Artigo de método

Detecção baseada em fluorescência da atividade da nuclease FEN1 e triagem de inibidores de moléculas pequenas

DOI:

10.3791/67968

⸱

27 de junho de 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemistry and Life Sciences, Suzhou University of Science and Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Molecular Target Therapy and Companion Diagnostics in Oncology, Suzhou Vocational Health College, 3Jiangsu Province Engineering Research Center of Development and Translation of Key Technologies for Chronic Disease Prevention and Control, Suzhou Vocational Health College

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo descreve um ensaio bioquímico de mudança de gel para medir a atividade de FEN1 (Flap Endonuclease 1) e o desenvolvimento de inibidores.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FEN1 (Flap Endonuclease 1) é uma nuclease de DNA chave envolvida na replicação do DNA e reparo de danos, desempenhando um papel crucial na manutenção da estabilidade genômica. Níveis elevados de atividade do FEN1 estão intimamente associados ao desenvolvimento de vários tipos de câncer, tornando o FEN1 um biomarcador reconhecido e alvo de drogas para câncer de pulmão, mama e próstata. Os métodos convencionais de marcação de radioisótopos para detectar a atividade da nuclease FEN1 apresentam desafios em termos de conveniência e segurança. Neste estudo, um substrato de fragmento de DNA com estrutura de retalho foi sintetizado in vitro. Este substrato é marcado com um fluoróforo na extremidade 5' do retalho, permitindo que a nuclease FEN1 reconheça e clive especificamente o local designado. A atividade do FEN1 foi então determinada pela detecção do sinal do fluoróforo após eletroforese em gel. Este método permite a avaliação rápida e eficaz da atividade da nuclease FEN1 e a triagem de seus inibidores. Ele fornece uma abordagem sensível e específica para analisar a atividade do FEN1 e avaliar a eficácia de inibidores de moléculas pequenas. Além disso, contribui significativamente para a pesquisa sobre reparo de danos ao DNA e desenvolvimento do câncer, oferecendo uma nova estratégia para pesquisa clínica sobre mecanismos de doenças e detecção de substâncias genotóxicas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A replicação do DNA nem sempre é perfeita e pode ser interrompida por fatores internos e externos. Consequentemente, os mecanismos de replicação do DNA e reparo de danos são vitais para a sobrevivência celular e a estabilidade do genoma. Nesse processo, a endonuclease específica da estrutura ramificada humana FEN1 (Flap Endonuclease 1), uma nuclease central do DNA, desempenha um papel crucial 1,2,3.

O FEN1 está envolvido principalmente na replicação do DNA e é indispensável para a maturação de fragmentos de Okazaki na fita atrasada 4,5. Isso garante a progressão eficiente da replicação do DNA e o reparo preciso do DNA danificado. No entanto, aumentos anormais nos níveis de FEN1 têm sido intimamente ligados ao desenvolvimento de vários tipos de câncer 6,7, como câncer de pulmão e mama7. Assim, o FEN1 não é apenas essencial para a replicação e reparo do DNA, mas também atraiu atenção significativa como um biomarcador para o diagnóstico de câncer e um potencial alvo terapêutico 8,9. A detecção da atividade do FEN1 é essencial para o diagnóstico precoce de cânceres e para o avanço da pesquisa sobre terapias direcionadas.

Dada a importância do FEN1 e a necessidade de estudar sua atividade para o diagnóstico precoce do câncer e o desenvolvimento de terapias direcionadas, o objetivo principal do método desenvolvido neste experimento foi medir com precisão e eficiência a atividade da nuclease do FEN1. Este método visa fornecer uma plataforma confiável para a triagem de inibidores de moléculas pequenas direcionados ao FEN1. Ao atingir esses objetivos, o estudo busca contribuir para uma melhor compreensão do papel da FEN1 no câncer e facilitar a descoberta de novas estratégias terapêuticas.

Existem inúmeras técnicas para detectar a atividade da nuclease FEN1, cada uma com características, princípios, vantagens, limitações e cenários aplicáveis distintos. Por exemplo, os métodos de eletroforese em gel e separação de substrato baseados em HPLC fornecem resultados intuitivos, mas envolvem procedimentos complicados e baixo rendimento10,11. Os ensaios de polarização de fluorescência (FP) enfrentam desafios na avaliação da atividade do FEN1 devido à interferência da autofluorescência composta ou espalhamento de luz, que afeta os sinais de FP. Embora as estratégias de contra-triagem possam excluir parcialmente falsos positivos, aproximadamente 15% dos compostos ativos primários ainda são identificados erroneamente devido à interferência técnica12. O uso combinado de pares doadores/atenuadores de fluorescência (por exemplo, TAMRA/BHQ-2) e quimioluminescência AlphaScreen apresenta desvantagens, como o alto custo de síntese de substratos fluorescentes complexos de aba tripla, limitando particularmente sua utilidade na triagem em larga escala. Além disso, a estrutura de aba dupla dos substratos pode impedir a ligação ideal com FEN1, reduzindo a eficiência da clivagem enzimática e comprometendo a sensibilidade de detecção. Além disso, essa abordagem depende fortemente de instrumentos especializados (por exemplo, ViewLux, EnVision), restringindo sua adoção em laboratórios com recursos limitados 13,14,15. Métodos de detecção fluorescente baseados em nanossondas de DNA em forma de haltere de aba dupla funcionalizadas com nanoclusters de prata (DNA-AgNCs) sofrem variabilidade de lote para lote devido à sua dependência de etapas precisas de recozimento e nucleação in situ, dificultando a reprodutibilidade e escalabilidade. Custos elevados e procedimentos morosos limitam ainda mais a sua aplicação prática16.

Neste artigo, um ensaio baseado em marcação de fluorescência é desenvolvido para abordar as limitações técnicas atuais e atender à crescente demanda por métodos mais seguros e acessíveis ao usuário para estudar a atividade do FEN1. Essa técnica aproveita a especificidade e a alta sensibilidade da detecção de fluorescência, bem como a capacidade de projetar substratos de DNA com estruturas definidas que podem ser reconhecidas e clivadas por FEN1 (Figura 1). Este método agiliza os procedimentos experimentais, mantendo alta precisão na avaliação da atividade da nuclease FEN1. Comparado com a eletroforese em gel tradicional e as técnicas baseadas em HPLC, oferece operação simplificada e retorno mais rápido. Ao contrário dos ensaios de polarização de fluorescência, essa abordagem permite uma triagem qualitativa rápida de compostos, estabelecendo uma estratégia eficiente para avaliação enzimática preliminar.

Este método é adequado para estudar a atividade da nuclease FEN1 em ambientes de laboratório onde o acesso a materiais radioativos é limitado. Também é adequado para rastrear um grande número de inibidores de moléculas pequenas em um tempo relativamente curto, especialmente quando alta sensibilidade e especificidade são necessárias. No entanto, não é ideal para estudos que requerem quantificação absoluta com altíssima precisão ou para laboratórios que não possuem equipamentos básicos de detecção de fluorescência e experiência em análise de sinais de fluorescência. Para estudos com foco em aplicações in vivo - onde o comportamento do FEN1 pode ser influenciado por fatores biológicos complexos não replicados nos projetos atuais de ensaios in vitro - pode ser necessário um refinamento adicional ou métodos alternativos.

Este ensaio de fluorescência é altamente sensível e específico, fornecendo uma ferramenta segura, conveniente e eficaz para estudar a atividade do FEN1 e desenvolver seus inibidores.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Purificação da expressão da proteína FEN1

  1. Purificação de proteínas
    1. Remover o stock bacteriano que contém o plasmídeo alvo (ver Tabela de Materiais) a partir de -80 °C. Descongele à temperatura ambiente e inocule 200 μL dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL congelados em meio LB de 20 mL contendo 50 μg / mL de canamicina usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
      NOTA: A cepa é E. coli BL21 (DE3) -FEN1.
    2. Incubar a 37 °C com agitação a 160 rpm durante 12 h.
    3. Transferir a suspensão bacteriana para um Erlenmeyer de 200 ml contendo LB Continue a incubação a 37 °C com agitação a 160 rpm por 2-3 h.
    4. Quando o OD600 da cultura atingir aproximadamente 0,6, adicione 2 mL de IPTG (concentração final: 1 mM). Continuar a incubação a 25 °C, 160 rpm durante 10 h.
    5. Transfira a cultura induzida para um tubo de centrífuga pré-pesado de 50 mL. Centrifugue a 4 °C e 2500 × g durante 15 min. Descarte o sobrenadante. Pesar o tubo que contém o pellet e subtrair o peso do tubo vazio para calcular a massa do pellet.
    6. Adicione 7 mL de tampão de lise por grama de pellet de célula úmida. Use uma pipeta para ressuspender completamente o pellet, pipetando para cima e para baixo.
      NOTA: O tampão de lise (10 mL no total) contém 20 mM de Tris-HCl, 250 mM de NaCl, 2% de Triton X-100 e ddH2O. Execute esta etapa em uma capela de exaustão para garantir o manuseio seguro de reagentes químicos.
    7. Transfira a suspensão bacteriana em tampão de lise para um freezer de -80 ° C e congele durante a noite. No dia seguinte, descongele a suspensão em um agitador a 4 °C por 1 h para aumentar a eficiência da lise.
    8. Lise as células usando ultrassom com 75% de potência por 45 min. Centrifugar o lisado a 12.000 × g durante 20 min a 4 °C para separar o sobrenadante do sedimento.
      NOTA: Se o lisado permanecer turvo, aumente o volume do tampão de lise ou repita os ciclos de congelamento e descongelamento. Um inibidor de nuclease também pode ser adicionado para preservar a integridade da proteína e evitar a degradação.
    9. Aplicar o sobrenadante clarificado ao longo da parede de um tubo contendo resina de purificação de proteínas preparada. Lave com 10 mL de tampão de eluição para remover proteínas não especificamente ligadas.
      NOTA: O tampão de eluição contém 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM de NaCl, 2% de Triton X-100, 200 mM de imidazol e água destilada.
    10. Eluir a proteína FEN1 adicionando 5 mL de tampão de eluição ao longo da parede interna do tubo.
  2. Identificação de proteínas-alvo por coloração rápida de azul brilhante de Coomassie
    1. Prepare os géis SDS-PAGE usando 12% de gel de separação e 5% de gel de empilhamento de acordo com o tamanho esperado de FEN1.
    2. Misture a amostra de proteína alvo e o padrão BSA com tampão de amostra de 5× na proporção de 1:4. Aqueça a mistura a 95 °C por 5 min para desnaturar completamente as proteínas.
    3. Carregue 20 μL de cada uma das amostras de proteína padrão e desnaturada da BSA em poços separados do gel SDS-PAGE.
    4. Conecte o aparelho de eletroforese. Defina a tensão para 90 V e funcione por 1 h e 40 min.
    5. Após a eletroforese, transfira o gel para um recipiente de coloração. Enxágüe com água deionizada, adicione 30 mL de solução de coloração de proteína e core por 25 min. Recupere a solução de coloração, enxágue o gel com 20 mL de água deionizada e descolore durante a noite em um agitador horizontal.
    6. Após a descoloração, coloque o gel em uma placa de plástico transparente e observe as bandas de proteína sob luz branca.
      NOTA: Se as bandas estiverem fracas ou a concentração de proteína for baixa, concentre a amostra usando tubos de ultrafiltração. Esta etapa remove o excesso de solvente e pequenas moléculas, melhorando a concentração de proteínas e garantindo uma análise precisa em experimentos subsequentes.

2. Preparação do substrato de DNA marcado com FEN1 TAMRA

  1. Preparação de substrato de DNA marcado com TAMRA
    1. Projetar fitas de oligonucleotídeos de DNA com base na atividade de clivagem específica de FEN1, referindo-se aos métodos publicados17 (ver Tabela 1). A extremidade 5 'da sequência D1 é modificada com um rótulo TAMRA fluorescente.
    2. Adicione oligonucleotídeos de DNA de fita simples mistos a 10 μL de tampão de recozimento nos seguintes volumes: 5 μL de D1 (10 pmol/μL), 10 μL de T1 (10 pmol/μL) e 7,5 μL de U2 (10 pmol/μL). Adicione água deionizada para elevar o volume total a 50 μL.
      NOTA: O tampão de recozimento contém 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5) e 10 mM de MgCl2.
    3. Aquecer a mistura de reacção num banho metálico a 100 °C durante 1 min e, em seguida, transferi-la imediatamente para 72 °C durante 10 min18.
      NOTA: O substrato final do DNA tem 80 nucleotídeos de comprimento. A alta temperatura inicial (100 °C) garante a desnaturação, enquanto a temperatura de recozimento (72 °C) promove o emparelhamento preciso dos fios.
    4. Desligue a fonte de calor e deixe a solução esfriar gradualmente até a temperatura ambiente, formando o substrato completo de DNA de fita dupla.
  2. Ensaio de substrato de DNA marcado com TAMRA
    1. Prepare um gel de poliacrilamida desnaturante a 12% misturando 4,8 mL de acrilamida a 30% (29:1), 4,32 mL de uréia 6 M, 2,4 mL de 5× TBE, 50 μL de APS a 10%, 5 μL de TEMED e 0,48 mL de água deionizada. Misture bem para preparar o gel.
    2. Colocar o gel num forno a 37 °C durante 30 min para solidificar.
    3. Para detecção, pipete 2 μL do substrato de DNA sintetizado em 18 μL de água destilada e adicione 7,7 μL de Stop Buffer.
    4. Para referência, pipete 2 μL de D1 marcado com TAMRA em 18 μL de água destilada e adicione 7,7 μL de Stop Buffer.
    5. Carregue 20 μL de cada amostra preparada no gel e execute a eletroforese SDS-PAGE para analisar a formação do substrato de DNA.

3. Ensaio de atividade de nuclease FEN1

  1. Ensaio de atividade enzimática FEN1
    1. Preparar 20 μL de mistura de reacção combinando 2 μL de substrato de ADN com nuclease FEN1 no tampão de reacção.
      NOTA: O tampão de reação consiste em 100 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM de MgCl2, 2 mM de DTT, 0,2 mg/mL de BSA e água deionizada.
    2. Incubar a mistura de reação a 37 °C em um banho de metal por 15 min.
    3. Termine a reação adicionando 20 μL de tampão de terminação 2×.
    4. Carregue 20 μL da amostra reagida em um gel de poliacrilamida desnaturante a 12% pré-preparado e realize eletroforese a 100 V por 60 min.
    5. Após a eletroforese, visualize os resultados usando um sistema de imagem de fluorescência (via 600).

4. Triagem de inibidores de pequenas moléculas da nuclease FEN1

  1. Triagem de inibidores de moléculas pequenas
    1. Use uma pipeta para transferir 2 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Adicione 2 μL de nuclease FEN1 e 10 μL de tampão de reação 2× ao tubo.
    3. Misture bem e incube a mistura no gelo por 10 min.
    4. Adicione 2 μL de substrato de DNA e 4 μL de água deionizada, misture bem para trazer o volume total da reação para 20 μL.
    5. Preparar uma diluição de trabalho do inibidor da nuclease FEN1, FEN1-IN-4, efectuando uma diluição seriada dupla de uma solução-mãe 1 M em DMSO.
    6. Pipete 2 μL de nuclease FEN1 (0,03 μg/μL) e 2 μL do inibidor diluído de FEN1-IN-4 em um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicione 10 μL de tampão de reação 2× e 4 μL de água deionizada. Misture delicadamente e incube no gelo por 10 min para garantir interação suficiente entre o inibidor e a enzima.
    7. Adicione 2 μL de substrato de DNA ao tubo para formar uma mistura final de reação de 20 μL.
    8. Incubar a reação a 37 °C em banho de metal durante 15 min.
    9. Termine a reação adicionando 20 μL de tampão de terminação 2×.

5. Avaliação da potência inibitória do inibidor de FEN1 - IN-4 de pequenas moléculas

  1. Use uma micropipeta para absorver 10 μL de tampão de reação 2× e adicione-o a um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Adicione 2 μL de nuclease FEN1 a uma concentração de 0,03 μg/μL, bem como 2 μL de inibidor FEN1-IN-4 de FEN1 em diferentes concentrações.
    NOTA: Múltiplos gradientes de concentração devem ser estabelecidos de acordo com os requisitos experimentais.
  3. Adicione 4 μL de água deionizada e misture bem a solução. Coloque o tubo de microcentrífuga de 1,5 mL no gelo e incube por 10 min.
  4. Adicione 2 μL de substrato de DNA de fita dupla ao tubo para formar um sistema de reação de 20 μL.
  5. Coloque o tubo EP em um banho de metal a 37 °C por 15 min.
  6. Após a conclusão da reação, adicione 20 μL de tampão de parada 2× à mistura de reação para encerrar a reação.
  7. Observe os resultados usando um dispositivo de imagem de fluorescência e plote a curva IC50 19.
    NOTA: A quantificação da intensidade de fluorescência foi realizada usando Fiji/ImageJ20, seguida de análise estatística e visualização com gráficos e software de análise21.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conforme mostrado na Figura 2A, o reagente de coloração se liga à proteína, fazendo com que a proteína apareça como uma faixa azul no gel. A primeira faixa contém a proteína marcada usada como referência de peso molecular, na qual a banda de proteína padrão BSA corresponde a um peso molecular de 70 kDa, e a banda de proteína de ácido nucleico FEN1 corresponde a um peso molecular de 45 kDa. Os resultados experimentais mostraram que a nuclease FEN1 apareceu como uma banda clara em aproximadame...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O ensaio de atividade da nuclease FEN1 e a triagem de inibidores de pequenas moléculas são fundamentais para a pesquisa sobre reparo de danos ao DNA e desenvolvimento de câncer. Em comparação com as técnicas tradicionais de radiomarcação, o presente método oferece uma alternativa econômica, eficiente, fácil de operar e mais segura. Além disso, ao contrário dos ensaios FEN1 baseados em explosão de fluorescência, essa abordagem fornece uma visualização mais intuitiva da clivagem do substra...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pela Equipe de Pesquisa Inovadora para Ciência e Tecnologia da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu (2021), Programa do Centro de Pesquisa de Tecnologia de Engenharia da Faculdade Vocacional de Jiangsu (2023), Programa de Tecnologia-Chave dos Projetos de Tecnologia de Subsistência do Povo de Suzhou (SYWD2024099), Projeto do Laboratório Estadual de Medicina e Proteção contra Radiação, Universidade de Soochow (GZK12023013), Programas da Faculdade de Saúde Vocacional de Suzhou (SZWZYTD202201, SZWZYTD202205) e Projeto Qing-Lan da província de Jiangsu na China (2021, 2022).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
1 M Tris-HCLBeyotimeST774
30% Acr-Bis (29:1)BeyotimeST003-500ml
5M NaclBeyotimeST347
BeyoBlue PlusBeyotimePág. 0003S
BL21 (DE3) -FEN1VazymeC504-F1
BSABeyotimePág. P0007
Descolorando shakerKylin-BellTS-100
DL-DitiotreitolBeyotimeST041
Incubadora de banho secoRUICHENGDH200
Aparelho de eletroforeseBei jing Liuyi BiotecnologiaDDY-6D
FEN1-EM-4AlvoMOLT8545
IPTGTakaba9030
Slufate de canamicinaBiosharpBS152
Centrífuga de laboratórioThermoSL 16R
Caldo LBSolarbioL8291
Ni-NTA Sua Resina de Ligação7se biotecnologiaPANF001-001C
Odisseia FCODISSÉIALI-COR
PÁGINA SDSBeyotimePág. 0015L
Trição-x-100ShyuanyeS15022

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, S., et al. Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China. J Virol. 94 (11), e00149(2020).
  2. Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. Virophages of giant viruses: An update at eleven. Viruses. 11 (8), 733(2019).
  3. Paez-Espino, D., et al. Diversity, evolution, and classification of virophages uncovered through global metagenomics. Microbiome. 7 (1), 157(2019).
  4. Zheng, L., et al. Functional regulation of FEN1 nuclease and its link to cancer. Nucleic Acids Res. 39 (3), 781-794 (2011).
  5. Yang, F., Hu, Z., Guo, Z. Small-molecule inhibitors targeting FEN1 for cancer therapy. Biomolecules. 12 (7), 946(2022).
  6. Wang, Z., et al. Inhibition of FEN1 promotes DNA damage and enhances chemotherapeutic response in prostate cancer cells. Med Oncol. 40 (8), 242(2023).
  7. Abdel-Fatah, T. M., et al. Genomic and protein expression analysis reveals flap endonuclease 1 (FEN1) as a key biomarker in breast and ovarian cancer. Mol Oncol. 8 (7), 1326-1338 (2014).
  8. Guo, E., et al. FEN1 endonuclease as a therapeutic target for human cancers with defects in homologous recombination. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (32), 19415-19424 (2020).
  9. Zhao, E., Zhou, C., Chen, S. Flap endonuclease 1 (FEN1) as a novel diagnostic and prognostic biomarker for gastric cancer. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 45 (1), 101455(2021).
  10. Finger, L. D., et al. The 3'-flap pocket of human flap endonuclease 1 is critical for substrate binding and catalysis. J Biol Chem. 284 (33), 22184-22194 (2009).
  11. Liu, R., Qiu, J., Finger, L. D., Zheng, L., Shen, B. The DNA-protein interaction modes of FEN-1 with gap substrates and their implication in preventing duplication mutations. Nucleic Acids Res. 34 (6), 1772-1784 (2006).
  12. McWhirter, C., et al. Development of a high-throughput fluorescence polarization DNA cleavage assay for the identification of FEN1 inhibitors. J Biomol Screen. 18 (5), 567-575 (2013).
  13. Dorjsuren, D., Kim, D., Maloney, D. J., Wilson, D. M. 3rd, Simeonov, A. Complementary non-radioactive assays for investigation of human flap endonuclease 1 activity. Nucleic Acids Res. 39 (2), e11(2011).
  14. Van Pel, D. M., et al. An evolutionarily conserved synthetic lethal interaction network identifies FEN1 as a broad-spectrum target for anticancer therapeutic development. PLoS Genet. 9 (1), e1003254(2013).
  15. Tumey, L. N., et al. The identification and optimization of a N-hydroxy urea series of flap endonuclease 1 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 15 (2), 277-281 (2005).
  16. Tang, Y., Wei, W., Liu, Y., Liu, S. Fluorescent assay of FEN1 activity with nicking enzyme-assisted signal amplification based on ZIF-8 for imaging in living cells. Anal Chem. 93 (11), 4960-4966 (2021).
  17. Liu, S., et al. fragment maturation involves α-segment error editing by the mammalian FEN1/MutSα functional complex. EMBO J. 34 (13), 1829-1843 (2015).
  18. Zheng, L., Dai, H., Qiu, J., Huang, Q., Shen, B. Disruption of the FEN-1/PCNA interaction results in DNA replication defects, pulmonary hypoplasia, pancytopenia, and newborn lethality in mice. Mol Cell Biol. 27 (8), 3176-3186 (2007).
  19. Hilda, S., et al. Alginate-based 3D cell culture technique to evaluate the half-maximal inhibitory concentration: An in vitro model of anticancer drug study for anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid Res. 14 (1), 10(2021).
  20. Nadine, S. Microstructure analysis of polymer amended fluid fine tailings using Fiji-ImageJ image analysis software. , Carleton University Theses and Dissertations. (2022).
  21. Pablo, T. Quantifications figures 2-6 & supplemental fig. 1 (GraphPad Prism 8.1 files). Figshare. , (2019).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Detec o de Fluoresc nciaReparo de Danos ao DNAEletroforese em GelClivagem de Substrato de DNABiomarcador de C ncerTriagem de Alto RendimentoDNA de Fita DuplaTriagem de Inibidores

Artigos relacionados