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Artigo de método

Usando bibliotecas de visão computacional para simplificar a quantificação de núcleos

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DOI:

10.3791/67945

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6 de junho de 2025

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1Metabolic Health & Muscle Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University, 2Applied Exercise Physiology Laboratory, Department of Kinesiology and Sport Management, Texas Tech University

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve métodos passo a passo para automatizar a quantificação de núcleos baseada em imagem usando um programa executável de código aberto validado em uma variedade de densidades de células. Este programa fornece uma alternativa que aborda as barreiras relacionadas ao custo, acessibilidade para usuários com habilidades tecnológicas limitadas e validação específica do aplicativo que pode limitar a utilidade das tecnologias existentes.

Resumo

Ensaios de células vivas e análises de células baseadas em imagem requerem normalização de dados para uma interpretação precisa. Um método comumente usado é corar e quantificar núcleos, seguido de normalização de dados para contagem de núcleos. Essa contagem de núcleos é frequentemente expressa como contagem de células para células uninucleadas. Embora a quantificação manual possa ser trabalhosa e demorada, os métodos automatizados disponíveis podem não ser preferidos por todos os usuários, podem não ter validação para essa aplicação específica ou podem ter um custo proibitivo. Aqui, fornecemos instruções passo a passo para capturar imagens quantificáveis de núcleos corados com colorações de DNA fluorescente e, posteriormente, quantificar os núcleos usando um programa de software automatizado de contagem de objetos desenvolvido usando bibliotecas de visão computacional Python. Também validamos este programa em uma variedade de densidades de células. Embora o tempo exato para a execução do programa varie de acordo com o número de imagens e hardware do computador, este programa consolida horas de trabalho contando núcleos em segundos para que o programa seja executado. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido usando imagens de células fixas e coradas, imagens de núcleos corados em células vivas e aplicações de imunofluorescência também podem ser quantificadas usando este programa. Em última análise, este programa oferece uma opção que não requer um alto grau de habilidade tecnológica e é uma alternativa validada e de código aberto para ajudar os biólogos celulares e moleculares a simplificar seus fluxos de trabalho, automatizando a tarefa tediosa e demorada de quantificação de núcleos.

Introdução

Experimentos funcionais e baseados em imagens são essenciais para a compreensão dos impactos dos tratamentos experimentais na bioquímica e fisiologia de células inteiras. A interpretação válida dos dados de experimentos de biologia celular depende da precisão e reprodutibilidade do protocolo experimental, incluindo a normalização dos dados. Por exemplo, análises do consumo de oxigênio e das taxas de acidificação extracelular em células vivas no início e após o tratamento com drogas específicas permitem avaliar vários aspectos do metabolismo energético 1,2. Medir a atividade de enzimas como a lactato desidrogenase no sobrenadante de culturas de células pode ajudar a quantificar a integridade da membrana celular3. A coloração de células cultivadas com anexina V e iodeto de propídio antes da fixação permite a avaliação de células apoptóticas e necróticas4. No entanto, as diferenças na densidade celular entre os poços afetam os resultados de cada um desses ensaios. Confiar apenas na densidade de semeadura pode fornecer resultados enganosos devido a erros na contagem de células para semeadura, variações na densidade celular no meio durante o plaqueamento ou diferentes taxas de crescimento celular entre amostras ou tratamentos ao longo dos experimentos. Portanto, a normalização dos resultados experimentais é necessária.

Os métodos atuais de normalização para dados celulares funcionais e baseados em imagem incluem concentração de proteína5 ou núcleos ou contagem de células6. Para normalizar os dados para a concentração de proteínas, as células devem ser extraídas em volumes iguais de tampão de lise com inibidor de protease após a execução do ensaio, e um ensaio adicional (por exemplo, ensaio de ácido bicinconínico, ensaio de Bradford, etc.) deve ser realizado para quantificação de proteínas. A precisão deste método depende da extração completa da célula; deixar qualquer proteína para trás contribui para erros na quantificação. A contagem de núcleos ou células fornece uma alternativa em que nenhuma célula precisa ser removida da superfície em que são cultivadas. Em vez disso, as células vivas ou fixas são coradas ou contra-coradas usando colorações colorimétricas ou fluorescentes, e a contagem pode ser realizada com base em imagens de células inteiras ou apenas núcleos. A quantificação de núcleos é preferível a células inteiras para aplicações de microscopia de fluorescência e para normalizar dados em células fundidas (por exemplo, miotubos) ou tecidos. Para quantificação de núcleos usando uma abordagem de fluorescência, corantes de DNA fluorescente (por exemplo, dicloreto de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), Hoechst 33342, Hoechst 33358, DRAQ5, etc.) são aplicados a células vivas ou fixas e fotografados usando microscopia de fluorescência. DAPI, Hoechst e DRAQ5 ligam-se preferencialmente a regiões ricas em adenina-timina do DNA 7,8,9, fornecendo um meio para detectar núcleos. A otimização da concentração do corante evita a ligação fora do alvo (ou seja, ao DNA mitocondrial, causando fluorescência citosólica pontilhada)10. O processo de otimização pode ser simplificado usando meios de montagem disponíveis comercialmente contendo DAPI para células fixas (por exemplo, VECTASHIELD Antifade Mounting Medium com DAPI) e concentrações publicadas de corantes para células vivas (por exemplo, Hoechst)6,11,12. Uma vez corados, os núcleos em células vivas ou fixas são visualizados usando o filtro de excitação apropriado (por exemplo, ultravioleta [DAPI e Hoechst] ou vermelho distante [DRAQ5]). Os máximos de excitação para DAPI, Hoechst e DRAQ5 estão em cada extremidade do espectro para microscopia de fluorescência. Esse atributo, mais a especificidade do DNA desses corantes e seu uso em concentrações ideais, minimiza a fluorescência fora do alvo. As imagens resultantes mostram núcleos brilhantes contra um fundo preto, e esses núcleos são quantificados como uma medida do número de células para células uninucleadas. Embora existam outros métodos precisos de quantificação de núcleos baseados em coloração usando colorações histológicas e microscopia de campo claro13, a automação é mais difícil, embora possível, usando essas abordagens.

Embora continue sendo o padrão-ouro, a quantificação manual de núcleos é trabalhosa, demorada e suscetível a possíveis erros humanos com contagem prolongada. Embora existam programas automatizados de contagem de células, eles não são preferidos por todos os usuários, podem ter um custo proibitivo e a validação para aplicações específicas pode ser mínima. Python tornou-se um recurso valioso e acessível para biólogos nos últimos anos. As bibliotecas de visão computacional Python são particularmente úteis para análise de imagens14. Aqui, fornecemos instruções passo a passo para usar nosso programa executável desenvolvido usando código Python para quantificar núcleos corados com corantes fluorescentes e imagens usando microscopia de fluorescência. Habilidades de codificação não são necessárias para usar o programa descrito aqui. Esse fluxo de trabalho é específico para células ou tecidos com corantes de DNA fluorescente aplicados. Não se destina ao uso com imagens de campo claro. A Seção 1 descreve como capturar e salvar imagens coletadas usando microscopia de fluorescência de maneira compatível com esse fluxo de trabalho. A Seção 2 fornece instruções para executar o programa de quantificação de núcleos como uma saída executável e de busca. O programa executável pode ser executado diretamente do arquivo .exe fornecido e não requer modificações para quantificar núcleos em imagens de qualidade. Este executável requer um PC baseado em Windows. A Seção 3 fornece instruções para executar o programa como um script Python em vez de um executável (necessário para sistemas baseados em Mac ou Linux, opcional para sistemas baseados em Windows) e permite ajustar o código, se desejado. A seção 4 descreve como usar os resultados para normalização. Esses protocolos são seguidos por resultados representativos, incluindo dados de validação de nosso laboratório.

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Protocolo

NOTA: Arquivos suplementares podem ser encontrados no seguinte link https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Captura e salvamento de imagens usando microscopia de fluorescência

  1. Prepare amostras de células ou tecidos a serem visualizadas, incluindo coloração com o corante de DNA desejado. Para obter as imagens aqui utilizadas, mioblastos C2C12 (CRL-1772, American Type Culture Collection) foram cultivados em placas de 6 poços por 48-72 h sob condições de cultura padrão (5% CO2, 37 °C, umidificado), com ou sem 50 mM EtOH6, e fixados em metanol gelado conforme descrito anteriormente13. As células fixas foram montadas usando um meio de montagem contendo DAPI15 e secas no escuro antes da imagem.
  2. Ligue todos os componentes do microscópio de fluorescência e do computador de acordo com os procedimentos operacionais padrão estabelecidos. Abra o software associado ao microscópio.
  3. Defina o microscópio para visualizar amostras através da ocular. Verifique o objetivo. Se necessário, gire o revólver para o objetivo desejado. Certifique-se de que o programa de software tenha o objetivo desejado selecionado para uma indicação precisa da área da imagem. Aqui, as imagens foram capturadas usando uma objetiva de 10x.
  4. Com as luzes apagadas, coloque a amostra (slide, prato ou prato) no palco. Ligue a imagem ao vivo com o filtro apropriado e defina o tempo de exposição para uma duração predeterminada ou para a exposição automática. Aqui, filtro DAPI e tempo de exposição de 61-62 ms foram usados. Consulte a tabela de resolução de problemas para obter orientações sobre como definir o tempo de exposição, especialmente para imagens com densidades de células elevadas.
  5. Usando a ocular, ajuste lentamente o foco usando o botão de ajuste bruto até que os núcleos manchados fiquem visíveis e, em seguida, use o botão de ajuste fino para ajustar lentamente o foco até que os núcleos pareçam claros e nítidos.
    NOTA: Exemplos de imagens apropriadas são mostrados na Figura 1.
    1. Se aparecer coloração de fundo excessiva ou se os núcleos parecerem muito escuros, ajuste o tempo de exposição manualmente. Em uma única imagem, pode haver diferenças visíveis na intensidade do sinal para alguns núcleos; no entanto, a forma redonda deve ser visível para todos os núcleos com interferência mínima de sinal.
      NOTA: O programa usado em aplicações downstream é robusto para diferentes intensidades. As imagens brutas usadas para o desenvolvimento e validação do programa de quantificação de núcleos incluem imagens com uma variedade de intensidades de sinal e estão disponíveis através do repositório Open Science Framework (veja o link mencionado acima).

figure-protocol-1
Figura 1: Exemplos de imagens de núcleos corados com DAPI. Essas imagens mostram núcleos em (A) baixa, (B) média ou (C) alta densidade celular com fundo mínimo. Observe a intensidade variável do sinal dos núcleos na imagem C; Isso não interferiu na quantificação. A barra de escala (C) indica 100 μm; As barras de escala devem ser omitidas das imagens usadas para quantificação de núcleos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Quando os núcleos estiverem focados através da ocular, mude o modo de detecção para a câmera. Ajuste o foco usando o botão de ajuste fino.
  2. Ajuste o tempo de exposição, se necessário. Observe o tempo de exposição final para uso com amostras e imagens subsequentes.
    NOTA: Embora o uso do mesmo tempo de exposição em todas as imagens seja ideal, variações no tempo de exposição são aceitáveis para esta aplicação porque a intensidade da fluorescência não é quantificada ou comparada entre as amostras.
  3. Capture a imagem usando o botão de captura de imagem apropriado no software. Se as amostras tiverem várias colorações aplicadas, troque o filtro (por exemplo, para FITC, TRITC ou Cy5) e crie imagens da mesma área para fins de mesclagem.
  4. Aplique o obturador para minimizar a exposição da amostra à luz. Sem gravar em uma barra de escala, salve a imagem em um formato de arquivo de figura universal (.tif, .png ou .jpg) em uma pasta dedicada. Certifique-se de que cada nome de arquivo de imagem seja adequadamente descritivo ou que qualquer codificação usada para nomes de arquivo tenha a documentação vinculada apropriada.
    NOTA: Este se tornará o diretório de imagens para o programa de quantificação. Se a imagem multicolorida foi usada, copie apenas as imagens dos núcleos para uma pasta separada e dedicada. Isso também pode ser feito no final da sessão de imagem. As imagens exportadas usando as configurações de exportação padrão na maioria dos softwares de imagem geralmente têm resolução suficiente para uso com este programa, desde que imagens de qualidade tenham sido capturadas. No entanto, as imagens devem ser verificadas visualmente após a exportação para garantir que a morfologia dos núcleos esteja clara. Se as imagens forem salvas em .jpg formato, deve-se tomar cuidado para garantir que as imagens não sejam excessivamente compactadas e a qualidade seja mantida.
  5. Abra o obturador, retorne à imagem ao vivo e digitalize a amostra para outro local para obter imagens. Repita as etapas 1.8 a 1.9 conforme necessário. Para imagens de células semeadas em placas de 6 poços capturadas com ampliação de 10x, capture de 10 a 15 imagens por poço (dependendo da consistência da densidade celular em toda a área da amostra).
  6. Depois que todas as imagens de uma única amostra forem adquiridas, execute uma das opções a seguir.
    1. Passe para o próximo exemplo e repita as etapas 1.4-1.10.
    2. Pause o protocolo e retorne em outro momento. As amostras devem permanecer protegidas da luz. Esta opção não é recomendada se estiver trabalhando com células vivas.
  7. Quando a imagem estiver concluída, certifique-se de que todas as amostras estejam protegidas contra luz antes de acender as luzes da sala. Se a pasta que contém as imagens for salva localmente, transfira os arquivos para um pen drive, local de armazenamento em nuvem ou outra unidade de rede acessível ao computador onde o programa de quantificação será executado. Salve em uma pasta dedicada.
  8. Desligue todas as partes do microscópio e do computador de acordo com os procedimentos operacionais padrão estabelecidos.
  9. A imagem agora está completa. Analise os arquivos usando o programa de quantificação automatizada, conforme descrito na Seção 2 ou, alternativamente, executando o programa como um script Python, conforme descrito na Seção 3.

2. Executando o programa automatizado de quantificação de núcleos como um executável

NOTA: Este método, executando o programa como um executável, é compatível com PCs baseados em Windows e é o método recomendado para usuários do sistema operacional Windows. Mac OS ou outros usuários não Windows devem executar o programa como um script Python (consulte a Seção 3).

  1. Verifique se o Python está instalado no computador. Se necessário, instale o Python a partir do python.org/downloads (preferencial) ou usando o Anaconda ou o Miniconda. Na data de publicação, este programa foi testado com as versões 3.10-3.12 do Python.
  2. Abra o navegador e navegue até https://github.com/rbudnar/nuclei_counter/releases. Baixe a versão mais recente do arquivo chamado count_nuclei.zip.
  3. Na pasta Downloads, clique com o botão direito do mouse no arquivo Zip e em Extract All files para o local desejado no computador local (consulte a Figura 2A). Mantenha este local de arquivo aberto; esse caminho de arquivo será usado na etapa 2.5 (consulte a Figura 2B).
    NOTA: Count_nuclei agora deve aparecer como um arquivo de aplicativo. Este é o arquivo executável.
  4. Abra um prompt de comando pesquisando CMD ou Prompt de Comando na barra de pesquisa. Use o comando cd para alterar o diretório para o caminho do arquivo executável (consulte a Figura 2C) e pressione Enter. Exemplo de linha de comando: C:\Users\janedoe>cd [espaço após cd e, em seguida, copie/cole o caminho do arquivo]
  5. Na próxima linha de comando, digite o seguinte e pressione Enter.
    count_nuclei.exe --img_dir "caminho/para/imagens" --output_dir "caminho/para/saída" --save_images --output_count_filename "results.csv"
    onde caminho/para/imagens é o caminho do arquivo para a pasta que contém as imagens a serem analisadas (consulte a etapa 1.14); path/to/output é o caminho do arquivo para a pasta onde o arquivo .csv deve ser salvo (o padrão é o diretório de trabalho atual quando não fornecido); e results.csv é o nome do arquivo no qual as contagens resultantes serão salvas (se não for fornecido, o nome do arquivo de saída será padronizado para count_results.csv).
    NOTA: As aspas são necessárias na linha de comando. Certifique-se de que não haja espaços após aspas antes do caminho do arquivo (consulte a Figura 2C).
  6. Quando a próxima linha de comando for exibida, o processamento estará concluído. Os contornos e a planilha de resultados agora estão disponíveis no local especificado como o diretório de saída na etapa 2.5 (ou seja, caminho/para/saída; consulte a Figura 2C).
  7. Inspecione visualmente os contornos para verificar a qualidade da contagem. Os resultados agora podem ser usados para normalizar os dados, conforme descrito na Seção 4.
    NOTA: Se os contornos parecerem ter perdido núcleos (por exemplo, núcleos parecem muito fracos) ou agrupar grupos de núcleos em um único item (por exemplo, imagem superexposta, muito fundo, artefatos), o usuário deve consultar a tabela de solução de problemas e pode precisar retornar à Seção 1 para otimizar a aquisição de imagens antes de passar para a Seção 4.

figure-protocol-2
Figura 2: Exemplos de partes importantes do fluxo de trabalho para a seção 2. (A) Extraia arquivos da pasta Downloads, tendo o cuidado de clicar na pasta correta, conforme indicado pela seta, para habilitar a extração (B) para o destino desejado na etapa 2.3. (C) Exemplos de comandos para as etapas 2.4 e 2.5 e a próxima linha de comando indicando a conclusão na etapa 2.6. Observe que o caminho do arquivo na etapa 2.4 (C) corresponde ao local para extração na etapa 2.3 (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Executando o programa automatizado de quantificação de núcleos como script Python

  1. Verifique se o Python está instalado no computador. Se necessário, instale o Python a partir do python.org/downloads (preferencial) ou usando o Anaconda ou o Miniconda. Na data de publicação, este programa foi testado com as versões 3.10-3.12 do Python.
  2. Abra o navegador e navegue até https://github.com/rbudnar/nuclei_counter. Clique no botão Green Code e, em seguida, clique em Download ZIP para fazer download do repositório de código (consulte a Figura 3A).
  3. Use as instruções a seguir para o sistema operacional Windows. Consulte a etapa 3.4 para máquinas baseadas em Mac OS.
    1. Na pasta Downloads, clique com o botão direito do mouse no arquivo e selecione Extrair tudo para extrair os arquivos para um computador local (consulte a Figura 3B-C).
    2. No local do arquivo extraído, abra a pasta chamada nuclei_counter-main. Este é o repositório de código.
      NOTA: Isso só precisa ser baixado na primeira vez que este programa for usado; Basta mover os arquivos extraídos para um local de rede acessível e anotar esse local.
    3. Abra um prompt de comando pesquisando CMD ou Prompt de Comando na barra de pesquisa. Se o Python tiver sido instalado pelo Anaconda ou Miniconda, abra o prompt do Anaconda em vez de um prompt de comando padrão. Isso pode ser encontrado digitando Anaconda Prompt na barra de pesquisa.
    4. Use o comando cd para alterar o diretório para o repositório de código e pressione Enter. Consulte a linha de código abaixo, que diferencia maiúsculas de minúsculas. Certifique-se de que a pasta chamada nuclei_counter-main esteja aberta ao copiar o caminho do arquivo; o arquivo chamado pyproject ou pyproject.toml deve estar visível (consulte a Figura 3D). Exemplo de linha de comando: C:\Users\janedoe>cd [espaço após cd e, em seguida, copie/cole o caminho do arquivo]
    5. Na próxima linha de comando, digite o seguinte, incluindo o espaço e o ponto (consulte a Figura 3D:
      pip instalar -e .
      NOTA: As etapas 3.3.5 e 3.3.6 só precisam ser concluídas na primeira vez que este programa for executado em qualquer computador. Se isso já tiver sido concluído, vá para a etapa 3.3.7. O processo de instalação pode levar alguns instantes para inicializar.
    6. Pressione Enter. A execução desse comando instala as bibliotecas necessárias para executar esse script e instala o repositório em um modo editável nos ajustes de código de evento necessários (consulte a Figura 3D).
    7. Digite o seguinte na próxima linha de comando para alterar o diretório para o diretório principal do código-fonte (consulte a Figura 3E):
      CD "nuclei_counter"
    8. Na próxima linha de comando, digite o seguinte e pressione Enter (consulte a Figura 3E):
      python count_nuclei.py --img_dir "caminho/para/imagens" --output_dir "caminho/para/saída" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      Onde caminho/para/imagens é o caminho do arquivo para a pasta que contém as imagens a serem analisadas (etapa 1.14); path/to/output é o caminho do arquivo para a pasta onde o arquivo .csv deve ser salvo (o padrão é o diretório de trabalho atual quando não fornecido); e results.csv é o nome do arquivo no qual as contagens resultantes serão salvas (se não for fornecido, o nome do arquivo de saída será padronizado para count_results.csv).
      NOTA: As aspas são necessárias na linha de comando. Certifique-se de que não haja espaços após aspas antes do caminho do arquivo. O script python lerá os arquivos no caminho do arquivo fornecido e executará o programa de contagem de núcleos para todas as imagens no diretório (consulte a Figura 3E). As contagens resultantes serão salvas no arquivo de .csv de resultados no local especificado.
    9. Quando a próxima linha de comando for exibida, o processamento estará concluído (consulte a Figura 3E). Os contornos e a planilha de resultados agora estão disponíveis no local especificado como o diretório de saída na etapa 3.3.8 (ou seja, caminho/para/saída).

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Figura 3: Exemplos de partes importantes do fluxo de trabalho para a seção 3 usando o sistema operacional Windows. Para acessar o código, clique no botão verde Código e (A) baixe o arquivo Zip (indicado por setas). (B) Extraia clicando com o botão direito do mouse no arquivo Zip (mostrado em azul) e (C) definindo o destino desejado. (D) Depois de abrir o prompt de comando, exemplos de comandos para as etapas 3.3.4 e 3.3.5. Observe que o comando para a etapa 3.3.5 está todo em uma linha; o texto que começa com "Obtendo arquivo" na próxima linha aparece após pressionar enter (etapa 3.3.6; ou seja, executar o comando). (E) Exemplos de comandos para as etapas 3.3.7 e 3.3.8, uma barra de progresso após a execução da etapa 3.3.8 e a linha de comando mostrando a conclusão na etapa 3.3.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Use as instruções a seguir para Mac OS.
    1. Na pasta Downloads, clique no menu File e selecione Open para extrair os arquivos para o computador local (consulte a Figura 4A).
    2. No local do arquivo extraído, abra a pasta chamada nuclei_counter-main. Este é o repositório de código.
      NOTA: Isso só precisa ser baixado na primeira vez que este programa for usado; Basta mover os arquivos extraídos para um local de rede acessível e anotar esse local.
    3. Abra um terminal pressionando command + barra de espaço que abre o holofote; Em seguida, pesquise "terminal".
    4. Use o comando cd para alterar o diretório para o repositório de código e pressione Enter. Consulte a linha de código abaixo, que diferencia maiúsculas de minúsculas. Digite o caminho do arquivo em um documento de texto e copie-o para o terminal. Certifique-se de que o caminho do arquivo comece com o texto imediatamente anterior ao cd (por exemplo, /Users/userid na Figura 4B). Exemplo de linha de comando: /Users/janedoe›cd /Users/janedoe/Desktop/nuclei_counter-main
    5. Na próxima linha de comando, um cifrão aparecerá após o ID do usuário (consulte a Figura 4B). Certifique-se de que haja um espaço após o cifrão e digite o seguinte, incluindo o espaço e o ponto no final do comando. Inclua a versão apropriada do Python imediatamente após pip sem um espaço: pip3 install -e .
      NOTA: As etapas 3.4.5 e 3.4.6 só precisam ser concluídas na primeira vez que este programa for executado em qualquer computador. Se isso já tiver sido concluído, vá para a etapa 3.4.7. O processo de instalação pode levar alguns instantes para inicializar.
    6. Pressione Enter. A execução desse comando instala as bibliotecas necessárias para executar esse script e instala o repositório em um modo editável nos ajustes de código de evento necessários.
    7. Na próxima linha de comando, certifique-se de que haja um espaço após o cifrão e digite o seguinte para alterar o diretório para o diretório principal do código-fonte (consulte a Figura 4C):
      CD "nuclei_counter"
    8. Na próxima linha de comando, digite a linha de comando abaixo. Substitua o número após Python pelo número de versão correto se estiver usando uma versão diferente de 3. Em seguida, pressione Enter (consulte a Figura 4C):
      python3 count_nuclei.py --img_dir "caminho/para/imagens" --output_dir " caminho/para/saída" --save_images --output_count_filename "results.csv"
      onde caminho/para/imagens é o caminho do arquivo para a pasta que contém as imagens a serem analisadas (etapa 1.14); path/to/output é o caminho do arquivo para a pasta onde o arquivo .csv deve ser salvo (o padrão é o diretório de trabalho atual quando não fornecido); e results.csv é o nome do arquivo no qual as contagens resultantes serão salvas (se não for fornecido, o nome do arquivo de saída será padronizado para count_results.csv).
      NOTA: As aspas são necessárias na linha de comando. Certifique-se de que não haja espaços após aspas antes do caminho do arquivo. O script Python lerá os arquivos no caminho do arquivo fornecido e executará o programa de contagem de núcleos para todas as imagens no diretório (consulte a Figura 4C). As contagens resultantes serão salvas nos resultados .csv arquivo no local especificado.
    9. Quando a próxima linha de comando for exibida, o processamento estará concluído (consulte a Figura 4C). Os contornos e a planilha de resultados agora estão disponíveis no local especificado como o diretório de saída na etapa 3.4.8 (ou seja, caminho/para/saída).
  2. Inspecione visualmente os contornos para verificar a qualidade da contagem. Os resultados agora podem ser usados para normalizar os dados, conforme descrito na Seção 4.
    NOTA: Se os contornos parecerem ter núcleos perdidos (por exemplo, núcleos parecem muito fracos) ou agrupar grupos de núcleos em um único item (por exemplo, imagem superexposta, muito fundo, artefatos), o usuário deve consultar a Tabela 1 e pode precisar retornar à Seção 1 para otimizar a aquisição da imagem antes de passar para a Seção 4.

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Figura 4: Exemplos de partes importantes do fluxo de trabalho para a seção 3 usando o Mac OS. Depois de baixar o código (ver Figura 3A), (A) extraia clicando no arquivo Zip (mostrado em azul) e definindo o destino desejado. (B) Depois de abrir o terminal, exemplos de comandos para as etapas 3.4.4 (alterar o diretório para o repositório de código) e 3.4.5 (instalar o pip). (C) Exemplos de comandos para as etapas 3.4.7 e 3.4.8, uma barra de progresso após a execução da etapa 3.4.8 e a linha de comando mostrando a conclusão na etapa 3.4.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Usando contagens para normalizar dados experimentais

  1. Abra o arquivo results.csv que vincula cada imagem com a quantificação de núcleos determinada usando o programa automatizado.
  2. Decida sobre o método de normalização: 1) imagem por imagem (por exemplo, se microscopia de fluorescência multicolorida), 2) normalizar os dados como uma proporção da contagem média de núcleos por amostra versus uma amostra de referência (ou condição), 3) normalizar para a contagem de núcleos por amostra (por exemplo, extrapolar a contagem total de núcleos para a área da amostra). As recomendações para o método de normalização estão na seção Discussão.
    1. Se a normalização for realizada imagem por imagem, basta dividir os dados experimentais de cada imagem pelo número de núcleos dessa imagem.
    2. Para normalizar os dados como uma proporção, siga as etapas descritas abaixo.
      1. Para quaisquer amostras em que várias imagens foram coletadas para uma única réplica (por exemplo, 10-15 imagens capturadas de um único poço em uma placa de 6 poços), calcule o número médio de núcleos por imagem. Essas contagens de núcleos são consideradas como a contagem de células assumindo células uninucleadas ou um número de células fundidas em células multinucleadas (como com miotubos).
      2. Selecione uma amostra de referência ou uma condição de referência (por exemplo, contagem média em todas as amostras da condição de controle) e anote a contagem.
      3. Divida a contagem de todas as amostras por essa contagem de referência, resultando em um valor de normalização. Se uma amostra de referência foi usada, use o valor de normalização para a amostra de referência como 1.
        NOTA: Se uma condição de referência fosse usada, o valor médio de normalização na condição agora seria 1. Amostras com menos núcleos do que a referência (ou seja, menos densas) terão valores de normalização menores que 1, e amostras com mais núcleos do que a referência (ou seja, mais densas) terão valores de normalização maiores que 1.
      4. Divida os dados experimentais de cada poço pelo valor de normalização calculado correspondente.
    3. Para normalizar os dados para a contagem de núcleos por amostra, siga as etapas descritas abaixo.
      1. Para quaisquer amostras em que várias imagens foram coletadas para uma única réplica (por exemplo, 10-15 imagens capturadas de um único poço em uma placa de 6 poços), calcule o número médio de núcleos por imagem. Essas contagens de núcleos são consideradas como a contagem de células assumindo células uninucleadas, ou número de células fundidas em células multinucleadas (como com miotubos).
      2. Determine a área de superfície da lâmina (lamínula), poço ou prato do qual os dados foram derivados. Essas informações podem ser encontradas na seção de especificações nos sites dos produtos.
      3. Determine a área de cada imagem capturada. Essas informações geralmente estão disponíveis como metadados no software de imagem ou análise.
      4. Certifique-se de que a área da superfície da amostra e a área da imagem sejam expressas nas mesmas unidades (por exemplo, mm2). Caso contrário, converta para a unidade desejada.
      5. Calcule a contagem total para cada amostra usando a seguinte equação:
        TC = AC • (SA/IA)
        onde TC é a contagem total, AC é a contagem média, SA é a área de superfície, IA é a área da imagem.
      6. Divida os dados experimentais pelo TC correspondente para a amostra.
  3. Normalize os dados experimentais e use para análises estatísticas, conforme apropriado.

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Resultados

Cada execução de imagem em lote produz: 1) um conjunto de arquivos de imagem com contornos aplicados mostrando os contornos dos núcleos identificados (Figura 5) e 2) um arquivo de .csv (planilha) vinculando os nomes dos arquivos de imagem e as contagens associadas. A visualização dos contornos permitirá que o usuário avalie visualmente a qualidade da contagem. Especificamente, as imagens obtidas de acordo com a seção 1 devem ter todos (ou quase todos) os núcl...

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Discussão

Nosso programa de quantificação de núcleos tem várias vantagens sobre as opções existentes: requer apenas habilidades tecnológicas mínimas, é validado para a tarefa específica de quantificação de núcleos e é de código aberto; o último supera as barreiras relacionadas aos custos. Em última análise, este programa fornece aos biólogos celulares e moleculares uma opção adicional para quantificar núcleos com rapidez e precisão em imagens capturadas usando microscopia de fluorescência. Os prog...

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Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

O financiamento para este trabalho foi fornecido pelos Institutos Nacionais de Saúde/Instituto Nacional do Envelhecimento (R01AG084597; DEL e HYL) e por fundos iniciais da Texas Tech University (DEL). Os autores gostariam de agradecer aos programas Texas Tech University Undergraduate Research Scholars e TrUE Scholars por fornecer apoio financeiro aos pesquisadores de graduação que contribuíram para este trabalho (REH, MRD, CJM, AKW). Também agradecemos aos Drs. Lauren S. Gollahon e Michael P. Massett por compartilharem graciosamente seu espaço e equipamentos de laboratório.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Computador com acesso ao arquivo de resultados do método 2 ou 3-Consulte a etapa 2.6 (para o Método 2) ou a etapa 3.3.9 ou 3.4.9 (para o Método 3)
Computador com acesso à Internet, navegador moderno- porexemplo, Google Chrome
Computador com acesso à Internet, navegador moderno e sistema operacional WindowsVariaVariaPara Mac, Linux ou outro sistema operacional, use o Método 3
Computador com software para captura de imagemZeissAxioVisionOutro software é aceitável; deve ser compatível com o microscópio de fluorescência
Localização do arquivo para saída (planilha de resultados e contornos de imagem)-Pode ser uma pasta nova e vazia
Microscópio de fluorescênciaZeissAxiovert 200MOutros microscópios de fluorescência são aceitáveis; devem ser equipados com cubos de filtro apropriados, objetiva desejada e câmera 
Pasta contendo todas as imagens a serem quantificadas-Veja a etapa 1.12
Python versão 3.10 ou superiorPython-Disponível para download gratuito e instalação em https://www.python.org/downloads/ 
Amostras a serem visualizadas-Fixas ou vivas, coradas ou contracoradas com corantes de DNA fluorescente
Software de planilhaMicrosoftExcelSoftware de planilha semelhante também é aceitável

Referências

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