ambiente celular e molecular.

Resumo

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As tecnologias de imagem óptica são críticas em estudos biomédicos por sua capacidade de obter informações morfológicas e funcionais de espécimes biológicos em alta resolução espacial. Esses processos ópticos exploram várias interações luz-molécula, como espalhamento, absorção, emissão e geração de harmônicos, entre fótons e as moléculas dentro de células, tecidos ou órgãos. Embora a imagem biomédica convencional tenha historicamente se concentrado na aplicação de uma única modalidade, pesquisas recentes mostraram que essas diversas técnicas fornecem insights complementares e seus resultados combinados oferecem uma compreensão mais abrangente das mudanças moleculares nos processos de envelhecimento e desenvolvimento de doenças e fundamentos na biologia celular.

Nas últimas décadas, os métodos de imagem óptica sem rótulos avançaram, permitindo a exploração detalhada de ambientes celulares e subcelulares. Por exemplo, a fluorescência multifotônica (MPF) não apenas facilita a imagem de proteínas direcionadas, mas também quantifica a atividade metabólica por meio de coenzimas autofluorescentes, alcançando alta profundidade de penetração e resolução espacial. A Geração de Segundo Harmônico (SHG) é usada para obter imagens de estruturas como colágeno na matriz extracelular, enquanto o Espalhamento Raman Estimulado (SRS) mapeia ligações químicas e composição molecular in situ com resolução subcelular.

Desenvolvemos uma plataforma de imagem multimodal que combina as modalidades MPF, SHG e SRS. A integração dessas modalidades em uma única plataforma permite a aquisição de informações multifacetadas da mesma localização dentro de células, tecidos, órgãos ou mesmo corpos, facilitando uma exploração mais detalhada das intrincadas relações entre metabolismo celular, estrutura da matriz extracelular e composição molecular. Este sistema multimodal oferece resolução subcelular, penetração profunda de tecidos, imagens in situ de células vivas/tecidos, bem como detecção sem marcação e co-registro instantâneo sem a necessidade de ajustes de posição, troca de dispositivos ou alinhamento pós-análise. Aqui, apresentamos um protocolo para imagens sem marcação com esta plataforma multimodal e demonstramos sua aplicação na caracterização do metabolismo celular e heterogeneidade molecular em células e tecidos para o estudo do envelhecimento e doenças.

Introdução

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A imagem biomédica óptica tem sido fundamental para o avanço de nossa compreensão da estrutura e função biológicas. As imagens são geradas modulando a luz de excitação e detectando sinais de interações luz-tecido. O primeiro microscópio composto, desenvolvido por Hans e Zacharias Janssen por volta de 1590, utilizou duas lentes convexas em um tubo, proporcionando ampliação de até 30x1. Os microscópios ópticos modernos, após séculos de avanços, agora podem atingir resoluções tão finas quanto 1-3 nm 2,3. Além de oferecer alta resolução, os sistemas avançados de imagem agora fornecem penetração mais profunda do tecido, maior eficiência e danos mínimos à amostra, tornando-os especialmente adequados para imagens de células vivas e tecidos. A imagem sem marcação é particularmente vantajosa, pois captura informações sem interromper os processos intracelulares ou comprometer a integridade da amostra.

A microscopia de fluorescência multifotônica (MPF), particularmente a microscopia de fluorescência de dois fótons, tem sido amplamente utilizada para imagens sem marcadores. Ao contrário da microscopia de fluorescência convencional, que depende da absorção e emissão linear de um único fóton, a excitação do MPF envolve a absorção simultânea de vários fótons, cuja energia combinada excita uma única molécula de fluoróforo 4,5. Esses fótons, normalmente no espectro infravermelho, possuem metade ou menos da energia necessária para a excitação de um único fóton. Os comprimentos de onda mais longos e a excitação localizada no ponto focal neste processo não linear resultam em menor espalhamento, penetração mais profunda do tecido e fototoxicidade reduzida.

As informações metabólicas celulares podem ser capturadas por microscopia MPF livre de marcação por meio da detecção de sinais de autofluorescência de substratos metabólicos endógenos, como dinucleotídeo de nicotinamida adenina reduzido (NADH) e dinucleotídeo de flavina adenina (FAD). Essas coenzimas exibem espectros distintos de excitação e emissão, e sua razão de intensidade de fluorescência, conhecida como razão redox (NADH / FAD), reflete o estado oxidativo da célula. Desde que Britton Chance introduziu pela primeira vez o conceito de razão redox em 1979, razões adicionais, incluindo NAD(P)H/FAD, NAD(P)H/(FAD + NAD(P)H) e FAD/(FAD + NAD(P)H), foram propostas 6,7,8,9. A quantificação dessas proporções redox ópticas por meio de imagens MPF fornece informações valiosas sobre a dinâmica metabólica. Por exemplo, a imagem MPF pode distinguir células cancerígenas de células normais com base em seu metabolismo alterado, demonstrando seu potencial para o diagnóstico de câncer 10,11,12. No entanto, a detecção de autofluorescência baseada em MPF tem limitações. Outros fluoróforos intrínsecos, como a queratina, podem contribuir para a intensidade da fluorescência, levando a diafonia espectral e interpretação imprecisa do sinal13. Além disso, a razão redox reflete apenas as alterações gerais de oxidação-redução celular e não distingue entre NADH de diferentes fontes (por exemplo, citoplasmáticas ou mitocondriais) ou entre NADH e NAD (P) H, pois ambos exibem picos espectrais semelhantes em 450 nm, resultando em sinais de intensidade combinados14.

A Geração de Segundo Harmônico (SHG), um processo óptico não linear demonstrado pela primeira vez no campo biomédico na década de 1980, tem sido amplamente utilizado para imagens sem marcação de estruturas celulares 15,16. Semelhante ao MPF, o SHG envolve a absorção simultânea de dois fótons da mesma energia de um laser pulsado ultrarrápido. Esses fótons são recombinados para emitir um novo fóton com o dobro da frequência da luz incidente, resultando na detecção do sinal do segundo harmônico. Essa interação óptica não linear ocorre exclusivamente em materiais não centrossimétricos que exibem uma suscetibilidade de segunda ordem diferente de zero para induzir uma polarização para gerar o sinal de segundo harmônico 17,18. Isso torna o SHG particularmente eficaz para imagens de proteínas filamentosas e estruturas fibrilares, como colágeno, miosina e tubulina, sem a necessidade de corantes de fluorescência exógenos 15,17,19,20. A anormalidade na abundância, rigidez, alinhamento e estrutura da fibrose e do colágeno são prevalentes em muitas condições, como inflamação e câncer, tornando o SHG uma ferramenta promissora para detecção eficiente e não invasiva de certas condições de doença 21,22,23. A aplicação generalizada da imagem SHG em pesquisas oncológicas, incluindo estudos sobre câncer de mama, ovário e pele, destacou seu papel crucial tanto na pesquisa fundamental quanto em possíveis aplicações clínicas 24,25,26,27.

Diferentes moléculas exibem níveis distintos de energia vibracional, que induzem vários graus de espalhamento inelástico quando excitados pela luz incidente - um fenômeno caracterizado pela primeira vez por CV Raman em 192828. Desde então, o efeito Raman tem sido amplamente utilizado em microscopia óptica para a detecção de composições moleculares e teciduais sem marcação exógena. Tanto o Espalhamento Raman Estimulado (SRS) quanto o Espalhamento Raman anti-Stokes coerente (CARS) excitam vibrações moleculares de forma coerente e alavancam a interação não linear da luz para produzir um sinal mais forte em comparação com a Espectroscopia Raman Espontânea convencional. O fenômeno SRS foi relatado pela primeira vez em 196229. Em 2008, esse mecanismo foi integrado à imagem multifotônica tridimensional, permitindo a detecção seletiva de produtos químicos com base nas mudanças de intensidade nos feixes Pump e Stokes devido a transições vibracionais moleculares30. Este método minimiza a interferência de fundo não ressonante, gerando um sinal de intensidade limpa que supera o do CARS. A imagem SRS se destaca por fornecer imagens multiplexadas e hiperespectrais, permitindo a detecção simultânea de múltiplas ligações químicas e permitindo a visualização de alta resolução da composição molecular em amostras com profundidade de penetração considerável. Embora seja uma técnica relativamente nova, a imagem SRS provou ser eficaz tanto no diagnóstico clínico quanto na pesquisa metabólica, in vivo e in vitro 30,31,32,33,34,35,36. Por exemplo, a SRS pode diferenciar tecidos infiltrados por tumores cerebrais do córtex e da substância branca, quantificando a proporção lipídio-proteína, permitindo o delineamento das margens tumorais de maneira não invasiva e sem rótulos37,38. Além disso, as alterações metabólicas, muitas vezes consideradas características de doenças relacionadas ao envelhecimento e ao câncer, podem ser avaliadas quantitativamente usando o SRS obtido pela detecção de ligações carbono-deutério em amostras tratadas com água pesada (D2O), permitindo a medição quantitativa da síntese de proteínas, lipogênese e outros processos metabólicos macromoleculares31 , 33 , 34 , 35 , 36. A capacidade de rastrear metabólitos com alta resolução temporal e espacial posiciona a SRS como uma ferramenta promissora para investigação e diagnóstico de doenças, com potencial para aplicações clínicas mais amplas.

A imagem multimodal surgiu como uma abordagem poderosa na pesquisa biomédica, integrando duas ou mais modalidades de imagem para obter uma compreensão mais abrangente de sistemas biológicos complexos dentro do mesmo espécime. Em 2018, foi introduzida uma técnica de microscopia de autofluorescência multiharmônica (SLAM) sem marcadores, integrando fluorescência de dois fótons (2PF), fluorescência de três fótons (3PF), SHG e geração de terceiro harmônico (THG)39. Essa abordagem facilita a visualização simultânea de interações celulares, processos dinâmicos e componentes individuais dentro do microambiente tumoral. A microscopia SLAM oferece perturbação mínima e requisitos reduzidos de potência do laser para a amostra, permitindo o perfil de tecido profundo e fornecendo um método mais seguro para monitoramento intravital40. Outra modalidade multimodal, combinando espectroscopia de fluorescência intrínseca, espectroscopia de reflectância difusa e espectroscopia Raman, foi desenvolvida para detecção de câncer in situ durante procedimentos cirúrgicos41. Além disso, um sistema de endoscopia não linear multimodal recentemente projetado, que integra CARS, SHG e fluorescência de dois fótons (TPF), demonstrou a capacidade de obter imagens de amostras biológicas em resolução espacial submicrométrica e subcelular42. A microscopia combinada de 2PF e SRS tem sido utilizada de forma semelhante para imagens in vivo de alta resolução de tecidos, células e organelas 42,43,44,45. Essas técnicas emergentes de imagem multimodal aproveitam os pontos fortes de modalidades individuais, levando a uma melhor resolução, profundidade de penetração e eficiência de aquisição de imagem, mostrando assim um potencial considerável para aplicações clínicas e cirúrgicas.

Essa abordagem multimodal é cada vez mais favorecida em relação à imagem de modalidade única porque fornece uma gama mais ampla de medições enquanto mitiga as limitações associadas a técnicas individuais. Como discutido anteriormente, o MPF mede a fluorescência endógena para refletir as alterações metabólicas, o SHG pode obter imagens de estruturas não centrossimétricas, como colágeno em amostras biológicas, e o SRS detecta predominantemente proteínas e lipídios devido à alta densidade de ligações químicas que geram sinais Raman distintos com base em seus modos vibracionais. Dadas suas propriedades coerentes e o princípio compartilhado de propriedades ópticas não lineares, essas modalidades de imagem podem ser integradas em uma única configuração de microscópio utilizando lasers pulsados ultracurtos, permitindo a aquisição de vários biomarcadores em regiões localizadas para fornecer uma visão mais completa dos processos biológicos44,45. Este artigo descreve um protocolo para implementar uma plataforma de imagem multimodal que integra MPF, SHG e SRS para aplicações de pesquisa biomédica.

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Protocolo

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1. Experimentos de imagem multimodal sem rótulos

NOTA: Este protocolo se concentra no procedimento de configuração e aquisição da imagem multimodal sem marcador.

  1. Configuração do microscópio multimodal (Figura 1A) e calibração do sistema
    1. Aqueça o laser e aguarde aproximadamente 15-20 min.
    2. Ligue as unidades de controle e monitores na seguinte sequência: Caixa de controle | Controlador de painel de toque | Adaptador AC para controle remoto a laser principal Adaptador AC para controle remoto sub laser.
    3. Ligue o detector de fotodiodo Si e o amplificador de bloqueio.
    4. Configure os feixes de laser da bomba e o feixe de Stokes. Configure o sistema laser com um feixe de bomba ajustável de 780 nm a 990 nm, largura de pulso de 5 a 6 ps e taxa de repetição de 80 MHz. O feixe de laser Stokes tem um comprimento de onda fixo de 1.031 nm com um pulso de 6 ps e taxa de repetição de 80 MHz . Certifique-se de que a bomba e os feixes Stokes estejam em baixa potência (pelo menos 20 mW) para serem visíveis na placa de alinhamento.
    5. Coloque uma placa de alinhamento no caminho óptico (logo após a caixa de laser) para verificar a sobreposição espacial das bombas e dos feixes de Stokes e ajuste o espelho até que ambos os pontos se sobreponham no centro da placa de alinhamento.
      NOTA: Embora as bombas e os feixes de Stokes estejam aproximadamente sobrepostos, o ajuste fino da sobreposição espacial de dois feixes de laser pode obter o sinal SRS ideal.
    6. Após a sobreposição espacial, ajuste com o PSD (Detector Sensível à Posição) clicando primeiro no software de controle OPO . Use a tecla sextavada para ajustar cuidadosamente o espelho óptico 1 (OM1) e observe a exibição PSD para a mudança de posição XY para apontar para o desvio mínimo do centro. Em seguida, para fazer ajustes mais precisos, use a chave sextavada no espelho óptico 2 (OM2) até que o indicador de posição esteja centralizado no visor PSD.
      NOTA: OM1 e OM2 são dois espelhos no cabeçote OPO para ajustar o alinhamento do laser.
    7. Por fim, centralize o condensador girando os dois parafusos de centralização do condensador para mover a imagem do diafragma da íris para o centro do campo de visão.
      NOTA: O diafragma de íris de campo pode restringir o diâmetro do feixe de luz que entra na objetiva e, assim, excluir a luz estranha, melhorando o contraste da imagem.
  2. Etapas de aquisição de imagens multimodais sem rótulos
    1. Aplique óleo no condensador de óleo de alta abertura numérica (1.4 NA) e monte a lâmina do microscópio no condensador oleado. Por fim, coloque uma gota de água grande na lâmina do microscópio para a objetiva de água 25x. Certifique-se de que o microscópio esteja montado com segurança e imóvel e, em seguida, ajuste o estágio z para ajustar o foco até que a imagem de campo claro da amostra biológica possa ser vista sob a objetiva de água 25x.
    2. Inicie o processo de imagem na sequência correta: MPF, SHG e SRS para evitar o fotobranqueamento, o que afetará a qualidade da imagem e a análise precisa do MPF. Para alternar rapidamente entre MPF e SHG, mude do feixe da bomba para o feixe fixo de Stokes.
      NOTA: Ajustar o laser da bomba de 800 nm (autofluorescência NADH e FAD) a 791.3 nm (CH3 Raman shift) pode levar de 1 a 2 minutos.
    3. Selecione a resolução da imagem (512 x 512 pixels) e o tempo de permanência adequado para cada modalidade. Use 8 μs/pixel para MPF e SHG com quadro médio acima de 3. Use 40 μs/pixel com quadro médio 2 para a modalidade SRS.
      NOTA: O quadro médio significa o número de imagens a serem calculadas antes de salvar.
    4. Para adquirir autofluorescência com MPF, desligue o feixe de laser Stokes e ajuste o laser da bomba para 800 nm para excitar NADH e flavina. Instale o cubo do filtro FVOPT no caminho da luz com 460 ± 10 nm e 515 ± 10 nm para NADH e flavina, respectivamente. A potência na amostra é, portanto, de aproximadamente 15 mW.
    5. Adquira o sinal da fibra de colágeno usando SHG. Desligue o feixe de laser da bomba, use apenas o feixe de laser de combustível e defina a potência para 500 mW. Adquira apenas o canal relacionado ao filtro de 515 nm.
    6. Obtenha a distribuição espacial de proteínas e lipídios usando SRS. Mantenha os dois feixes de laser ligados e ajuste a frequência do feixe de laser para corresponder ao modo vibracional específico de cada molécula.
      NOTA: Normalmente, 791,3 nm é usado para CH3, 797 nm é usado para CH2, 787 nm é para lipídios insaturados e 794,6 é para lipídios saturados. A potência na amostra é, portanto, de aproximadamente 40 mW.
    7. Para adquirir os conjuntos de dados de imagem hiperespectral SRS, abra o software de controle OPO para selecionar varredura, defina a faixa de comprimento de onda de 780 nm a 806,5 nm e escolha um número de pilha de pelo menos 60. Em seguida, capture a pilha de imagens hiperespectrais.
      NOTA: O conjunto de dados resultante contém 60 imagens, cada uma representando a distribuição espacial em um deslocamento Raman específico (de 2.700 cm-1 a 3.150 cm-1). O tempo para aquisição hiperespectral depende do campo de visão (FOV) da imagem e do tempo de varredura, mas será aproximadamente entre 5 min e 8 min para uma imagem 512 x 512. Para imagens maiores, deve-se tomar cuidado para minimizar a duração sob o laser para evitar qualquer fotodano, que pode ocorrer após 2 h (dependendo da espessura da amostra e do tamanho do FOV).
    8. Salve todas as imagens das mesmas regiões de interesse (ROIs) na mesma pasta. O formato da imagem é o arquivo .oir da Olympus.

2. Análise de imagem

  1. Use o software de processamento de imagem para abrir todas as imagens raw salvas para atribuir a cor e adicionar a barra de escala para a exibição da imagem. Use-o também para gerar a máscara binária de imagens de NADH e ácidos graxos de saturação (SFAs, 2.880 cm-1) para análise de razão redox óptica e insaturação lipídica.
    NOTA: Certifique-se de que a intensidade da máscara tenha apenas 0 e 1.
  2. Use o script python caseiro para fazer qualquer análise downstream (o código está disponível em https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    NOTA: Este script foi projetado para processar várias regiões de interesse (ROIs) de amostras de controle e câncer. A função principal do script requer apenas duas entradas: os caminhos de arquivo para as pastas de controle e imagem de câncer.
    1. Itere pelas pastas, combinando imagens com o mesmo nome base (por exemplo, "roi_1_flavin.tif", "roi_1_nadh.tif", "roi1_mask.tif").
    2. Para cada conjunto de imagens correspondentes, deixe o script executar a análise raciométrica e gerar novas imagens raciométricas com base nesses cálculos.
      A razão redox óptica é calculada como flavina / (NADH + flavina).
      A insaturação lipídica é calculada como: USFAs / (SFAs + USFAs) onde USFAs representam ácidos graxos insaturados.
    3. Todos os valores ratiométricos das imagens são então armazenados em um DataFrame do pandas para facilitar a manipulação. Execute ANOVA unidirecional e use matplotlib com styple "ggplot" ou seaborn para fazer o barplot ou boxplot para quantificação.
    4. Use as imagens de 2.930 cm-1 (CH3) e 2.850 cm-1 (CH2) para gerar uma imagem subtraída (CH3 - CH2). Em seguida, misture a imagem CH2 CH3 - CH2 no espaço de cores RGB com uma LUT personalizada que imita a coloração H & E para gerar a imagem histológica digital46.
  3. Após a aquisição de imagens SRS hiperespectrais, empregue o script python construído em casa para fazer o agrupamento k-means para segmentar as imagens com base em semelhanças espectrais (o código está disponível em https://github.com/lingyanshi2020/HSI_Analysis).
    1. Carregue as pilhas de imagens .tiff com o pacote tifffile. Remodele a pilha de imagens hiperespectrais SRS (x, y, espectros) em uma matriz 2D (pixels, espectros).
    2. Use o pacote scikit-learn para implantar o algoritmo k-means nessa matriz 2D, com o número definido de clusters.
    3. Remodele os rótulos de cluster resultantes de volta para as dimensões originais da imagem, criando um mapa de segmentação.
    4. Atribua cores exclusivas a cada cluster, gerando uma imagem de cor falsa que representa diferentes composições bioquímicas dentro do tecido.
    5. Use matplotlib para plotar os espectros de cada aglomerado com valor médio (linha sólida) e desvio padrão (área de sombra)
    6. Siga o protocolo do protocolo SRS de correspondência de referência penalizada (PRM-SRS) usando MATLAB para criar a detecção de subtipo lipídico livre de marcação espacial com conjuntos de dados de imagem hiperespectral SRS47.
    7. Organize as imagens e salve-as em um formato de .tif de 300 dpi.

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Resultados

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As imagens da Figura 2 são representativas dos resultados obtidos ao seguir o protocolo de aquisição de autofluorescência de FAD e NADH, bem como os quatro canais SRS para proteínas, lipídios totais, lipídios insaturados e lipídios saturados. Aqui também geramos uma imagem pseudo-histológica conforme descrito no protocolo por meio da mistura de cores RGB. A aquisição dos canais MPF e SRS fornece os arquivos de imagem que serão posteriormente utilizados na análise raciométrica. Um exemplo des...

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Discussão

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Este sistema multimodal é uma poderosa plataforma de imagem para capturar uma visualização holística do ambiente molecular de amostras em uma ampla gama de origens biológicas e condições patológicas. A vantagem de alavancar diferentes modalidades sem marcação reside na capacidade de adquirir informações complementares e direcionar analitos específicos que, de outra forma, seriam difíceis ou impossíveis em uma única técnica de imagem sem marcação. Especificamente, as três técnicas de imag...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

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Agradecemos à Dra. Gloria Pryhuber e aos membros de sua equipe HuBMAP por fornecerem fatias de tecido pulmonar humano. Agradecemos ao Dr. Kun Zhang por fornecer tecidos cerebrais humanos. Também agradecemos ao Dr. Gen-Sheng Feng por fornecer amostras de fígado de camundongo. Reconhecemos o apoio dos fundos NIHU54DK134301, NIH R01GM149976, NIH U01AI167892, NIH R01HL170107, NIH 5R01NS111039, NIH R21NS125395, NIH U54CA132378, UCSD Startup, Sloan Research Fellow Award e CZI DAF2023-328667 Award.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cubo de Filtro de 460 nmOlympusOCT-ET 460/50M32
Filtro Passa-BandaKR ElectronicsKR27248 MHz
BNC 50 Ohm TerminatorMini CircuitosSTRM-50
Fonte de alimentação DCTopWard6302D
Dichroic MountThorlabsKM100CL
FIJIImageJ ImageJ
Condensador de óleo de alta NAOlympus6-U130
Filtro passa-curto de alta O.D.Thorlabs950 nm
Microscópio de varredura a laser invertidoOlympusFV1200MPE
Amplificador de bloqueioZurich Instruments
picoEmerald Laser SystemApplied Physics & Eletrônica, Inc.  Feixe de bomba pulsado sincronizado (ajustável 720– 990  comprimento de onda nm, 5– 6  largura de pulso do picosegundo, e 80  Taxa de repetição de MHz) e Stokes (comprimento de onda em 1032  nm, 6  largura de pulso do picosegundo, e 80  Taxa de repetição de MHz)
Detector de Fotodiodo SIem Casa
Compresstome Olympus
VF-300 Precisão
Controlador de Painel de Toque Embutido

Referências

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