Quantificar com precisão a Salmonella em aves em níveis baixos é um desafio industrial e regulatório atual. Este protocolo descreve um ensaio MPN que permite a quantificação de Salmonella em produtos avícolas crus e prontos para cozinhar. Este método é rápido, sensível e se alinha com as diretrizes do FSIS, aumentando a segurança alimentar e apoiando os esforços de saúde pública.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Ensaio de número mais provável modificado para quantificar Salmonella em produtos de frango crus e prontos para cozinhar
Neste artigo
Resumo
Resumo
A salmonela é uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos nos Estados Unidos, principalmente em produtos avícolas. Os métodos tradicionais de detecção de Salmonella se concentram na prevalência e não na quantificação, o que limita sua utilidade na avaliação dos níveis e riscos de contaminação. Este estudo apresenta um novo ensaio de número mais provável (MPN) projetado para quantificar Salmonella em produtos avícolas prontos para cozinhar, como frango cordon bleu. O método envolve lavar a amostra de aves, concentrar o enxágue por centrifugação e diluí-lo em série em um bloco de 48 poços. O ensaio MPN é integrado ao método de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) para fornecer uma quantificação sensível, precisa e rápida da contaminação por Salmonella dentro do mesmo período de tempo que os protocolos existentes do Serviço de Inspeção e Segurança Alimentar (FSIS). Os resultados mostram uma forte correlação linear entre as medidas de MPN-LAMP e os níveis teóricos de inoculação (R² = 0,933). No entanto, a variabilidade em concentrações mais baixas destaca os desafios na detecção precisa de Salmonella nesses níveis, com o limite inferior prático de detecção estimado em aproximadamente 300 UFC / g. Refinamentos potenciais para melhorar a aplicabilidade do protocolo incluem aumentar a quantidade amostrada para melhorar ainda mais o limite de detecção, otimizar formulações de meios de enriquecimento e expandir a detecção molecular para atingir vários sorovares de Salmonella . No geral, este estudo apresenta uma ferramenta prática para a indústria alimentícia, permitindo a quantificação confiável da contaminação por Salmonella em produtos avícolas, contribuindo para melhorar a segurança alimentar e a saúde pública.
Introdução
Como uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos, hospitalização e morte nos EUA, a Salmonella tem um impacto significativo na saúde pública e na economia. A carga econômica estimada do patógeno somente em 2013 foi de US $ 3,67 bilhões1. Embora as recentes iniciativas regulatórias visem reduzir a salmonelose em 25% até 20302, as lacunas nas estratégias atuais de detecção e mitigação permanecem evidentes, particularmente no alinhamento da vigilância da planta de processamento com os resultados de saúde pública3 .
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
NOTA: Todo o trabalho associado a este protocolo deve ser conduzido em um laboratório de Nível de Biossegurança 2 (BSL-2). Quando apropriado, este protocolo deve ser conduzido dentro de um gabinete de segurança biológica (BSC) para manter as condições assépticas e minimizar o risco de contaminação da amostra ou exposição do operador a patógenos microbianos. Ao transferir amostras para fora do BSC, use recipientes lacrados para manter a integridade da amostra e evitar derramamento em caso de quedas acidentais. De preferência, componentes descartáveis devem ser usados durante todo o procedimento para mitigar a possibilidade de contamina....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Carne irradiada
Na análise de regressão, uma inclinação de 1 indica que para cada aumento de unidade na variável independente (eixo x), a variável dependente (eixo y) aumenta exatamente 1 unidade. Isso sugere uma relação proporcional entre as duas variáveis, o que significa que a mudança na variável dependente reflete a mudança na variável independente. Uma interceptação de 0 significa que quando a variável independente é 0, a variável dependente também é 0. Isso sugere que não há deslocamento fixo ou.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Significado do protocolo
A salmonela continua sendo uma grande preocupação na segurança alimentar, particularmente em produtos avícolas, que são frequentemente implicados em surtos de doenças transmitidas por alimentos13,14. Como uma das principais causas de doenças bacterianas transmitidas por alimentos nos Estados Unidos, métodos confiáveis para detectar Salmonella em produtos avícolas fre.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Todos os autores declaram que não há conflito de interesses.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi apoiada pelo Departamento de Agricultura dos EUA, Serviço de Pesquisa Agrícola (USDA-ARS), Programa Nacional 108, Sistema de Informação de Pesquisa Atual números 8072-42000-093-000-D e 8072-42000-094-000-D. A menção de nomes comerciais ou produtos comerciais neste artigo é exclusivamente para fins de fornecer informações específicas e não implica recomendação ou endosso do Departamento de Agricultura dos EUA. O USDA é um provedor e empregador de oportunidades iguais.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Bloco de 48 poços profundos 4.6ml | Fisher Scientific International, Inc | NC1964628 | |
| Agar - Agente Solidificante (Difco) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 281230 | |
| Balança Analítica | Equipamento Mettler Toledo | JL602-G/L | |
| Balança Analítica | Mettler Toledo | AB54-S | Equipment |
| Autoclave - Amsco Lab250, Esterilizador a Vapor de Laboratório | Steris plc | LV-250 | Equipment |
| Gabinete de Segurança Biológica, Tipo A2, Purificador Logic+ | Labconco Corporation | 302411101 | Equipment |
| Caldo de Infusão de Cérebro e Coração (BHI) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 237500 | |
| Água Peptonada Tamponada | Bio-Rad Laboratories Inc. | Espalhador de | |
| Células 3564684 - Centrífuga em forma de L | VWR | 76208-438 | |
| Microcentrífuga 5424 | Eppendorf | 5424 | |
| Equipamento Centrífuga, Avanti J-25 | Beckman Coulter, Inc. | ||
| Equipamento de Extração de DNA - Reagente de Preparação de Amostras PreMan Ultra | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Frango Moído | Varejistas | ||
| IAC forward primer: 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3'Integrated | DNA Technologies | ||
| Sonda IAC: 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGC CACCA-3' rotulado com 5' TAMRA/3' BHQ-2 | Biosearch Technologies | ||
| IAC reverse primer: 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA-3'Integrated | DNA Technologies | ||
| Incubadora - Inova 4230 agitador de incubadora | New Brunswick Scientific | 4230 | Equipment |
| Alça de Inoculação - Combi Loop 10µ L e 1µ L | Fisher Scientific International, Inc | 22-363-602 | |
| invA primer direto: 5'-GTTGAGGATGTTATTCGCAAAG G-3'Integrated | DNA Technologies | ||
| sonda invA: 5'-CCGTCAGACCTCTGGCAGTAC CTTCCTC-3' marcado com 5' Cal Fluor Orange 560/3' BHQ-1 Biosearch | Technologies | ||
| invA reverse primer: 5'-GGAGGCTTCCGGGTCAAG-3'Integrated | DNA Technologies | ||
| Tratamento de Irradiação | Texas A& M Agrilife Research National Center for Electron Beam | Research Service | |
| Luria Bertani (LB) Broth | Becton, Dickinson and Company (BD) | 244620 | |
| Pipeta manual Pipet-Lite LTS Pipeta L-1000XLS+ | Mettler Toledo | 17014382 | Equipment |
| Pipeta manual Pipet-Lite LTS Pipeta L-100XLS+ | Mettler Toledo | 17014384 | Equipment |
| Pipeta manual Pipet-Lite LTS Pipeta L-10XLS+ | Mettler Toledo | 17014388 | Equipamento |
| Pipeta manual Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+ | Mettler Toledo | 17014391 | Equipamento |
| Pipeta manual Pipet-Lite LTS Pipeta L-20XLS+ | Mettler Toledo | 17014392 | Equipamento |
| Pipeta manual Pipet-Lite Multi Pipeta L8-200XLS+ | Mettler Toledo | 17013805 | |
| Pipeta Manual de Equipamento Pipet-Lite Multi Pipeta L8-20XLS+ | Mettler Toledo | Garrafa de Armazenamento de Mídia 17013803 | |
| Equipamento -PYREX 1L Vidro Quadrado Garrafa, com tampa de rosca GL45 Corning | Inc. | de equipamento | 1396-1L |
| -Garrafa de boca larga redonda PYREX 2L, com tampa de rosca GLS80 | Corning Inc. | Equipamento 1397-2L | |
| Placa de microtitulação, placa de 96 poços, fundo plano, poliestireno, 0,34cm2, estéril, misturador | de Z707902 | MilliporeSigma | |
| - Vortex Genie 2 | Scientific Industries Inc. | SI-0236 | Equipamento |
| Ensaio de Detecção Molecular 2-Salmonella kit | Neogen | MDA2SAL96 | |
| Instrumento de Detecção Molecular | Equipamento Neogen | MDS100 | |
| Controlador de pipeta motorizado, PIPETBOY2 | INTEGRA Biosciences Corp. | 155019 | Equipamento |
| PCR Mastermix 2× Expressão Gênica TaqMan | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Rotador de Placa de Petri - Plataforma Giratória de Inoculação bioWORLD | Fisher Scientific International, Inc | 3489E20 | |
| Equipamento Placas de Petri com Tampa Transparente (100 mm x 15mm) | Fisher Scientific International, Inc | FB0875713 | |
| Pontas de Pipeta GP LTS 1000µ L S 768A/8 | Mettler Toledo | ||
| Ponteiras de Pipeta GP LTS 20µ L 960A/10 | Mettler Toledo | 30389270 | |
| Ponteiras de Pipeta GP LTS 200µ L F 960A/10 | Mettler Toledo | 30389276 | |
| Produtos de frango prontos para cozinhar | Varejistas | ||
| Reservatório de reagente, reservatório estéril de 25 mL usado com pipetadores multicanal | Thermo Fisher Scientific Inc. | 8093-11 | |
| PCR em tempo real - 7500 Sistema de PCR em tempo real | (Applied Biosystems, Foster City, CA) | 2750036476 | Pipetas Sorológicas de |
| Equipamentos, Pipetas Sorológicas Nunc (10 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170356N | |
| Pipetas Sorológicas, Pipetas Sorológicas Nunc (2 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170372N | |
| Pipetas Sorológicas, Pipetas Sorológicas Nunc (25 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 170357N | |
| Pipetas Sorológicas, Pipetas Sorológicas Nunc (50 mL) | Thermo Fisher Scientific Inc. | Espalhador 170376N | |
| - Espalhadores de Células em Forma de L Fisherbrand | Fisher Scientific International, Inc | 14-665-230 | |
| Saco Stomacher, Sacos de Filtro de Misturador Misturador Write-On Write-On Nasco Whirl-Pak | Thermo Fisher Scientific Inc. | 01-812 | |
| Stomacher 80 Biomaster Lab Blender | Termociclador | Seward 30010019 | Equipment |
| (Sistema de PCR GeneAmp 9700) | Applied Biosystems | 535028293 | Equipment |
| Filtração de Água - Elga Veolia Purelab Flex | Sacos Whirlpak Elga LabWater | PF2XXXXM1-US | Equipment |
| 1.63L | VWR | 11216-777 |
Referências
- Batz, M., Hoffmann, S., Morris, J. G. Disease-outcome trees, eq-5d scores, and estimated annual losses of quality-adjusted life years (qalys) for 14 foodborne pathogens in the united states. Foodborne Pathogens and Disease. 11 (5), 395-402 (2014).
- The Grand Challenge: Salmonella. , United States Department of Agriculture.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
