Artigo de método

Prevendo e validando a regulação da lesão podocitária e o tratamento da doença renal diabética por Yinhuo Tang

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DOI:

10.3791/67939

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20 de junho de 2025

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1Nephropathy Department, the Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2College of Integrated Chinese and Western Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Usando farmacologia de rede e validação experimental, este protocolo revela o mecanismo de ação do Yinhuo Tang (YHT) no tratamento da doença renal diabética (DKD) e como o YHT reduz o dano podocitário em camundongos DKD através da inibição da via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB.

Resumo

A doença renal diabética (DRD) é uma doença renal crônica caracterizada por proteinúria maciça e diminuição da taxa de filtração glomerular. A principal característica patológica da DRD é a microangiopatia renal, e ~ 40% dos pacientes diabéticos desenvolverão DRD. As proteínas associadas a podócitos CD2AP e WT-1 desempenham um papel crucial na manutenção da função normal dos podócitos e na integridade da barreira de filtração glomerular. Quando a estrutura ou função do podócito é interrompida - devido à inflamação, estresse oxidativo ou outros insultos patológicos - o diafragma cortado e o citoesqueleto de actina são danificados, levando ao aumento da permeabilidade da barreira de filtração glomerular e resultando em proteinúria. Yinhuo Tang (YHT) é uma prescrição da medicina tradicional chinesa que tem a função de reduzir a proteinúria e retardar a deterioração da função renal; no entanto, o mecanismo do YHT no tratamento da doença renal diabética não é claro. Neste artigo, com base em farmacologia de rede e experimentos com animais, examinamos a glicose no sangue, função hepática, função renal, lipídios no sangue, patologia renal, níveis de expressão das proteínas marcadoras de podócitos CD2AP e WT-1, bem como a via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB em camundongos db/db após a administração de YHT por 8 semanas. Nossos resultados mostram que o YHT reduz os níveis de expressão de fatores inflamatórios inibindo a via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB, reduzindo assim o dano podocitário para desempenhar um papel no retardo da progressão da DRD.

Introdução

A doença renal diabética (DRD) é uma complicação prevalente e grave do diabetes e continua sendo a principal causa de insuficiência renal terminal em todo o mundo1. A doença evolui por meio de uma série de processos patológicos complexos, como aumento glomerular, expansão mesangial, fibrose túbulo-intersticial e acúmulo excessivo de componentes da matriz extracelular 2,3. Apesar das melhorias no controle do diabetes, as terapias atuais visam principalmente controlar os níveis de glicose no sangue e a pressão arterial, o que apenas retarda a progressão da doença renal diabética, em vez de reverter suas alterações patológicas subjacentes. Isso ressalta a necessidade premente de opções de tratamento mais abrangentes e eficazes 4,5.

A medicina tradicional chinesa (MTC) tem surgido como uma alternativa terapêutica promissora no tratamento de doenças crônicas como a DRD 6,7,8. A MTC enfatiza uma abordagem de tratamento holística, que pode abordar a natureza complexa e multialvo da DRD. Entre várias formulações de MTC, Yinhuo Tang (YHT) demonstrou possuir múltiplas funções fisiológicas, como nutrir yin (para complementar o volume sanguíneo), tonificar o rim (para melhorar a função renal), limpar o calor (suprimir a inflamação) e subjugar o yang (para baixar a pressão arterial) 9 , 10 , 11 . No entanto, ainda falta uma compreensão abrangente dos mecanismos pelos quais o YHT alivia a DRD.

A proteína CD2AP relacionada ao podócito é uma proteína-chave no podócito, crucial para manter a integridade da barreira de filtração, enquanto o WT-1 desempenha um papel crítico no desenvolvimento renal e na fibrose 12,13,14,15,16. Portanto, a função normal dessas duas proteínas é vital para a função normal de filtração glomerular. A literatura existente sugere que esses alvos estão envolvidos na progressão da DRD, e levantamos a hipótese de que os componentes ativos do YHT podem interagir com esses alvos para exercer efeitos terapêuticos. Este estudo visa confirmar essas interações e fornecer insights mais profundos sobre como o YHT modula as vias da doença da DRD.

Neste estudo, empregamos uma combinação de farmacologia de rede e experimentos com animais para explorar os mecanismos terapêuticos do YHT na DRD. A farmacologia de rede, que integra ferramentas de bioinformática para analisar as interações complexas entre compostos ativos e alvos biológicos, nos permite explorar a natureza multialvo e multicaminho da ação do YHT17 , 18 , 19 . Os métodos tradicionais de descoberta de medicamentos geralmente enfatizam intervenções de alvo único. Em contraste, a farmacologia de rede serve como uma ferramenta preditiva que ajuda a identificar possíveis vias e alvos moleculares, oferecendo insights preliminares sobre os possíveis mecanismos de ação de terapias complexas. Embora não substitua as rigorosas etapas experimentais e regulatórias necessárias para o desenvolvimento de medicamentos, a farmacologia em rede pode orientar a geração de hipóteses e agilizar a pesquisa em estágio inicial20.

Em última análise, este estudo visa preencher a lacuna entre a medicina tradicional e a moderna, fornecendo evidências científicas para a integração da MTC no tratamento da DRD. Os resultados desta pesquisa podem ajudar a desenvolver estratégias de tratamento mais eficazes e seguras para a doença renal diabética, oferecendo uma alternativa ao tratamento padrão que muitas vezes é limitado pelos efeitos colaterais. Ao elucidar os mecanismos moleculares do YHT e validar seu potencial terapêutico, esperamos demonstrar a ampla aplicabilidade da MTC no tratamento da DRD.

Protocolo

Um total de trinta camundongos machos diabéticos tipo II espontâneos de 6 semanas de idade (C57BL / Ksj db / db) e seis camundongos controle não diabéticos machos (db / m) com o mesmo histórico genético foram selecionados para este estudo. Os camundongos foram alojados por 2 semanas em um ambiente estéril de grau FPS no Centro de Experimentos Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun (número de licença: SYXK (JI) 2023-0014). Durante este período, eles receberam dieta de manutenção regular e água estéril. A glicemia de jejum foi medida nos camundongos db/db no início e no final do período de 2 semanas, e apenas aqueles com resultados superiores a 11,1 mmol/L em ambos os testes foram incluídos no experimento. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun (número de identificação: 2024147).

1. Preparação de medicamentos

  1. Preparação do YHT (Tabela 1)
    1. Selecione Rehmannia glutinosa (30 g), Ophiopogon japonicus (10 g), Morindae Officinalis Radix (10 g), Poria cocos (15 g) e Schisandra chinensis (6 g) e enxágue as ervas com água para remover impurezas e poeira da superfície. Em seguida, misture 71 g das ervas cruas com 710 mL de água destilada e deixe de molho em vasos de cerâmica por 60 min
    2. Depois de ferver a 100 °C, abaixe a temperatura da decocção para 80 °C por 60 min e, em seguida, filtre os resíduos através de duas camadas de gaze médica. Conservar o líquido no frigorífico a 4 °C.
    3. Adicione 710 mL de água destilada aos resíduos acima e repita a imersão da etapa 1.1.1 e da etapa 1.1.2 uma vez; Conservar o líquido no frigorífico a 4 °C.
    4. Misture os dois líquidos medicinais acima das etapas 1.1.2 e 1.1.3 e coloque-os na bandeja de material do liofilizador a vácuo. Ligue a bomba de vácuo para remover o ar da câmara de liofilização, ajuste a temperatura para -40 °C e mantenha-a por 6 h para congelar a água na solução do medicamento em um estado sólido. Em seguida, ajuste a temperatura para -20 °C por 36 h para sublimar a água como cristais de gelo em gás. Finalmente, ajuste a temperatura para 40 °C, mantenha-a por 24 h para remover a umidade restante da solução do medicamento, desligue o aquecimento e a bomba de vácuo e remova o pó liofilizado (pó YHT).
    5. Pesar 0,4615 g, 0,923 g e 1,846 g de YHT liofilizado em pó, suspender em 1 mL de soro fisiológico e fazer a suspensão de YHT com as concentrações de 0,4615 g/mL, 0,923 g/mL e 1,846 g/mL, respectivamente.
  2. Preparação de Valsartan
    1. Adicione valsartan (10,29 mg) em 50 mL de PEG300 e agite bem para dissolver completamente.
    2. Adicione 50 mL de solução salina à solução da etapa 1.2.1 e agite bem para homogeneizar e obter uma solução de valsartan com concentração de 10,29 mg / mL.

2. Tratamentos medicamentosos

NOTA: O experimento foi dividido em seis grupos: o grupo controle normal (CON), o grupo modelo (MOD), o grupo controle positivo com valsartana (POS), o grupo de baixa dose do YHT (YH-L), o grupo de dose média do YHT (YH-M) e o grupo de alta dose do YHT (YH-H). Humanos adultos precisam de 71 g YHT por dia. De acordo com a fórmula de conversão da dose experimental de camundongos e humanos, a dose diária para camundongos foi de ~ 9,23 g / kg:

Dose experimental equivalente para o ratinho (g/kg) = dose humana (g)/peso corporal (70 kg) × 9,1

  1. Segure as costas dos camundongos firmemente com a mão não dominante para que suas cabeças, pescoços e corpos fiquem em linha reta (para evitar lutas) e posicione a agulha de gavagem de 1 mL adequadamente em um ângulo semelhante à curvatura fisiológica do esôfago dos camundongos. Empurre a agulha de gavagem pelo canto da boca dos camundongos, pressione-a na língua, pressione-a contra o palato e empurre-a suavemente para dentro do estômago.
  2. Empurre lentamente o medicamento usando o dedo indicador da mão dominante e retire a agulha verticalmente para completar a operação de gavagem.
    NOTA: A dose do medicamento foi de 10 mL / kg por um total de 4 semanas.
    1. Administre 10 ml∙kg-1∙dia-1 de solução salina por gavagem em camundongos CON e MOD.
    2. Administre 10,29 mg∙kg-1∙dia-1 suspensão de valsartan por gavagem aos camundongos do grupo POS.
    3. Administrar as seguintes doses de YHT por gavagem a esses grupos: 4,615 g∙kg-1∙dia-1 ao grupo YH-L; 9,23 g∙kg-1∙dia-1 para o grupo YH-M; 18,46 g∙kg-1∙dia-1 para o grupo YH-H.

3. Avaliação da eficácia do YHT

  1. Detecção de índices bioquímicos de sangue e urina
    1. Após 8 semanas de administração contínua do medicamento, colete urina de 24 horas de camundongos usando uma gaiola metabólica, centrifugue a urina coletada a 7.992 × g por 10 minutos, remova o sobrenadante e meça o nível de proteína na urina usando o kit de teste de proteína urinária.
    2. Segure a parte de trás do mouse com a mão não dominante para fixar o mouse e use o dedo mindinho e o dedo anelar da mesma mão não dominante para fixar a cauda do mouse. Esterilize a ponta da cauda do mouse com bolas de algodão de vapor de iodo. Com a mão dominante, segure uma agulha de coleta de sangue para perfurar rapidamente a ponta da cauda do camundongo, aperte da raiz da cauda do camundongo até a ponta da cauda e jogue o sangue no papel de teste de glicose no sangue.
    3. Usando a mão não dominante, segure a cauda do camundongo, enquanto segura a área escapular com o polegar e o indicador, garantindo que o abdômen do camundongo esteja voltado para cima. Com a mão dominante, segure uma seringa de 1 mL cheia de fenobarbital sódico. Insira a agulha (3-5 mm de profundidade) na cavidade abdominal em um ângulo de 30-45°, visando a região entre o umbigo e os membros posteriores, com a agulha direcionada para a cabeça. Retire lentamente o êmbolo da seringa para verificar se há sangue; se o sangue for aspirado, reposicione a agulha de acordo..
    4. Injete lentamente a solução de pentobarbital sódico para garantir uma administração uniforme e retire a seringa após a conclusão da injeção. Aguarde 10 minutos e, em seguida, com uma pinça na mão dominante, aperte suavemente os dedos dos pés dos membros posteriores do camundongo para verificar se há uma resposta. Se ainda for observada uma resposta, administre uma pequena dose adicional (10 mg / kg) conforme necessário.
      NOTA: Supondo que um camundongo pese 60 g e a solução de fenobarbital seja 1% p / v, 0,06 mL é a dose adicional a ser administrada em caso de qualquer resposta.
    5. Use uma tesoura para aparar os bigodes e cabelos ao redor dos olhos dos ratos, usando a mão não dominante para pressionar a pele ao redor dos olhos dos quais os globos oculares devem ser removidos para que os globos oculares se projetem. Esterilize a pele ao redor dos globos oculares com etanol, use uma pinça para retirar rapidamente os globos oculares para que o sangue goteje nos tubos de microcentrífuga (1,5-2 mL), incube os tubos em temperatura ambiente por 10 min, centrifugue os tubos por 10 min a 7.992 × g e extraia a solução sobrenadante.
    6. Meça os níveis de expressão de creatinina sérica (Scr), nitrogênio ureico no sangue (BUN), albumina (ALB), alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), triglicerídeos (TG) e colesterol total (TC) no soro de acordo com as instruções do kit.
  2. Separação dos tecidos renais
    1. Após a coleta de sangue, fixe os camundongos na placa cirúrgica em decúbito dorsal, corte o cabelo da região torácica anterior dos camundongos, esterilize a região torácica anterior com etanol, corte a pele abdominal com uma tesoura e afaste os intestinos delgado e grosso para expor os rins.
    2. Remova o tecido renal do camundongo, use uma pinça hemostática para separar o periósteo sem rodeios e coloque o rim esquerdo em um freezer a -80 ° C para armazenamento e o rim direito em um tubo de 20 mL contendo solução de paraformaldeído a 4% para fixar o rim.
    3. Remova os rins direitos do formaldeído após 24 h, enxágue brevemente com água destilada por 5min, desidrate usando um gradiente de etanol anidro (100% → 95% → 85% → 75%, 5 min cada), transparenteize usando gradiente de xileno (2 x 10 min), embebido em cera de parafina e deixe os blocos de cera solidificarem à temperatura ambiente21. Em seguida, coloque-o no freezer a -20 °C durante a noite.
    4. Remova o bloco de cera, corte-o com uma espessura de 3 μm, coloque-o na água para desdobrar, pesque-o com uma lâmina e coloque-o em um forno de temperatura constante a 40 ° C para assar por 30 min e depois guarde-o para análise subsequente
  3. Análise histopatológica renal
    1. Remova o rim direito, execute a desparafinação de gradiente de xileno e a desidratação com etanol anidro como acima (etapa 3.2.3) e lave com água destilada.
    2. Realize a coloração de acordo com as instruções da coloração de hematoxilina e eosina (H & E), coloração de ácido periódico de Schiff (PAS) e kits de coloração de Masson.
    3. Execute a desidratação do etanol anidro gradiente e a transparência do xileno novamente como na etapa 3.2.3.
    4. Após a secagem à temperatura ambiente, monte as secções de tecido nas lâminas com uma lamínula utilizando goma neutra como meio de montagem. Observe as lâminas e visualize-as sob um microscópio de luz com ampliação de 400x.
  4. Análise imuno-histoquímica do tecido renal
    1. Remova o rim direito, desparafine e desidrate as seções conforme descrito na etapa 3.2.3, coloque-as em solução tampão de citrato de sódio 10 mM (pH 6,0) e aqueça (125 ° C, 103 kPa) por 5 min para reparo do antígeno. Após 10 min, remova as seções, deixe esfriar até a temperatura ambiente e lave-as 3 x 5 min em 1x PBS.
    2. Coloque as seções em solução de peróxido de hidrogênio a 3% por 10 min para bloquear a peroxidase endógena e lave 3 x 5 min em PBS.
    3. Adicione 10% de soro de cabra gota a gota às seções, certificando-se de que o soro de cabra cubra uniformemente toda a seção. Coloque as seções em uma caixa úmida, incube a 37 ° C por 30 min e lave 3 x 5 min com PBS.
    4. Adicione os anticorpos primários COI-I (1:200), α-SMA (1:200), WT-1 (1:200), CD2AP (1:200) gota a gota (ver Tabela de Materiais) e incube em uma caixa úmida a 4 ° C na geladeira durante a noite.
    5. Remova a seção, lave com PBS 3 x 5 min, adicione anticorpo secundário (1: 3.000) gota a gota, incube a 37 ° C por 60 min e lave com PBS por 3 x 5 min.
    6. Adicione a solução de revelação de cor 3,3'-diaminobenzidina (DAB) por 10 min, lave a solução de revelação de cor com água destilada, incube com 100 μL de hematoxilina por 5 min em temperatura ambiente e enxágue com água destilada por 5 min.
    7. Desidrate, transparente,
  5. Análise quantitativa do ensaio de reação em cadeia da polimerase em tempo real (qRT-PCR)
    1. Pegue ~ 100 mg de tecido renal congelado em um tubo homogeneizador de 10 mL, triture-o com um pilão até que não haja massa de tecido óbvia e, em seguida, adicione 1 mL de reagente de extração de RNA para homogeneização.
    2. Adicionar 250 μL de clorofórmio, agitar num misturador de vórtice durante 10 s, incubar em gelo durante 5 min, centrifugar a 15,984 × g durante 10 min a 4 °C e pipetar a fase aquosa superior para um novo tubo.
    3. Adicione 500 μL de isopropanol à fase aquosa, misture bem usando um misturador de vórtice por 10 s e incube a mistura no gelo por 5 min. Em seguida, centrifugue a 15.984 × g por 10 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante e lave o pellet de RNA com 1 mL de etanol a 75%. Após breve vórtice, centrifugar novamente a 15.984 × g durante 10 min. Descarte o etanol e deixe o pellet de RNA secar ao ar em temperatura ambiente.
    4. Adicionar 30 μL de água de dietilpirocarbonato para dissolver o ARN e medir a absorvância da solução de ARN a 260 nm e 280 nm utilizando um espectrofotómetro para calcular a concentração de ARN.
      NOTA: A pureza do RNA é avaliada pela proporção A260 / A280 . Uma proporção ideal de A260 / A280 deve estar entre 1,8 e 2,0, indicando boa pureza de RNA. Se a proporção estiver abaixo de 1,8, pode sugerir a presença de contaminação por proteína ou fenol, e é necessária uma purificação adicional, como a realização de uma extração adicional de fenol-clorofórmio ou precipitação de etanol para remover contaminantes.
    5. Misture 3 μg de RNA total, 4 μL de 4 gDNA Wiper Mix e ddH2O livre de RNase até um volume final de 16 μL, centrifugue a 1.250 × g por 10 s e incube a 42 ° C por 2 min. Adicionar 4 μL de transcriptase reversa 5x a 16 μL da solução acima, centrifugar a 1.250 × g por 10 s. Execute o programa de transcrição reversa a 50 ° C (15 min) → 85 ° C (5 s) → 4 ° C (10 min). Armazenar o cDNA sintetizado a -20 °C.
    6. Remova a solução de cDNA do freezer e execute a pré-desnaturação a 90 ° C (10 min), seguida por 40 ciclos de 94 ° C (30 s) → 60 ° C (30 s) → 72 ° C (24 s) e, finalmente, lise na ordem de 95 ° C (15 s) → 60 ° C (60 s) → 95 ° C (350 s, 60 ° C aumente gradualmente para 95 ° C a uma taxa de 0.1 ° C / s).
    7. Calcular a expressão relativa de WT-1, CD2AP, PI3K, AKT, NF-κB e IL-1β utilizando o método 2-ΔΔCt com base no valor de Ct de cada amostra com Gapdh como referência interna (ΔΔCt = valor de Ct do gene alvo - valor de Ct do gene de referência interno) (ver quadro 2).
  6. Análise do ensaio de Western blot (WB)
    1. Tome ~ 100 mg de tecido renal congelado em um tubo homogeneizador de 10 mL, seguido por 500 μL de solução de lise (inibidor de protease: inibidor de fosfatase: RIPA = 1: 1: 100) e triture-o com um pilão o suficiente até que não haja massa de tecido óbvia.
    2. Incubar o tubo em gelo durante 30 min, centrifugar a 15,984 × g durante 10 min e aspirar o sobrenadante.
    3. Determine a concentração de proteína de cada amostra usando o ensaio BCA. Com base nas concentrações medidas, pipete quantidades iguais de proteína total (por exemplo, 30 μg) de cada grupo em novos tubos e ajuste o volume final usando PBS para garantir a consistência. Em seguida, adicione 5x tampão de carga de proteína, ferva a 100 ° C por 10 min e, em seguida, remova e deixe esfriar até a temperatura ambiente.
    4. Use eletroforese em gel SDS-PAGE a 12,5% para separar as proteínas. Primeiro, use 80 V para fazer a amostra passar lentamente pelo gel de concentração, depois ajuste a tensão para 120 V até que a amostra escorra para o fundo do gel de separação e desligue a unidade.
    5. Mergulhe o papel de filtro no tampão de transferência da membrana, use uma pinça para segurar um canto da membrana de PVDF e mergulhe-o em metanol para ativá-lo. Remova o gel, use uma placa de plástico para cortar o gel concentrado e o fundo do gel de separação e, em seguida, de acordo com a estrutura sanduíche do papel de filtro / gel / membrana de PVDF / papel de filtro para configurar o dispositivo de transferência de membrana (gel como pólo negativo, a membrana de PVDF como pólo positivo), coloque a configuração em um tanque de transferência de membrana preenchido com tampão de transferência pré-resfriado, cercá-lo com cubos de gelo para manter uma temperatura baixa e realizar a transferência a uma corrente constante de 200 mA.
      NOTA: Decida o tempo de transferência de acordo com o peso molecular da proteína (quanto maior o peso molecular, maior o tempo de transferência).
    6. Coloque a membrana de PVDF no tampão de bloqueio, agite o tampão de bloqueio por 90 min em temperatura ambiente e lave com TBST (50 mL de 20x TBS e 0.5 mL de Tween-20 por L de TBST) por 3 x 5 min.
    7. Usando anticorpo primário diluente de anticorpo primário: WT-1 (1:1.000), CD2AP (1:1.000), P-PI3K (1:1.000), P-AKT (1:1.000), P-NF-κB (1:1.000) e IL-1β (1:1.000), adicione o anticorpo primário na membrana de PVDF e incube em uma caixa úmida em uma geladeira a 4 °C durante a noite (consulte a Tabela de Materiais).
    8. Remova a membrana de PVDF do refrigerador a 4 ° C, lave com TBST por 3 x 5 min, usando anticorpo secundário diluente diluente de anticorpo secundário (1: 10000), adicione incubação de anticorpo secundário em temperatura ambiente por 60 min, lave com TBST por 3 x 5 min, coloque a membrana de PVDF no gerador de imagens de quimioluminescência e adicione uniformemente o líquido luminescente ECL gota a gota (A: B = 1:1).

4. Análise farmacológica de rede de YHT para tratamento de DKD

  1. Triagem de ingredientes ativos e alvos de YHT
    1. Determine os ingredientes ativos de Radix Rehmanniae Praeparata, Morindae Officinalis Radix, Poria e Schisandra Chinensis usando o banco de dados TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) e de Maitake do banco de dados BATMAN-TCM (http://bionet.ncpsb.org/batmantcm). Defina a biodisponibilidade oral (OB) ≥ 30% e a semelhança com o medicamento (DL) ≥ 0,18 como critérios de triagem para identificar os ingredientes ativos.
    2. Pesquise no banco de dados TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php) os alvos de ação dos ingredientes ativos dos TCMs acima.
    3. Retire a ênfase dos alvos dos ingredientes ativos acima e integre-os em uma lista para análise posterior. Padronize os nomes dos alvos usando o banco de dados de proteínas Uniprot (https://www.uniprot.org).
  2. Construção da rede alvo dos ingredientes ativos do YHT
    1. Importe os ingredientes ativos e seus alvos correspondentes para o theoftware: Construa a rede "ingrediente ativo-alvo" selecionando Arquivo | Importação | Rede e carregamento dos dados relevantes.
    2. Execute a análise de topologia de rede navegando até Ferramentas | Análise de rede | Analise a rede para visualizar as relações entre medicamentos, ingredientes ativos, alvos e doenças. Na visualização de rede, os nós representam os ingredientes ativos e as bordas representam as interações entre os ingredientes ativos e os alvos.
  3. Rastreio de alvos relacionados com a DKD
    1. Usando Diabetic Kidney Disease como termo de pesquisa e definindo a espécie como Humana, rastreie os alvos relacionados à DKD nos seguintes bancos de dados: banco de dados GeneCards (https://www.genecards.org); Banco de dados OMIM (http://www.omim.org); Base de dados TTD (https://www.ttd.cn); Banco de dados do DrugBank (http://www.drugbank.ca); Banco de dados DisGeNET (http://www.disgenet.org).
    2. Depois de obter os resultados dos cinco bancos de dados, mescle-os em uma planilha e remova as duplicatas usando a função Remover duplicatas no menu Dados , garantindo que apenas os nomes exclusivos dos destinos relacionados ao DKD sejam mantidos.
  4. Construção de PPI (interação proteína-proteína) e triagem de alvos principais
    1. Use o software de planilha para identificar os alvos de interseção de YHT e DKD inserindo a lista de alvos YHT em uma coluna e a lista de alvos DKD em outra. Aplique a formatação condicional para realçar entradas comuns em ambas as colunas, identificando assim os destinos de interseção.
    2. Abra o site do banco de dados de cadeia de caracteres (https://cn.string-db.org/), selecione Entrada | Colar/Carregar para importar os dados em lote e defina o limite Grau ≥ 1 para filtrar destinos livres (destinos sem interações) na rede.
    3. Selecione Arquivo | Importação | Rede e importe os alvos de interseção filtrados para o software para criar a visualização final.
    4. Navegue até Análise de rede | Analise a rede e filtre os principais destinos do YHT-DKD com base no valor do grau.
  5. Análise funcional de ontologia gênica (GO) e análise de enriquecimento da via da enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (KEGG)
    1. Abra a plataforma Metascape visitando http://metascape.org/gp/index.html, selecione Iniciar Análise para começar, cole a lista de alvos para YHT e DKD na caixa de entrada na seção Análise Personalizada , defina a espécie como Homo sapiens no menu suspenso, escolha Análise Personalizada e defina o limite do valor P para <0,01 e clique em Enviar para executar a análise.
    2. Depois que os resultados forem retornados do Metascape, vá para http://www.bioinformatics.com.cn/, selecione Ferramentas | termo GO de enriquecimento, cole os termos GO dos resultados e clique em Enviar para gerar gráficos de bolhas. Visualize os 10 principais termos GO classificando-os com base no valor P.
    3. Classifique os caminhos KEGG com base no valor P dos resultados da análise do Metascape. Vá para o mesmo site de Microbiologia (http://www.bioinformatics.com.cn/), selecione ir enriquecimento da via kegg, cole as 10 principais vias KEGG selecionadas e clique em Enviar para visualizar os diagramas de bolhas KEGG.

5. Análise estatística

  1. Se os dados seguirem uma distribuição normal e as variâncias forem homogêneas, use ANOVA unidirecional. Se as variâncias não forem homogêneas, use o teste T3 de Dunnett ou um teste t de amostra independente.
  2. Para dados que não seguem uma distribuição normal, use o teste de soma de classificação de métodos não paramétricos.
  3. Considere P < 0,05 estatisticamente significativo.

Resultados

Melhora da glicose no sangue, função hepática e renal e distúrbios do metabolismo lipídico em camundongos com DRD
Após 8 semanas de administração, diferentes doses de YHT reduziram significativamente os níveis de glicose sanguínea aleatória, UTP de 24 h, Scr e BUN, melhoraram a função renal (Figura 1A-D); aumentou o nível de ALB; reduziu os níveis de ALT e AST; função hepática aumentada (Figura 1E-G); reduziu os níveis de CT e TG; e melhorou a regulação do metabolismo lipídico (Figura 1H,I). Os resultados acima indicaram que o YHT teve efeitos protetores sobre a glicose no sangue, função hepática e renal e regulação lipídica.

Melhora da lesão histopatológica renal em camundongos com DRD
Para testar se o YHT poderia melhorar a lesão renal em camundongos DKD, a extensão da lesão patológica nos tecidos renais foi examinada usando coloração H&E, PAS e Masson, bem como IHC. A coloração de H&E e PAS revelou atrofia glomerular, alargamento da região da túnica albugínea, edema e descolamento de células epiteliais tubulares, infiltração de células inflamatórias intersticiais e óbvia deposição de glicogênio glomerular no grupo MOD (Figura 2A,B). A coloração de Masson mostrou um aumento significativo nas fibras colágenas azuis nos rins do grupo MOD em comparação com o grupo CON (Figura 2C,D). A IHQ mostrou que as porcentagens de áreas positivas para COI-I e α-SMA foram significativamente maiores no grupo MOD do que no grupo CON (Figura 2E-G). Em contraste, após o uso de YHT e POS, atrofia glomerular, alargamento da zona amarrada, inchaço e descamação de células epiteliais tubulares, o grau de infiltração de células inflamatórias intersticiais e a deposição de glicogênio glomerular foram significativamente aliviados; a área de fibras colágenas azuis foi significativamente reduzida; e as porcentagens de áreas positivas para COI-I e α-SMA diminuíram significativamente. Os resultados acima indicaram que o YHT pode atenuar a lesão patológica renal e a fibrose renal em camundongos com DRD.

Atenuação da lesão podocitária em camundongos DKD
O dano às células do pé em camundongos DKD foi observado por IHC, PCR e WB. Os resultados da IHQ mostraram que os níveis de expressão das proteínas marcadoras funcionais das células do pé, CD2AP e WT-1, foram significativamente diminuídos no grupo MOD em comparação com o grupo CON, indicando que as células renais do pé foram danificadas. O tratamento com YHT aumentou os níveis de expressão de CD2AP e WT-1 e reduziu os danos às células do pé (Figura 3A-C). Os resultados de PCR e WB mostraram que os níveis relativos de expressão de mRNA e proteína das proteínas marcadoras funcionais das células do pé, CD2AP e WT-1, diminuíram significativamente no grupo MOD em comparação com o grupo CON, e os níveis relativos de expressão de mRNA e proteína de CD2AP e WT-1 aumentaram significativamente após o tratamento com YHT (Figura 3D-H). Os resultados acima indicaram que o YHT pode atenuar a lesão de podócitos em camundongos DKD.

Elucidação dos alvos potenciais e vias de sinalização ligadas aos efeitos do YHT na DKD via farmacologia da rede
Os ingredientes ativos do YHT (291) foram selecionados por meio dos bancos de dados TCMSP e BATMAN-TCM, dos quais 39 ingredientes ativos atenderam aos critérios de OB ≥ 30% e DL ≥ 0,18. Os ingredientes ativos foram pesquisados no banco de dados para identificar seus alvos e, após a fusão e exclusão de valores duplicados, obteve-se um total de 303 alvos (Figura 4A). Depois de mesclar os resultados de cinco bancos de dados, incluindo GeneCards, OMIM, TTD, Drugbank e DisGeNET, e remover valores duplicados, 1.867 alvos relacionados a DKD foram finalmente obtidos. Em seguida, http://www.bioinformatics.com.cn/ foi usado para cruzar os ingredientes ativos YHT rastreados com alvos DKD, resultando em 84 alvos de interseção (Figura 4B). Esses 84 alvos foram importados para o software Cytoscape para desenhar um diagrama de rede PPI, e potenciais alvos-chave para o tratamento YHT da DKD foram identificados, incluindo AKT, IL-1 β, CASP3, APOE e JUN (Figura 4C). A análise de enriquecimento funcional do GO rendeu um total de 1.246 itens, indicando que o YHT pode exercer efeitos terapêuticos sobre a DRD regulando processos biológicos, como resposta a hormônios, e funções moleculares, incluindo atividade de homodimerização de proteínas e atividade de oxidorredutase, bem como componentes celulares, como jangadas de membrana e microdomínios de membrana (Figura 4D). Um total de 263 resultados de enriquecimento de KEGG foram obtidos, envolvendo principalmente a via de sinalização AGE-RAGE em complexos diabéticos, doença hepática alcoólica, via lipídica e aterosclerose. Com base no valor de P, os 10 principais resultados foram selecionados para desenhar um gráfico de bolhas de visualização KEGG (Figura 4E). A via de sinalização AGE-RAGE é altamente enriquecida em complexos diabéticos, e vários alvos principais no PPI, como PI3K, AKT e IL-1β, são enriquecidos nessa via. Portanto, essa via de sinalização foi selecionada para posterior validação.

Atenuação da lesão de podócitos pela inibição da via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB
Os níveis de expressão de genes e proteínas relacionados à via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB foram posteriormente examinados por PCR e WB. Os resultados da PCR mostraram que os níveis relativos de expressão de mRNA de Pi3k, Akt, Nf-κb e Il-1β no grupo MOD foram significativamente elevados em comparação com o grupo CON e diminuíram significativamente após a administração de YHT (Figura 5A-D). Os resultados do WB mostraram que os níveis relativos de proteína de P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB e IL-1β também foram significativamente elevados no grupo MOD em comparação com o grupo CON, enquanto diminuíram significativamente após a administração de YHT (Figura 5E-I). Esses resultados sugeriram ainda que o YHT poderia inibir a via de sinalização PI3K / AKT / NF-κB, atenuando a lesão de podócitos em camundongos DKD.

figure-results-1
Figura 1: Melhora na glicose no sangue, funções hepáticas e renais e distúrbios do metabolismo lipídico em camundongos com doença renal diabética. Efeitos do YHT na (A) glicemia aleatória; (B-D) função renal, incluindo proteína urinária de 24 horas, creatinina no sangue e nitrogênio ureico; (EG) função hepática, incluindo albumina sérica, alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase; e regulação do metabolismo lipídico (H,I), incluindo colesterol total e triglicerídeos. Os dados são expressos como médias ± desvios-padrão de seis amostras independentes, em comparação com o grupo em branco, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, e comparado com o grupo modelo, #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, essas notações estatísticas são usadas de forma consistente em todas as figuras. Abreviaturas: YHT = yinhuo Tang; DKD = doença renal diabética; ALB = albumina; ALT = alanina aminotransferase; AST = aspartato aminotransferase; CT = colesterol total; TG = triglicerídeos; CON = grupo controle; MOD = grupo de modelos; POS = valsartana Grupo de controle positivo; YH-L = grupo de baixa dose do YHT; YH-M = grupo de dose média do YHT; YH-H = grupo de alta dose do YHT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Melhora do dano histopatológico dos rins em camundongos com DQD. (A,B) Histologia renal pela coloração H&E e PAS (barra de escala = 20 μm); (C) coloração de Masson para observar o grau de fibrose renal e (D) análise semiquantitativa usando o software ImageJ; (E-G) Análise semiquantitativa dos níveis de expressão relativa de COI-I e α-SMA em tecidos renais usando IHC e software ImageJ (barra de escala = 20 μm). Abreviaturas: YHT = yinhuo Tang; DKD = doença renal diabética; H&E = coloração de hematoxilina e eosina; PAS = coloração de ácido periódico de Schiff; COI-I = Colágeno tipo I; α-SMA = actina α-músculo liso; CON = grupo controle; MOD = grupo de modelos; POS = valsartana Grupo de controle positivo; YH-L = grupo de baixa dose do YHT; YH-M = grupo de dose média do YHT; YH-H = grupo de alta dose do YHT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Atenuação da lesão de podócitos em camundongos DDC. (A-C) A HQ detectou os níveis relativos de expressão de CD2AP e WT-1 nos tecidos renais (barra de escala = 20 μm); (D, E) A PCR detectou a expressão relativa de mRNA de CD2AP e WT-1 em tecidos renais, e a análise semiquantitativa foi realizada usando o software Image J; (FH) WB detectou os níveis relativos de expressão proteica de CD2AP e WT-1 em tecidos renais, e a análise semiquantitativa foi realizada usando o software ImageJ. análise quantitativa utilizando o software Image J. Abreviaturas: YHT = yinhuo Tang; DKD = doença renal diabética; IHQ = imuno-histoquímica; WB = Western blotting; CD2AP = proteína associada a CD2; WT-1 = tumor de Wilms 1; CON = grupo controle; MOD = grupo de modelos; POS = valsartana Grupo de controle positivo; YH-L = grupo de baixa dose do YHT; YH-M = grupo de dose média do YHT; YH-H = grupo de alta dose do YHT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Análise farmacológica em rede de YHT para o tratamento da doença renal diabética. (A) Gráfico alvo de ingrediente ativo da doença de YHT para o tratamento da doença renal diabética. (B) Diagrama de Venn de alvos de interseção de YHT e DKD. A cor laranja representa o número de alvos relevantes para DKD; a cor verde representa o número de alvos terapêuticos dos ingredientes ativos do YHT; e a parte de interseção representa o número de alvos de interseção (o número de alvos de YHT para DKD). (C) Diagrama de rede PPI dos alvos de interseção de YHT e DKD. (D) Análise de enriquecimento GO dos 10 alvos mais importantes do YHT para o tratamento da DRD. (E) Análise de enriquecimento KEGG dos 10 alvos mais importantes para o tratamento YHT da DKD. Abreviaturas: YHT = yinhuo Tang; DKD = doença renal diabética; PPI = Interação Proteína-Proteína; GO = Ontologia Genética; KEGG = Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto; CON = grupo controle; MOD = grupo de modelos; POS = valsartana Grupo de controle positivo; YH-L = grupo de baixa dose do YHT; YH-M = grupo de dose média do YHT; YH-H = grupo de alta dose do YHT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Atenuação da lesão de podócitos pela inibição da via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB. (A-D) PCR para detectar a expressão relativa de mRNA de Pi3k, Akt, Nf-κb e Il-1β em tecidos renais. (E-I) WB para detectar os níveis relativos de expressão proteica de P-PI3K, P-AKT, P-NF-κB e IL-1β em tecidos renais, e a análise semiquantitativa foi realizada usando o software ImageJ. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composição de Yinhuo Tang. Clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 2: Detalhes dos primers qRT-PCR. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussão

Uma das etapas críticas neste protocolo é o uso da farmacologia de rede para identificar os componentes ativos do YHT e prever suas interações com alvos relacionados ao DKD. Esta etapa envolve a análise de dados biológicos em larga escala usando ferramentas de bioinformática, como bancos de dados (por exemplo, TCMSP, DrugBank e GeneCards) para mapear as vias moleculares e as potenciais redes biológicas afetadas pelo YHT. Essa previsão foi seguida de validação experimental por meio de modelos animais de DKD, onde foram testados os efeitos hipotéticos do YHT nessas vias. A integração de previsões computacionais com dados é um aspecto crucial de nossa abordagem, pois aumenta a confiabilidade de nossas descobertas e preenche a lacuna entre previsões teóricas e resultados práticos. Além disso, o uso de modelos animais é outra etapa crítica na validação dos efeitos terapêuticos do YHT. A DKD em animais imita de perto a progressão da doença humana, permitindo uma avaliação eficaz do impacto do YHT tanto no dano glomerular quanto na fibrose renal. O monitoramento meticuloso de marcadores de função renal, como Scr, BUN e proteinúria, juntamente com avaliações histopatológicas, é essencial para avaliar a eficácia terapêutica do YHT.

Embora nosso protocolo combine métodos computacionais e experimentais poderosos, existem várias limitações. Primeiro, a abordagem de farmacologia de rede depende muito dos dados disponíveis em bancos de dados públicos, e pode haver vieses ou informações ausentes sobre certos componentes das vias relacionadas ao YHT ou DKD. Embora tenhamos cruzado várias bases de dados para atenuar esse problema, algumas interações relevantes ainda podem ser negligenciadas. Em segundo lugar, este estudo explorou apenas o mecanismo do YHT na redução da lesão de podócitos no nível experimental do animal, e experimentos celulares e estudos clínicos de grandes amostras são necessários para validar os resultados experimentais. Por fim, a farmacologia da rede mostrou que o tratamento da DRD com YHT também estava associado à doença hepática alcoólica, metabolismo lipídico e aterosclerose e regulação da lipólise em adipócitos. Este estudo verificou apenas se a modulação da via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB pelo YHT poderia retardar a progressão da DKD; Os resultados precisam ser mais explorados.

A via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB é uma importante via de sinalização intracelular envolvida na regulação de uma variedade de processos biológicos, como crescimento celular, proliferação, sobrevivência e respostas inflamatórias22. Estudos têm demonstrado que ela desempenha um papel importante na progressão da lesão de pediculócitos23,24. O NF-κB é um importante componente a jusante da via PI3K/Akt e participa da transmissão de uma variedade de sinais intracelulares e da expressão de vários genes. A inibição da via de sinalização PI3K/AKT leva à degradação da proteína inibitória do NF-κB IκB, que por sua vez leva à fosforilação do NF-κB e sua entrada no núcleo, e à produção de uma variedade de quimiocinas e fatores inflamatórios, levando à lesão podocitária e fibrose intersticial renal25. Alguns estudos mostraram que a inibição da ativação da via de sinalização PI3K/AKT/NF-κB pode efetivamente suprimir as respostas inflamatórias e a fibrose renal, retardando assim a progressão da DRD26.

Estudos têm demonstrado que os distúrbios do metabolismo lipídico desempenham um papel significativo no aparecimento e progressão da DRD27,28. Pacientes com DRD geralmente apresentam metabolismo lipídico anormal, incluindo níveis elevados de LDL, TG e acúmulo de ácidos graxos. Essas anormalidades estão intimamente relacionadas a alterações patológicas, como glomeruloesclerose e fibrose túbulo-intersticial29,30. Pesquisas indicam que os distúrbios do metabolismo lipídico podem promover a progressão da DRD por meio de múltiplas vias de sinalização31,32. Primeiro, a via de sinalização mTOR é uma via chave na regulação do metabolismo lipídico; sua hiperativação leva à lesão de podócitos e proteinúria33,34. Um ambiente rico em gordura pode promover o acúmulo de lipídios através do eixo PI3K/AKT/mTOR, induzindo a apoptose de podócitos e, por fim, exacerbando a deterioração da função renal 35,36,37. Em segundo lugar, a proteína quinase ativada por AMP (AMPK), um regulador crítico do metabolismo energético celular, protege o rim de distúrbios metabólicos, promovendo a oxidação de ácidos graxos, inibindo a síntese de lipídios e reduzindo a lipotoxicidade 38,39,40. A inativação da AMPK é considerada um mecanismo importante na progressão da DKD. Os ativadores da AMPK, como a metformina, têm mostrado efeitos renoprotetores significativos e representam um alvo terapêutico promissor para a DKD41.

Finalmente, estudos demonstraram que os receptores ativados por proliferadores de peroxissomo α/γ (PPARα/γ) desempenham um papel essencial na regulação do metabolismo lipídico e da DKD42,43. A ativação do PPARα promove a oxidação de ácidos graxos e reduz o acúmulo de lipídios no rim, enquanto o PPARγ melhora a sensibilidade à insulina e exerce efeitos anti-inflamatórios44,45. Os agonistas do PPAR, como os fibratos, têm mostrado potenciais benefícios clínicos na redução da proteinúria em pacientes com DRD46. Em conclusão, os distúrbios do metabolismo lipídico influenciam a progressão patológica da DRD por meio de múltiplas vias de sinalização. As interações entre essas vias formam uma rede patológica complexa. O direcionamento do metabolismo lipídico pode fornecer novas estratégias terapêuticas para a DRD.

A família das caspases (CASP), uma família de proteases específicas da cisteína, é um grupo de proteases amplamente encontradas nas células e estão envolvidas principalmente na regulação da apoptose e das respostas inflamatórias47,48. Os membros da família CASP compartilham semelhanças estruturais e geralmente existem como zimogênios, que são ativados por meio de uma cascata de reações, desencadeando apoptose, piroptose e outros processos de morte celular programada49. Entre eles, o CASP3, um membro da família das caspases (CASP) com uma estrutura conservada tipicamente presente como um zimogênio, é uma protease chave na fase de execução da apoptose que catalisa a clivagem de proteínas celulares específicas, desempenhando assim um papel crítico na regulação do crescimento celular normal e na manutenção da homeostase interna50,51. A caspase-8 atua como iniciadora de cascatas apoptóticas e participa da modulação das respostas inflamatórias por meio da ativação do NPK, que é um fator chave na regulação do crescimento celular. A caspase-8 atua como iniciadora da cascata apoptótica e também participa da regulação da resposta inflamatória ativando vesículas inflamatórias como NLRP1 e NLRP3, desencadeando piroptose celular52. Com base no importante papel da via de sinalização CASP na mediação de apoptose e piroptose em células pedunculadas, explorações mais aprofundadas sobre a relação entre YHT, CASP3/8, células pedunculadas e DKD são necessárias no futuro.

Em comparação com as abordagens convencionais de descoberta de medicamentos que normalmente enfatizam mecanismos de alvo único bem definidos para clareza e previsibilidade regulatória, nossa estratégia baseada em farmacologia de rede permite uma exploração sistemática das interações multialvo inerentes às formulações de MTC como o YHT. Embora essa complexidade reflita a natureza holística da MTC e sua potencial amplitude terapêutica, ela também ressalta o desafio de efeitos não intencionais fora do alvo, que exigem validação e interpretação cuidadosas. Ao considerar a natureza multialvo e multicaminho da ação do YHT, fornecemos uma compreensão mais holística de seus efeitos terapêuticos no tratamento da DRD. Além disso, a farmacologia em rede permite a previsão de potenciais interações medicamentosas e efeitos colaterais, o que é crucial para garantir a segurança e eficácia das terapias multicomponentes. Os tratamentos atuais da DRD se concentram principalmente no gerenciamento dos sintomas ou na retardação da progressão, em vez de abordar os mecanismos subjacentes da doença. Ao integrar ferramentas modernas de bioinformática com validação experimental, este estudo ressalta a importância da biologia de sistemas na melhoria da eficácia da MTC, particularmente em doenças crônicas como a DRD.

Olhando para o futuro, essa técnica é uma promessa significativa para expandir o escopo da farmacologia de rede na pesquisa da MTC, particularmente no tratamento de doenças complexas como a DRD. Nossa abordagem pode ser aplicada para explorar outras fórmulas de MTC ou ervas individuais por seu potencial terapêutico no tratamento de doenças renais, cardiovasculares e distúrbios metabólicos. Além disso, essa metodologia pode ser estendida para investigar o reaproveitamento de medicamentos, identificando novos usos para medicamentos existentes no tratamento da DRD. Outra aplicação potencial de nossa abordagem está na medicina personalizada. Ao incorporar dados específicos do paciente, a farmacologia da rede pode ser usada para adaptar as estratégias de tratamento da MTC com base em perfis moleculares individuais, aumentando a eficácia do tratamento e minimizando os efeitos adversos.

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Provincial de Ciências Naturais de Jilin (No.20210101201JC).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Etanol anidroChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10009218
Centro de Experimentos em AnimaisUniversidade de Changchun de Medicina Tradicional ChinesaSYXK (JI) 2023-0014
Banco de dados BATMAN-TCMhttp://bionet.ncpsb.org/batmantcm--
Kit de ensaio de proteína BCASolarbioPC0020
Sistema
Kit de reagentes DABServicebioG1212-200T
db / db camundongosNanjing Junke Biological limited companySCXK (Su) 2020-009
ECL soluçãode substrato afinidadeKF8003
Pote elétrico de banho-maria de temperatura constanteFisaff Instrument (Hebei) Co., LtdDK-20000-IIIL
Fonte de alimentação do instrumento de eletroforeseBeijing Longfang Technology Co., LtdLF-600S
Homogeneizador de vidroSolarbioYA0852
Lâmina de vidroNantong Meiweide Life Science Co., LtdPC2-301
Cabra Anti-Coelho IgG HRP (anticorpo secundário)AfinidadeS00011:3000 para IHC, 1:10000 para WB
HematoxilinaWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG1140
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeHunan Kecheng Instrument Equipment Co., LtdH1-16KR
HiScript II Q RT SuperMix para qPCR (limpador de gDNA)VAZYMER223-01
Agitador horizontalJiangsu Haimen Qilin Bell Instrument Manufacturing Co., LtdSistema de imagem TS-1 Nikon Nikon DS-U3
Agitador de aquecimento magnético digital inteligenteHangzhou Miou Instrument Co., LtdTP-350E +
IsopropanolChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd80109218
marcador (20-120KD)GenScriptM00521
Kit de coloraçãoMasson BASOBA4079B
gaze médicaJianerkang Medical-
plataforma Metascape http://metascape.org/gp/index.html--
MetanolThermo67-56-1
Microbiologia websitehttp://www.bioinformatics.com.cn/--
microscópioNikonECLIPSE Ci
forno de microondasGalanz Microwave Forno Electrical Appliance Co., LtdP70D20TL-P4
Multi amostra moedor de tecidoShanghai Jingxin Industrial Development Co., LtdTissuelyser-24L
Balança eletrônica analítica multifuncionalChangzhou Lucky Electronic Equipment Game CompanyFA1204
Resina neutraWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdG8590
Soro de cabra normalSolarbioSL038
fornoShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., LtdDHG-9140A
Centrífuga de palmaWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdD1008E
PAS kit de coloraçãoBASOBA4114B
Cortador patológicoShanghai Leica Instrument Co., LtdRM2016
PBSSolarbioP1020
Instrumento PCRHangzhou Miou Instrument Co., LtdPR-96
Pistola de pipetaDragonKE0003087/KA0056573
Tampão de diluição de anticorpos primáriosBeyotimeP0023A
Complexo inibidor de proteína fosfataseMeilunbioMB12707-1
membrana PVDF (0,22 μ m)SolarbioISEQ00010
Diluente de anticorpo primário / secundário rápidoSolarbioA1811
Coelho anti-CD2APAfinidadeDF22981:200 para IHC, 1:1000 para WB
Coelho anti-COI-IAfinidadeDF121491:200 para IHC, 1:1000 para WB
Rabbit anti-IL-1βAffinityAF51031:1000 para WB
Rabbit anti-P-AKTAffinityAF00161:1000 para WB
Rabbit anti-P-NF-Κ bAffinityAF32191:1000 para WB
Rabbit anti-P-PI3KAffinityAF32421:1000 para WB
Rabbit anti-WT-1AffinityDF63311:200 para IHC, 1:1000 para WB
Rabbit anti-α-SMAAffinityAF10321:200 para IHC, 1:1000 para WB
Rabbit anti-β-ActinAffinityAF70181:1000 para WB
ABIQuantStudio 6sistema ABI
MeilunbioMA0151
DDH2O RNase-livreP0023D
software----
Site de banco de dados de strings https://cn.string-db.org/--
Instrumento de água super puraZhiang Instrument (Shanghai) Co., LtdClever-S15
Taq Plus DNA PolimeraseTIANGENET105-02
Banco de dados TCMSP https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php-
-ParedebonitaMB-96
TrizolAmbion15596-026
Tween 20National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd30189328
Espectrofotômetro ultra micro UV visívelHangzhou Miou Instrument Co., LtdND-100
Banco de dados de proteínas Uniprothttps://www.uniprot.org-
Microscópio óptico verticalNikonNikon Eclipse CI
Kit de teste de proteína urináriaNanjing Jiancheng Bioengineering Bioengineering Research InstituteC035-2
liofilizador a vácuoNingbo Xinzhi Biotechnology Co.A01-1-NA0959
Tanque de eletroforese verticalBeijing 61 Instrument FactoryDYCZ-24DN
Misturador de vórticeWuhan Lingsi Biotechnology Co., LtdMX-F
Blocking BufferSolarbioSW3010
xilenoChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd10023418
YihongBiotecnologia Co. de Wuhan Lingsi, LtdE8090
cerâmico da imagem latente da quimioluminescência de Midea MD-DG30E103 dos potenciômetros do amortecedor Beyotime P0023B de obstrução Tecnologia Co. de Hangzhou Shenhua, Ltd Reagente químico Co. do grupo farmacêutico nacional de China do clorofórmio, Ltd 10006818 software de Cytoscape 3.8.0---- Tampão de lise RIPA do QuantStudio 6 do PCR do tempo real Tampão secundário Beyotime da diluição do anticorpo de Solarbio R1600 e vidro de tampa Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co., Ltd 10212432C SPSS 26,0 do moedor do tecido China Western

Referências

  1. Naaman, S. C., Bakris, G. L. Diabetic nephropathy: Update on pillars of therapy slowing progression. Diabetes Care. 46 (9), 1574-1586 (2023).
  2. Glastras, S. J., Pollock, C. A. Targeted identification of risk and treatment of diabetic kidney disease. Nat Rev Nephrol. 20 (2), 75-76 (2024).
  3. Gregory, G. A., et al. Global incidence, prevalence, and mortality of type 1 diabetes in 2021 with projection to 2040: a modelling study. Lancet Diabetes Endocrinol. 10 (10), 741-760 (2022).
  4. Rao, B. V., Tan, S. H., Candasamy, M., Bhattamisra, S. K. Diabetic nephropathy: An update on pathogenesis and drug development. Diabetes Metab Syndr. 13 (1), 754-762 (2019).
  5. Guo, M., He, F., Zhang, C. Molecular therapeutics for diabetic kidney disease: An update. Int J Mol Sci. 25 (18), 10051(2024).
  6. Shen, S., et al. Advances in traditional Chinese medicine research in diabetic kidney disease treatment. Pharm Biol. 62 (1), 222-232 (2024).
  7. Han, C., et al. Yi-Shen-Hua-Shi granule ameliorates diabetic kidney disease by the "gut-kidney axis". J Ethnopharmacol. 10 (307), 116257(2023).
  8. Ma, X., et al. Advances in oxidative stress in pathogenesis of diabetic kidney disease and efficacy of TCM intervention. Ren Fail. 45 (1), 2146512(2023).
  9. Liu, M., et al. A systematic review on polysaccharides from Morinda officinalis How: Advances in the preparation, structural characterization and pharmacological activities. J Ethnopharmacol. 28 (328), 118090(2024).
  10. Zhang, X., et al. Network pharmacology-based identification of key pPharmacological mechanism of Shen-qi-di-huang decoction acting on uremia. Altern Ther Health Med. 30 (1), 44-50 (2024).
  11. Linlin, Z., et al. A multi-target and multi-channel mechanism of action for Jiawei Yinhuo Tang in the treatment of social communication disorders in autism: Network pharmacology and molecular docking studies. Evid Based Complement Alternat Med. 8 (2022), 4093138(2022).
  12. Husain, S. Role of podocyte in kidney disease. Front Biosci (Landmark Ed). 29 (7), 250(2024).
  13. Pavenstädt, H., Kriz, W., Kretzler, M. Cell biology of the glomerular podocyte. Physiol Rev. 83 (1), 253-307 (2003).
  14. Torban, E., et al. From podocyte biology to novel cures for glomerular disease. Kidney Int. 96 (4), 850-861 (2019).
  15. Yue, J. I., et al. Acupuncture improve proteinuria in diabetic kidney disease rats by inhibiting ferroptosis and epithelial-mesenchymal transition. Heliyon. 10 (13), e33675(2024).
  16. Liu, X. Q., et al. Wogonin protects glomerular podocytes by targeting Bcl-2-mediated autophagy and apoptosis in diabetic kidney disease. Acta Pharmacol Sin. 43 (1), 96-110 (2022).
  17. Nogales, C., et al. Network pharmacology: curing causal mechanisms instead of treating symptoms. Trends Pharmacol Sci. 43 (2), 136-150 (2022).
  18. Zhang, P., et al. Network pharmacology: towards the artificial intelligence-based precision traditional Chinese medicine. Brief Bioinform. 25 (1), bbad518(2023).
  19. Zhao, L., et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 12 (309), 116306(2023).
  20. Meek, R. L., et al. Glomerular cell death and inflammation with high-protein diet and diabetes. Nephrol Dial Transplant. 28 (7), 1711-1720 (2013).
  21. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. 2008, (2008).
  22. Yusuf, J. A., et al. Molecular mechanism underlying stress response and adaptation. Prog Brain Res. 291, 81-108 (2025).
  23. Yu, M., et al. Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via PI3K/Akt/NF-κB pathway. Biomed Pharmacother. 12 (90), 677-685 (2017).
  24. Chen, H., et al. The PI3K/AKT pathway in the pathogenesis of prostate cancer. Front Biosci (Landmark Ed). 21 (5), 1084-1091 (2016).
  25. Wang, J., et al. Critical roles of PI3K/Akt/NF-κB survival axis in angiotensin II-induced podocyte injury. Mol Med Rep. 20 (6), 5134-5144 (2019).
  26. Zhang, S. J., et al. Integrated network pharmacology analysis and experimental validation to elucidate the mechanism of acteoside in treating diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 12 (18), 1439-1457 (2024).
  27. Rong, J., et al. Mechanisms of hepatic and renal injury in lipid metabolism disorders in metabolic syndrome. Int J Biol Sci. 20 (12), 4783-4798 (2024).
  28. Bi, Z., et al. Development of a clinical prediction model for diabetic kidney disease with glucose and lipid metabolism disorders based on machine learning and bioinformatics technology. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 28 (3), 863-878 (2024).
  29. Wei, L., Gao, J., Wang, L., Tao, Q., Tu, C. Multi-omics analysis reveals the potential pathogenesis and therapeutic targets of diabetic kidney disease. Hum Mol Genet. 33 (2), 122-137 (2024).
  30. Vartak, T., Godson, C., Brennan, E. Therapeutic potential of pro-resolving mediators in diabetic kidney disease. Adv Drug Deliv Rev. 178 (4), 113965(2021).
  31. Liu, S., et al. Renal tubule ectopic lipid deposition in diabetic kidney disease rat model and in vitro mechanism of leptin intervention. J Physiol Biochem. 78 (2), 389-399 (2022).
  32. Tang, C., et al. Fenofibrate attenuates renal tubular cell apoptosis by up-regulating MCAD in diabetic kidney disease. Drug Des Devel Ther. 17 (2), 1503-1514 (2023).
  33. Lu, H. T., et al. Unraveling DDIT4 in the VDR-mTOR pathway: a novel target for drug discovery in diabetic kidney disease. Front Pharmacol. 15 (10), 1344113(2024).
  34. Tang, G., et al. Clinical efficacies, underlying mechanisms and molecular targets of Chinese medicines for diabetic nephropathy treatment and management. Acta Pharm Sin B. 11 (9), 2749-2767 (2021).
  35. Zhang, P., et al. Huaiqihuang (HQH) protects podocytes from high glucose-induced apoptosis and inflammation response by regulating PI3K/AKT/mTOR pathway. Arch Physiol Biochem. 11 (27), 1-8 (2024).
  36. Zhaoan, G., et al. Qizhi Jiangtang capsule activates podocyte autophagy in diabetic kidney disease by inhibiting phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin pathways. J Tradit Chin Med. 43 (4), 667-675 (2023).
  37. Jin, D., et al. Jiedu Tongluo Baoshen formula enhances podocyte autophagy and reduces proteinuria in diabetic kidney disease by inhibiting PI3K/Akt/mTOR signaling pathway. J Ethnopharmacol. 293 (3), 115246(2022).
  38. Zhou, Y., et al. Metrnl alleviates lipid accumulation by modulating mitochondrial homeostasis in diabetic nephropathy. Diabetes. 72 (5), 611-626 (2023).
  39. Shao, M., et al. Canagliflozin regulates metabolic reprogramming in diabetic kidney disease by inducing fasting-like and aestivation-like metabolic patterns. Diabetologia. 67 (4), 738-754 (2024).
  40. Tian, S., et al. GLP-1 receptor agonists alleviate diabetic kidney injury via β-klotho-mediated ferroptosis inhibition. Adv Sci (Weinh). 12 (4), e2409781(2024).
  41. Song, Y., et al. Identification of circular RNAs and functional competing endogenous RNA networks in human proximal tubular epithelial cells treated with sodium-glucose cotransporter 2 inhibitor dapagliflozin in diabetic kidney disease. Bioengineered. 13 (2), 3911-3929 (2022).
  42. Fan, Y., et al. Identification of potential key lipid metabolism-related genes involved in tubular injury in diabetic kidney disease by bioinformatics analysis. Acta Diabetol. 61 (8), 1053-1068 (2024).
  43. Pan, S., et al. A comprehensive weighted gene co-expression network analysis uncovers potential targets in diabetic kidney disease. J Transl Int Med. 10 (4), 359-368 (2023).
  44. Chen, Y., et al. Curcumin targets CXCL16-mediated podocyte injury and lipid accumulation in diabetic kidney disease treatment. Arch Pharm Res. 47 (12), 924-939 (2024).
  45. Liu, K., et al. Design, synthesis, and biological evaluation of a novel dual peroxisome proliferator-activated receptor alpha/delta agonist for the treatment of diabetic kidney disease through anti-inflammatory mechanisms. Eur J Med Chem. 218 (5), 113388(2021).
  46. Kitada, M., Kanasaki, K., Koya, D. Clinical therapeutic strategies for early stage of diabetic kidney disease. World J Diabetes. 5 (3), 342-356 (2014).
  47. Galluzzi, L., Kepp, O., Kroemer, G. Caspase-3 and prostaglandins signal for tumor regrowth in cancer therapy. Oncogene. 31 (23), 2805-2808 (2012).
  48. Li, L., Wang, S., Zhou, W. Balance cell spoptosis and pyroptosis of caspase-3-activating chemotherapy for better antitumor therapy. Cancers (Basel). 15 (1), 26(2022).
  49. Fan, T. J., et al. Caspase family proteases and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 37 (11), 719-727 (2005).
  50. Asadi, M., et al. Caspase-3: Structure, function, and biotechnological aspects. Biotechnol Appl Biochem. 69 (4), 1633-1645 (2022).
  51. Eskandari, E., Eaves, C. J. Paradoxical roles of caspase-3 in regulating cell survival, proliferation, and tumorigenesis. J Cell Biol. 221 (6), e202201159(2022).
  52. Pang, J., Vince, J. E. The role of caspase-8 in inflammatory signalling and pyroptotic cell death. Semin Immunol. 42 (70), 101832(2023).

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