Usando bibliotecas de visão computacional para simplificar a quantificação de núcleos

Summary

Este artigo descreve métodos passo a passo para automatizar a quantificação de núcleos baseada em imagem usando um programa executável de código aberto validado em uma variedade de densidades de células. Este programa fornece uma alternativa que aborda as barreiras relacionadas ao custo, acessibilidade para usuários com habilidades tecnológicas limitadas e validação específica do aplicativo que pode limitar a utilidade das tecnologias existentes.

Abstract

Ensaios de células vivas e análises de células baseadas em imagem requerem normalização de dados para uma interpretação precisa. Um método comumente usado é corar e quantificar núcleos, seguido de normalização de dados para contagem de núcleos. Essa contagem de núcleos é frequentemente expressa como contagem de células para células uninucleadas. Embora a quantificação manual possa ser trabalhosa e demorada, os métodos automatizados disponíveis podem não ser preferidos por todos os usuários, podem não ter validação para essa aplicação específica ou podem ter um custo proibitivo. Aqui, fornecemos instruções passo a passo para capturar imagens quantificáveis de núcleos corados com colorações de DNA fluorescente e, posteriormente, quantificar os núcleos usando um programa de software automatizado de contagem de objetos desenvolvido usando bibliotecas de visão computacional Python. Também validamos este programa em uma variedade de densidades de células. Embora o tempo exato para a execução do programa varie de acordo com o número de imagens e hardware do computador, este programa consolida horas de trabalho contando núcleos em segundos para que o programa seja executado. Embora este protocolo tenha sido desenvolvido usando imagens de células fixas e coradas, imagens de núcleos corados em células vivas e aplicações de imunofluorescência também podem ser quantificadas usando este programa. Em última análise, este programa oferece uma opção que não requer um alto grau de habilidade tecnológica e é uma alternativa validada e de código aberto para ajudar os biólogos celulares e moleculares a simplificar seus fluxos de trabalho, automatizando a tarefa tediosa e demorada de quantificação de núcleos.

Introduction

Experimentos funcionais e baseados em imagens são essenciais para a compreensão dos impactos dos tratamentos experimentais na bioquímica e fisiologia de células inteiras. A interpretação válida dos dados de experimentos de biologia celular depende da precisão e reprodutibilidade do protocolo experimental, incluindo a normalização dos dados. Por exemplo, análises do consumo de oxigênio e das taxas de acidificação extracelular em células vivas no início e após o tratamento com drogas específicas permitem avaliar vários aspectos do metabolismo energético ^1,2. Medir a atividade de....

Protocol

NOTA: Arquivos suplementares podem ser encontrados no seguinte link https://osf.io/a2s4d/?view_only=2d1042eb8f7c4c4a84579fe4e84fb03c

1. Captura e salvamento de imagens usando microscopia de fluorescência

1. Prepare amostras de células ou tecidos a serem visualizadas, incluindo coloração com o corante de DNA desejado. Para obter as imagens aqui utilizadas, mioblastos C2C12 (CRL-1772, American Type Culture Collection) foram cultivados em placas de 6 poços por 48-72 h sob condições de cultura padrão (5% CO₂, 37 °C, umidificado), com ou sem 50 mM EtOH⁶, e fixados em metanol gelado conforme descrit....

Results

Cada execução de imagem em lote produz: 1) um conjunto de arquivos de imagem com contornos aplicados mostrando os contornos dos núcleos identificados (Figura 5) e 2) um arquivo de .csv (planilha) vinculando os nomes dos arquivos de imagem e as contagens associadas. A visualização dos contornos permitirá que o usuário avalie visualmente a qualidade da contagem. Especificamente, as imagens obtidas de acordo com a seção 1 devem ter todos (ou quase todos) os núcl.......

Discussion

Nosso programa de quantificação de núcleos tem várias vantagens sobre as opções existentes: requer apenas habilidades tecnológicas mínimas, é validado para a tarefa específica de quantificação de núcleos e é de código aberto; o último supera as barreiras relacionadas aos custos. Em última análise, este programa fornece aos biólogos celulares e moleculares uma opção adicional para quantificar núcleos com rapidez e precisão em imagens capturadas usando microscopia de fluorescência. Os prog.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computador com acesso ao arquivo de resultados do método 2 ou 3		-	Consulte a etapa 2.6 (para o Método 2) ou a etapa 3.3.9 ou 3.4.9 (para o Método 3)
Computador com acesso à Internet, navegador moderno		- por	exemplo, Google Chrome
Computador com acesso à Internet, navegador moderno e sistema operacional Windows	Varia	Varia	Para Mac, Linux ou outro sistema operacional, use o Método 3
Computador com software para captura de imagem	Zeiss	AxioVision	Outro software é aceitável; deve ser compatível com o microscópio de fluorescência
Localização do arquivo para saída (planilha de resultados e contornos de imagem)		-	Pode ser uma pasta nova e vazia
Microscópio de fluorescência	Zeiss	Axiovert 200M	Outros microscópios de fluorescência são aceitáveis; devem ser equipados com cubos de filtro apropriados, objetiva desejada e câmera
Pasta contendo todas as imagens a serem quantificadas	-		Veja a etapa 1.12
Python versão 3.10 ou superior	Python	-	Disponível para download gratuito e instalação em https://www.python.org/downloads/
Amostras a serem visualizadas		-	Fixas ou vivas, coradas ou contracoradas com corantes de DNA fluorescente
Software de planilha	Microsoft	Excel	Software de planilha semelhante também é aceitável