Este protocolo descreve um ensaio bioquímico de mudança de gel para medir a atividade de FEN1 (Flap Endonuclease 1) e o desenvolvimento de inibidores.
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Artigo de método
Detecção baseada em fluorescência da atividade da nuclease FEN1 e triagem de inibidores de moléculas pequenas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
FEN1 (Flap Endonuclease 1) é uma nuclease de DNA chave envolvida na replicação do DNA e reparo de danos, desempenhando um papel crucial na manutenção da estabilidade genômica. Níveis elevados de atividade do FEN1 estão intimamente associados ao desenvolvimento de vários tipos de câncer, tornando o FEN1 um biomarcador reconhecido e alvo de drogas para câncer de pulmão, mama e próstata. Os métodos convencionais de marcação de radioisótopos para detectar a atividade da nuclease FEN1 apresentam desafios em termos de conveniência e segurança. Neste estudo, um substrato de fragmento de DNA com estrutura de retalho foi sintetizado in vitro. Este substrato é marcado com um fluoróforo na extremidade 5' do retalho, permitindo que a nuclease FEN1 reconheça e clive especificamente o local designado. A atividade do FEN1 foi então determinada pela detecção do sinal do fluoróforo após eletroforese em gel. Este método permite a avaliação rápida e eficaz da atividade da nuclease FEN1 e a triagem de seus inibidores. Ele fornece uma abordagem sensível e específica para analisar a atividade do FEN1 e avaliar a eficácia de inibidores de moléculas pequenas. Além disso, contribui significativamente para a pesquisa sobre reparo de danos ao DNA e desenvolvimento do câncer, oferecendo uma nova estratégia para pesquisa clínica sobre mecanismos de doenças e detecção de substâncias genotóxicas.
Introdução
A replicação do DNA nem sempre é perfeita e pode ser interrompida por fatores internos e externos. Consequentemente, os mecanismos de replicação do DNA e reparo de danos são vitais para a sobrevivência celular e a estabilidade do genoma. Nesse processo, a endonuclease específica da estrutura ramificada humana FEN1 (Flap Endonuclease 1), uma nuclease central do DNA, desempenha um papel crucial 1,2,3.
O FEN1 está envolvido principalmente na replicação do DNA e é indispensável para a maturação de fragmentos de Okazaki....
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Protocolo
Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Purificação da expressão da proteína FEN1
- Purificação de proteínas
- Remover o stock bacteriano que contém o plasmídeo alvo (ver Tabela de Materiais) a partir de -80 °C. Descongele à temperatura ambiente e inocule 200 μL dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL congelados em meio LB de 20 mL contendo 50 μg / mL de canamicina usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
NOTA: A cepa é E. coli BL21 (DE3) -FEN1. - Incubar a 37 °C co....
- Remover o stock bacteriano que contém o plasmídeo alvo (ver Tabela de Materiais) a partir de -80 °C. Descongele à temperatura ambiente e inocule 200 μL dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL congelados em meio LB de 20 mL contendo 50 μg / mL de canamicina usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
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Resultados
Conforme mostrado na Figura 2A, o reagente de coloração se liga à proteína, fazendo com que a proteína apareça como uma faixa azul no gel. A primeira faixa contém a proteína marcada usada como referência de peso molecular, na qual a banda de proteína padrão BSA corresponde a um peso molecular de 70 kDa, e a banda de proteína de ácido nucleico FEN1 corresponde a um peso molecular de 45 kDa. Os resultados experimentais mostraram que a nuclease FEN1 apareceu como uma banda clara em aproximadame.......
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Discussão
O ensaio de atividade da nuclease FEN1 e a triagem de inibidores de pequenas moléculas são fundamentais para a pesquisa sobre reparo de danos ao DNA e desenvolvimento de câncer. Em comparação com as técnicas tradicionais de radiomarcação, o presente método oferece uma alternativa econômica, eficiente, fácil de operar e mais segura. Além disso, ao contrário dos ensaios FEN1 baseados em explosão de fluorescência, essa abordagem fornece uma visualização mais intuitiva da clivagem do substra.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Equipe de Pesquisa Inovadora para Ciência e Tecnologia da Instituição de Ensino Superior de Jiangsu (2021), Programa do Centro de Pesquisa de Tecnologia de Engenharia da Faculdade Vocacional de Jiangsu (2023), Programa de Tecnologia-Chave dos Projetos de Tecnologia de Subsistência do Povo de Suzhou (SYWD2024099), Projeto do Laboratório Estadual de Medicina e Proteção contra Radiação, Universidade de Soochow (GZK12023013), Programas da Faculdade de Saúde Vocacional de Suzhou (SZWZYTD202201, SZWZYTD202205) e Projeto Qing-Lan da província de Jiangsu na China (2021, 2022).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCL | Beyotime | ST774 | |
| 30% Acr-Bis (29:1) | Beyotime | ST003-500ml | |
| 5M Nacl | Beyotime | ST347 | |
| BeyoBlue Plus | Beyotime | Pág. 0003S | |
| BL21 (DE3) -FEN1 | Vazyme | C504-F1 | |
| BSA | Beyotime | Pág. P0007 | |
| Descolorando shaker | Kylin-Bell | TS-100 | |
| DL-Ditiotreitol | Beyotime | ST041 | |
| Incubadora de banho seco | RUICHENG | DH200 | |
| Aparelho de eletroforese | Bei jing Liuyi Biotecnologia | DDY-6D | |
| FEN1-EM-4 | AlvoMOL | T8545 | |
| IPTG | Takaba | 9030 | |
| Slufate de canamicina | Biosharp | BS152 | |
| Centrífuga de laboratório | Thermo | SL 16R | |
| Caldo LB | Solarbio | L8291 | |
| Ni-NTA Sua Resina de Ligação | 7se biotecnologia | PANF001-001C | |
| Odisseia FC | ODISSÉIA | LI-COR | |
| PÁGINA SDS | Beyotime | Pág. 0015L | |
| Trição-x-100 | Shyuanye | S15022 |
Referências
- Xu, S., et al. Novel cell-virus-virophage tripartite infection systems discovered in the freshwater lake Dishui Lake in Shanghai, China. J Virol. 94 (11), e00149(2020).
- Mougari, S., Sahmi-Bounsiar, D., Levasseur, A., Colson, P., La Scola, B. Viro....
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Reimpressões e permissões
