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Artigo de método

Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

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DOI:

10.3791/67980

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11 de julho de 2025

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1Critical Care Medicine and Pulmonary Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Lymphocyte Biology Section and Center for Advanced Tissue Imaging, Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH, 3Leica Microsystems Inc., 4T Lymphocyte Biology Section, Laboratory of Parasitic Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Disease, National Institutes of Health

Neste artigo

Resumo

A implementação de uma técnica de fotoirradiação versátil e de baixo custo com o método IBEX manual permite imagens ideais de tecido humano com autofluorescência nativa significativa. Este protocolo detalha como obter imagens multiplexadas de lâminas inteiras de amostras clínicas arquivadas usando um microscópio invertido, reagentes amplamente disponíveis e software de código aberto para alinhamento e processamento de imagens.

Resumo

A prevalência de doença pulmonar por micobactérias não tuberculosas (MNT) vem aumentando globalmente. Embora a doença pulmonar induzida por MNT frequentemente se apresente com bronquiectasias, nódulos pulmonares e doença cavitária, a resposta do hospedeiro associada a esses padrões distintos de lesão pulmonar não foi bem caracterizada in situ. Procuramos avaliar os mecanismos da patologia induzida por MNT realizando uma análise fenotípica profunda de populações de células imunes no tecido pulmonar de indivíduos com doença por MNT em comparação com um padrão-ouro de inflamação granulomatosa, doença pulmonar tuberculosa (TB).

Bloqueios pulmonares fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) de pacientes com MNT disseminada, MNT pulmonar ou doença pulmonar por TB foram seccionados e corados seguindo uma versão modificada do método de imagem Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX). A otimização do método IBEX foi necessária primeiro para abordar a fluorescência endógena significativa das seções pulmonares devido à alta densidade de colágeno, elastina e eritrócitos nativos do tecido pulmonar que é agravada pela preservação do FFPE e pela idade dos blocos FFPE. Neste protocolo, detalhamos um protocolo de fotoirradiação e um método de recuperação de antígeno modificado que reduz a autofluorescência de amostras clinicamente arquivadas.

Além disso, fornecemos orientação sobre o design do painel de anticorpos, incluindo desafios comuns, como reatividade cruzada, perda de epítopos após fotoirradiação, sobreposição espectral entre fluoróforos adjacentes e baixa relação sinal-ruído para determinados alvos. Para facilitar a imagem eficiente de seções de tecido pulmonar inteiro, as lâminas foram fotografadas com um microscópio de campo amplo e pós-processadas com software de código aberto para melhorar a qualidade da imagem. Juntos, esse fluxo de trabalho atende a uma necessidade crítica, documentando como obter imagens de lâminas inteiras altamente multiplexadas e de alta resolução de amostras desafiadoras usando instrumentação e reagentes amplamente disponíveis. Além da imagem quantitativa de amostras clínicas, essas técnicas podem ser aplicadas a diversos tipos de amostras para superar fontes endógenas e exógenas de fluorescência.

Introdução

A tuberculose (TB) é uma das principais causas de morte, com aproximadamente 1,3 milhão de pessoas morrendo de infecção por TB a cada ano1. Embora não seja tão letal quanto a tuberculose, houve um aumento significativo de infecções pulmonares e subsequentes doenças causadas por micobactérias não tuberculosas (MNT) nos últimos anos2. No nível tecidual, a resposta imune do hospedeiro à infecção pulmonar por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) tem sido bem estudada e inclui a formação de granulomas, agregados heterogêneos de linfócitos, células dendríticas, macrófagos e neutrófilos3. Embora a inflamação granulomatosa também seja uma característica fundamental da imunidade do hospedeiro à infecção por MNT, as populações de células imunes e as características espaciais dessa resposta permanecem pouco estudadas. Obter uma compreensão detalhada dos componentes teciduais da imunopatologia versus cicatrização de feridas é fundamental para o desenvolvimento de tratamentos (por exemplo, terapias direcionadas ao hospedeiro) e estratégias terapêuticas preventivas (ou seja, vacinas).

Neste estudo, nossa equipe teve acesso a amostras clínicas raras e arquivadas adquiridas durante ressecções pulmonares ou autópsias de pacientes com infecção por Mtb ou NTM. A maioria dessas amostras tinha mais de 10 anos e foi preservada como amostras fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE), restringindo seu uso a ensaios histológicos. Para superar as limitações dos marcadores da imuno-histoquímica (IHQ) e da imunofluorescência (IF) tradicionais, utilizamos o método Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX), um método de imagem de código aberto e altamente multiplexado 4,5. A extensão do método IBEX para amostras de FFPE de pulmão humano exigiu otimização significativa devido aos altos níveis de fluorescência endógena, um obstáculo bem descrito para imagens baseadas em anticorpos multiplexados6.

Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para reduzir a autofluorescência usando um método de fotoirradiação otimizado para seções de tecido FFPE pulmonar 7,8. É importante ressaltar que o método descrito aqui utiliza uma caixa de luz barata e amplamente disponível que pode ser estendida a outras preparações de amostra com alta autofluorescência. Além de reduzir a autofluorescência antes da aquisição da imagem, fornecemos orientação sobre o design do painel de anticorpos, como emparelhar marcadores de baixa abundância com marcadores de fluoróforos brilhantes, avaliar o impacto da fotoirradiação na marcação de anticorpos e amplificação com anticorpos secundários em canais com alta fluorescência endógena. Em média, foram processadas cinco lâminas correspondentes a um corte de tecido, cada uma variando de 37 a 114 mm2. Finalmente, demonstramos como adquirir imagens de lâminas inteiras usando um instrumento de campo amplo. Em resumo, este protocolo descreve a adoção do IBEX para amostras clínicas arquivadas e, adicionalmente, oferece orientação sobre como solucionar problemas comumente encontrados com imagens de amostras altamente autofluorescentes.

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Protocolo

Cortes de tecido pulmonar de autópsia e ressecção cirúrgica arquivados foram coletados sob protocolo 09-H-0172 (NCT00943514), História Natural da Bronquiectasia, no Laboratório de Patologia do Centro Clínico do National Institutes of Health. Este protocolo foi aprovado pelo IRB e os participantes forneceram consentimento informado.

1. Recuperação automatizada de antígenos

NOTA: A desparafinização e a recuperação do antígeno foram realizadas usando uma plataforma automatizada de coloração de pesquisa (Figura 1). Trabalhos anteriores determinaram que uma abordagem de recuperação de antígeno duplo consistindo de 30 min com uma solução de recuperação de epítopos de pH 6 à base de citrato (ER1) e, em seguida, 30 min com uma solução de recuperação de epítopos de pH 9 à base de EDTA (ER2) produziu os melhores resultados de imunomarcação para tecidos FFPE9. Resultados comparáveis podem ser obtidos usando desparafinação manual e recuperação de antígeno duplo usando outros métodos descritos e suporte fornecido pela IBEX Imaging Community10,11.

  1. Reúna lâminas e suprimentos automatizados de recuperação de antígenos (tampas de lâminas, sistema de detecção de pesquisa, solução de recuperação de epítopos de pH 6 à base de citrato (ER1), solução de recuperação de epítopos de pH 9 à base de EDTA (ER2), etc.).
  2. Ligue o instrumento, deixe-o inicializar por 20 minutos, coloque o braço de detecção de pesquisa no instrumento e insira os recipientes de reagente na parte inferior da máquina.
  3. Abra o software, clique em configurar slide e selecione adicionar estudo e crie um novo nome para o estudo.
  4. Selecione adicionar slide e rotule os slides conforme desejado.
  5. Para seguir este protocolo, execute um protocolo de cozimento e desparafinação com um protocolo HIER composto por 30 min de ER1 e 30 min de ER2.
  6. Imprima etiquetas e coloque-as em cima dos slides. Remova o suporte de slides preto do instrumento e coloque os slides de interesse no rack. Coloque as tampas de slides transparentes em cada slide, devolva o rack de slides ao instrumento e pressione o botão abaixo do rack para solicitar que o instrumento execute a leitura de código de barras dos slides.
  7. Selecione play | ok e deixe a recuperação automatizada de antígenos começar com uma duração aproximada de 3 h.

2. Marcação de anticorpos antes da fotoirradiação

  1. Após a conclusão da recuperação do antígeno, mergulhe as lâminas em PBS.
    NOTA: Certos epítopos são sensíveis à fotoirradiação e se degradam após a exposição noturna ao LED. Os epítopos sensíveis devem ser determinados empiricamente e, quando descobertos, a imunomarcação desses epítopos deve ocorrer nesta etapa. Certifique-se de que a lâmina permaneça molhada o tempo todo após a recuperação do antígeno.
  2. Remova uma lâmina do PBS e seque todo o excesso de PBS na lâmina usando um pano sem fiapos; Tenha cuidado para não tocar no tecido. Desenhe uma borda ao redor do tecido com uma caneta hidrofóbica. Repita o processo para todos os slides restantes. Deixe a barreira hidrofóbica secar por 10 min.
  3. Prepare uma Câmara de Umidade Deslizante colocando uma pequena quantidade de água no fundo de cada poço. Coloque as lâminas na câmara de umidade da lâmina. Retire o PBS do tecido sem tocar diretamente na amostra de tecido.
  4. Adicione 200 μL de tampão de bloqueio (Tabela de Materiais) a cada lâmina. Coloque a Câmara de Umidade Deslizante em um micro-ondas científico sem aquecimento com um mecanismo para manter uma temperatura constante.
  5. Bloqueie a marcação de anticorpos não específicos executando o seguinte programa estabelecido anteriormente4: programa 2-1-2-1-2-1-2-1-2, onde "2" denota 2 min a 100 W e "1" denota 1 min a 0 W. Execute o programa acima uma vez para bloquear. Se este instrumento não estiver disponível, bloqueie as secções de tecido (5-10 μm) durante 1 h a 37 °C, conforme descrito anteriormente5.
  6. Crie a Solução de Coloração de Anticorpo Primário #1 (Ciclo 1) (Tabela de Materiais) durante o bloqueio da incubação do tampão. Prepare misturas de anticorpos de acordo com a Tabela de Materiais. Misture delicadamente o coquetel de anticorpos e gire a mistura de anticorpos com uma minicentrífuga a 2.680 × g por 30 s.
    NOTA: Esta solução de coloração contém diluição de 1:5000 de Hoechst que deve ser suficiente para a duração do experimento de dois ciclos. Os usuários podem precisar titular o Hoechst e outros anticorpos para obter resultados ideais para seus tecidos e configuração de imagem.
  7. Remova a câmara de umidade deslizante do micro-ondas quando o ciclo estiver concluído e retire a solução tampão de bloqueio de cada tecido. Adicione 200 μL de solução de coloração de anticorpo primário # 1 (Ciclo 1) (Tabela de Materiais) a cada lâmina. Coloque a câmara com as lâminas de volta no micro-ondas e execute o programa de anticorpos primários por aproximadamente 30 minutos: execute o programa 2-1-2-1-2-1-2-1-2 duas vezes para a marcação de anticorpos primários.
    NOTA: Aqui, 200 μL de solução primária de anticorpos é uma estimativa. Use um volume adequado de solução para cobrir toda a superfície da seção de tecido.
  8. Quando a etapa primária de rotulagem de anticorpos estiver concluída, lave cada lâmina com 1.000 μL de PBS inclinando a lâmina verticalmente, pipetando PBS no tecido e deixando o PBS escorrer. Repita esta etapa 3-5x.
  9. Retire o excesso de PBS e fixe as lâminas com paraformaldeído (PFA) a 1% por 10 min em temperatura ambiente na câmara de umidade.
    NOTA: A fixação do PFA pode mascarar epítopos, impedindo que os anticorpos se liguem aos alvos pretendidos. Ao estabelecer um painel de anticorpos pela primeira vez, recomendamos avaliar o impacto de uma fixação suave (PFA a 1% por 10 min) comparando o padrão de marcação de seções de tecido tratadas com ou sem fixador antes da imunomarcação. Se um anticorpo for sensível à fixação de PFA a 1%, mova esse anticorpo antes da etapa de pós-fixação.
  10. Lave as lâminas extensivamente com 1.000 μL de PBS 3-5x. Deixe PBS no tecido até a etapa de fotoirradiação.

3. Fotoirradiação tecidual

  1. Para preparar a caixa de fotoirradiação (Figura 2), obtenha uma lâmpada LED de 150 W, uma lâmpada LED de inundação RGBW de 40 W, um recipiente de plástico grande (volume de 20 galões [75.71 L] ou mais), PBS 1x fresco e uma placa de Petri.
  2. Coloque a placa de Petri no centro da lâmpada de 150 W e encha-a com 1x PBS. Use volume suficiente para imergir os slides no PBS. Realize o processo de fotoirradiação na câmara fria para minimizar a geração de calor das lâmpadas.
  3. Remova as lâminas da Câmara de Umidade da Lâmina e coloque-as em uma placa de Petri, garantindo que todas as lâminas estejam submersas em PBS.
  4. Coloque a lâmpada de 40 W diretamente em cima da placa de Petri com a fonte de luz voltada para as lâminas. Certifique-se de que o 40 W lamp está definido para a configuração de luz vermelha antes da colocação.
  5. Ligue as lâmpadas de 150 W e 40 W. Cubra a configuração de fotoirradiação com a tampa do recipiente de plástico. Mantenha a lâmpada de 40 W acesa na configuração de luz vermelha por 2 h e, em seguida, mude para a configuração de luz verde por meio do controle remoto incluído pelas 16 h restantes.
    NOTA: É imperativo realizar fotoirradiação a aproximadamente 4 °C para evitar distorção indesejada do calor do tecido da lâmina. Ponto de pausa: a fotoirradiação pode ser realizada durante a noite e o protocolo pode ser retomado na manhã seguinte.

4. Rotulagem de anticorpos pós-fotoirradiação

  1. Remova as lâminas da placa de Petri e mergulhe-as em 1x PBS em um frasco Coplin, tubo cônico de 50 mL ou um balde do sistema de coloração de lâminas. Prepare a Solução de Coloração de Anticorpo Primário #2 (Ciclo 1) (Tabela de Materiais) nas diluições recomendadas (Tabela 1). Use 200 μL da solução para cada lâmina.
  2. Retire o excesso de PBS de cada lâmina individual com um pano sem fiapos, certificando-se de secar a área ao redor do tecido sem tocar no próprio tecido. Coloque as lâminas na Câmara de Umidade da Lâmina.
  3. Agite suavemente a solução de coloração de anticorpos primários #2 (Ciclo 1) e adicione 200 μL a cada lâmina, garantindo que todo o tecido seja coberto.
  4. Coloque a câmara de umidade da lâmina com as lâminas de volta no micro-ondas e execute o programa de anticorpos primário por aproximadamente 30 minutos, conforme detalhado na etapa 2.7
  5. Durante a marcação de anticorpos primários, faça a solução de solução de coloração de anticorpos secundários # 1 (Ciclo 1) (Tabela de Materiais).
  6. Assim que o programa de micro-ondas for concluído, remova a câmara de umidade da lâmina e lave cada lâmina 3-5x com 1,000 μL de 1x PBS.
  7. Retire o excesso de PBS de cada lâmina individual com um pano sem fiapos, vortex a solução de coloração de anticorpos secundários e adicione 200 μL a cada lâmina.
  8. Coloque a Câmara de Umidade Deslizante no micro-ondas e execute o programa de anticorpos secundários: Um programa 2-1-2-1-2-1-2-1-2, onde "2" denota 2 min a 100 W e "1" denota 1 min a 0 W. Execute o programa acima uma vez para marcação de anticorpos secundários.
  9. Lave as lâminas extensivamente 3-5x com 1 mL de 1x PBS e retire o excesso de PBS de cada lâmina.
  10. Adicione a solução de coloração de anticorpos primários #3 (Ciclo 1) contendo anticorpos diretamente conjugados a cada lâmina. Realize a coloração de anticorpos usando o micro-ondas ou alternativa (1 h a 37 ° C) conforme descrito na etapa 2.7.
  11. Lave as lâminas novamente 3-5x com 1 mL de 1x PBS e retire cuidadosamente o excesso de PBS de cada lâmina.
  12. Adicione 30 μL de meio de montagem diretamente a cada seção de tecido e coloque uma lamínula cobrindo toda a seção de tecido. Inspecione a corrediça quanto a bolhas de ar e empurre as bolhas de ar para o perímetro da corrediça com uma leve pressão. Repita o processo para os slides restantes.
  13. Remova o excesso de meio de montagem com um pano sem fiapos e use limpador de lentes ópticas para limpar qualquer resíduo restante na superfície da lamínula. Deixe todas as lâminas endurecerem por 10-15 min em temperatura ambiente antes de realizar a aquisição da imagem em um microscópio.

5. Configuração da microscopia e aquisição de imagem

  1. Ligue o microscópio de campo amplo e a fonte de luz LED8; Inicie o software. Selecione a objetiva (aqui, uma objetiva seca de 20x/0,8). Coloque a câmera no modo de 16 bits na guia de configuração . Selecione os canais necessários com base nos fluoróforos presentes nos painéis de anticorpos (consulte a Tabela 1 para obter mais orientações).
    NOTA: As etapas a seguir são especificadas para o microscópio referenciado. Um microscópio de campo amplo equivalente com uma fonte de luz comparável e cubos de filtro para excitação e emissão de vários fluoróforos e um estágio de precisão poderia ser usado.
  2. Limpe a lamínula com limpador de lentes e papel para lentes imediatamente antes de criar imagens. Inspecione visualmente a lamínula e remova qualquer poeira ou fiapos da superfície antes de fazer a imagem. Posicione a lâmina firmemente no canto superior esquerdo (ou equivalente) da inserção do estágio, de modo que o tecido seja posicionado de forma consistente no plano XY (crítico para o alinhamento de imagens cíclicas).
  3. Defina as configurações de aquisição criando um canal correspondente a cada fluoróforo incluído no painel de anticorpos. Selecione o cubo de filtro e o LED correspondentes para cada fluoróforo. Ajuste a intensidade de cada LED e os tempos de exposição para cada canal. Consulte a Tabela 1 para obter uma lista das configurações de imagem usadas aqui.
  4. Antes da aquisição da imagem, selecione o canal Hoechst e ative o Sombreamento vinculado. Use o assistente de Sombreamento vinculado para definir isso para o objetivo selecionado.
    NOTA: Este protocolo detalha como executar imagens de lâminas inteiras por meio da aquisição de grandes digitalizações de blocos. O sombreamento vinculado ou a correção de sombreamento são necessários para superar a iluminação irregular em imagens lado a lado.
  5. No software, clique no botão Ao vivo para visualizar o canal Hoechst. Use o botão de foco grosso para focar a seção de tecido.
  6. Selecione cada canal fluorescente e avalie a seção de tecido quanto ao padrão de coloração esperado para todos os anticorpos marcados com fluorescência no ciclo.
  7. Selecione Navigator no software. Usando o canal de Hoechst e a função espiral no Navigator, mapeie toda a seção de tecido ou região de interesse a ser fotografada. Se várias seções de tecido forem visualizadas por lâmina, repita esta etapa para criar um mapa do tecido usando o Navigator.
  8. Identifique o(s) ROI(s) a ser visualizado(s) usando o polígono, a varinha mágica ou outras ferramentas de seleção de ROI no Navigator. Desenhe cuidadosamente o contorno do tecido para capturar o menor número de ladrilhos necessários para cobrir o(s) ROI(s) desejado(s). Exclua blocos extras para reduzir o tempo total de aquisição.
  9. Depois que as ROIs forem criadas, revise e ajuste as configurações do canal para minimizar pixels saturados e otimizar a relação sinal-ruído. Selecione a tabela de pesquisa de mapa de calor na janela de exibição da imagem. As cores indicam o nível de preenchimento dos pixels, com vermelhos, laranjas, amarelos e brancos indicando variações de intensidade mais fáceis de ver; pixels azuis indicam pixels saturados. Para evitar a perda de informações e comprometer a qualidade da imagem, reduza o tempo de exposição para minimizar o número de pixels saturados (azuis).
  10. No Navegador, use a ferramenta Mapa de foco para criar um mapa topográfico do tecido. Defina um ponto do Mapa de Foco a cada 3-4 FOVs para blocos grandes ou amostras irregulares.
    NOTA: Esta etapa é crítica para as digitalizações de blocos grandes necessárias para a imagem de lâminas inteiras. Em geral, a qualidade da imagem é dimensionada com o número de pontos do mapa de foco selecionados; No entanto, esse processo pode ser bastante demorado, especialmente para grandes digitalizações de ladrilhos.
    1. Crie Pontos do Mapa de Foco na ordem em que serão digitalizados pelo microscópio. Para corresponder à ordem de varredura lado a lado do microscópio referenciado, selecione Focar Pontos do Mapa ao longo de um caminho serpentino que corresponda ao caminho usado pelo microscópio.
    2. Defina o primeiro Ponto do mapa de foco usando o foco manual. Use o foco automático para os pontos restantes do mapa de foco. Sente-se e observe para garantir que o foco ideal seja selecionado para cada ponto do mapa de foco. Ajuste manualmente os pontos do mapa de foco conforme necessário. Aumente o alcance usado para encontrar cada ponto do mapa de foco para tecidos irregulares e/ou grandes.
  11. Configure o processamento usando os seguintes parâmetros: Compensação Computacional de Pequeno Volume (SVCC) com um Índice de Refração (RI) definido para corresponder ao meio de montagem (aqui, 1.4); força definida como 98% e tamanho do recurso definido como 2.000 nm para marcadores de membrana ou 3.000 nm para marcadores nucleares. Execute o protocolo de limpeza computacional durante a aquisição da imagem.
  12. Inicie a verificação de blocos. Anote o número do bloco e mantenha os ROIs constantes ao longo de todos os ciclos.
  13. Após a aquisição da imagem, mescle as imagens computacionalmente limpas com a Mesclagem de mosaico encontrada na guia Processo , com a opção Suavizar selecionada. Inspecione visualmente cada imagem em busca de erros de costura e repita a mesclagem do mosaico com novos parâmetros se houver erros de mosaico.
    NOTA: Imagens mal alinhadas impedirão o registro de imagens adquiridas iterativamente.
  14. Se necessário, use o módulo Separação de corantes para compensar o transbordamento espectral entre os canais, conforme descrito anteriormente5.

6. Ciclos de inativação de corantes, marcação de anticorpos e aquisição de imagens

  1. Após a conclusão da aquisição da imagem, mergulhe as lâminas em um tubo cônico de 50 mL de PBS estéril 1x até que as lamínulas caiam. Se a lamínula não cair, passe o PBS diretamente sobre o slide ou use uma pinça para remover suavemente a lamínula.
  2. Prepare a solução de borohidreto de lítio (LiBH4) medindo 3-5 mg de pó em um barco de pesagem de plástico. Adicione diH2O na proporção de 1:1 diretamente ao pó (por exemplo,., 3,2 mg de LiBH4 e 3,2 mL de diH2O) e homogeneizar a solução com uma pipeta. Use uma seringa para passar a solução através de um filtro de 0,2 μm em um tubo cônico de 50 mL e registre a concentração e a hora exata em que a solução foi criada. Deixe a solução incubar em temperatura ambiente por 3-5 min até que grandes bolhas sejam vistas em toda a solução.
    NOTA: Recomendamos o uso da solução de inativação do corante dentro de 4 h após a preparação. CUIDADO: Execute as etapas a seguir em uma capela de exaustão química e use equipamento de proteção individual (EPI) adequado. Essa reação pode produzir gás hidrogênio, que é altamente inflamável. É importante trabalhar com pequenas quantidades de LiBH4 (<10 mg) em todos os momentos. Para mais orientações, assista aos vídeos tutoriais sobre como preparar o LiBH4 com segurança na Base de Conhecimento IBEX10,11.
    Substitua o frasco para injetáveis de LiBH4 após 4 semanas de uso devido à diminuição da eficácia do clareamento após exposição repetida ao ar. Recomendamos a compra de alíquotas pequenas de LiBH4 (1 grama).
  3. Remova cada lâmina do 1x PBS de imersão, retire o excesso de PBS com um pano sem fiapos e coloque-o na câmara de umidade da lâmina.
  4. Trate cada lâmina sem lamínula com LiBH4 por 30 min, pipetando a solução diretamente na lâmina com volume suficiente para cobrir o tecido. Remova a solução LiBH4 antiga de cada lâmina e atualize com uma nova alíquota de LiBH4 em 10 min e 20 min da mesma solução estoque LiBH4 .
  5. Lave as lâminas extensivamente 3-5x com 1x PBS. Use trocas rápidas de PBS, embebendo as lâminas por 1 min por lavagem.
  6. Para adquirir uma imagem para subtração de fundo, coloque uma nova lamínula em cada lâmina, conforme descrito nas etapas 4.12-4.13, e adquira imagens do tecido após a inativação do corante. Crie um novo projeto para a imagem de subtração de plano de fundo e repita as etapas 5.2 a 5.14 para adquirir a imagem. Imagem usando o mesmo número de blocos, canais, configurações de canal e FOVs estabelecidos para a imagem do ciclo 1. Mantenha os pontos do Mapa de Foco nos mesmos FOVs, mas use o foco automático para ajustar cada ponto do Mapa de Foco para esta nova imagem.
    NOTA: Use o canal que contém o marcador fiducial repetido (Hoechst) para identificar estruturas únicas (formas nucleares) que estão presentes na imagem 'ao vivo' (imagem de subtração de fundo, por exemplo) e na imagem anterior (ciclo 1).
  7. Para minimizar os sinais fluorescentes inespecíficos de anticorpos biotinilados no segundo ciclo de anticorpos, execute o bloqueio da avidina e da biotina.
    1. Retire o excesso de PBS e aplique a solução de bloqueio de avidina em cada lâmina à temperatura ambiente por 15 min.
    2. Lave as lâminas 3-5x com 1x PBS e retire o excesso de PBS quando as lavagens estiverem concluídas.
    3. Aplique a solução de bloqueio de biotina em cada lâmina em temperatura ambiente por 15 min e lave as lâminas 3-5x com 1x PBS como na etapa 6.7.2.
  8. Prepare um novo tampão de bloqueio sem BSA (Ciclo 2) (Tabela de Materiais) para
    Solução de coloração de anticorpos primários #4 (Ciclo 2) e Solução de coloração de anticorpos secundários #2 (Ciclo 2).
    NOTA: Essas soluções não requerem albumina sérica bovina porque a BSA pode comprometer a etapa de bloqueio da avidina/biotina.
  9. Dilua os anticorpos primários nas concentrações recomendadas pelo fabricante na Solução de Coloração de Anticorpos Primários #4 (Ciclo 2). Agite suavemente esta solução e adicione a cada lâmina dentro da câmara de umidade, garantindo que o tecido esteja completamente coberto com a solução primária de anticorpos. Coloque a câmara de umidade da lâmina com as lâminas no micro-ondas e execute o programa de anticorpos primários por aproximadamente 30 minutos, conforme detalhado na etapa 2.7-2.8.
  10. Execute a marcação de anticorpos secundários com a Solução de Coloração de Anticorpo Secundário #2 (Ciclo 2) conforme detalhado nas etapas 4.6-4.9. Uma vez concluída a coloração, coloque uma nova lamínula em cada lâmina, conforme descrito anteriormente nas etapas 4.12-4.13. Coloque a lâmina de volta na platina do microscópio e reposicione-a para ficar no mesmo plano XY das imagens anteriores.
    NOTA: Use o canal que contém o marcador fiducial repetido (Hoechst) para identificar estruturas únicas (formas nucleares) que estão presentes na imagem 'ao vivo' (ciclo 2, por exemplo) e na imagem anterior (ciclo 1).
  11. Crie um novo projeto para a imagem do ciclo 2 e repita as etapas 5.2 a 5.14 para adquirir a imagem do ciclo 2. Imagem usando o mesmo número de blocos, canais, configurações de canal e FOVs estabelecidos para a imagem do ciclo 1. Mantenha os pontos do Mapa de Foco nos mesmos FOVs, mas use o foco automático para ajustar cada ponto do Mapa de Foco para esta nova imagem. Assim que a imagem do ciclo 2 for adquirida, prossiga para o alinhamento da imagem ou repita as etapas da seção 6 para ciclos adicionais com anticorpos diretamente conjugados. NOTA: Use o canal que contém o marcador fiducial repetido (Hoechst) para identificar estruturas únicas (formas nucleares) que estão presentes na imagem 'ao vivo' (imagem do ciclo 2, por exemplo) e na imagem anterior (ciclo 1). Ciclos adicionais requerem anticorpos diretamente conjugados porque o IBEX não remove anticorpos.

7. Alinhamento da imagem

  1. Converta imagens raw dos arquivos .lif de saída do microscópio em arquivos .ims com o conversor de arquivos gratuito e o processamento de imagens com o software de código aberto, conforme descrito anteriormente5 e detalhado em vídeos na Base de Conhecimento IBEX10,11.
  2. Para cada ciclo de imagem, edite o arquivo e aplique as etapas de processamento desejadas (por exemplo, nomenclatura de canal, pseudocoloração de canal).
    1. Execute a subtração em segundo plano e o limite de canal usando as funções aritméticas de canal criadas para o SimpleITK para diminuir o sinal de autofluorescência (https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTChannelArithmetic.html).
      NOTA: Executamos essas etapas em cada imagem (por exemplo, Ciclo 1, Ciclo 2) antes de alinhá-las em uma imagem composta. Isso ocorre porque é mais fácil trabalhar nas imagens individuais menores do que na imagem combinada maior.
  3. Elabore uma estratégia de nomenclatura consistente para usar o software de registro. Nomeie os canais com um prefixo-separador-caractere-sufixo (por exemplo, 'Cycle1 CD8_AF647') com um espaço como caractere separador para denotar o canal no qual o anticorpo anti-CD8 AF647 foi usado no primeiro ciclo.
    NOTA: Consulte a extensão do arquivo de ajuda para obter mais detalhes: https://niaid.github.io/imaris_extensions/XTRegisterSameChannel.html.
  4. Depois que todos os canais tiverem sido nomeados adequadamente, inicie o software de registro, clique em Imaris Extensions | SimpleITK | Afim.
  5. Carregue o arquivo .ims para cada ciclo usando o botão procurar ao lado de Nomes de arquivo. Insira o caractere separador de prefixo do nome do canal. Se estiver seguindo o exemplo acima, digite um único espaço e clique em Avançar.
  6. Selecione o canal de registro usado como marcador fiducial comum entre os ciclos (por exemplo, Hoechst).
  7. Selecione a Imagem Fixa, a imagem na qual outras imagens serão registradas.
    NOTA: Recomendamos registrar-se no Ciclo 2 de imagens iterativas.
  8. Selecione o diretório desejado para o 'Arquivo de saída'. A opção Iniciar registro na resolução será definida na resolução máxima por padrão para permitir o melhor registro possível. Se o poder de computação for limitado, reduza esse parâmetro.
    NOTA: Para os dados descritos aqui (12-15 GB por imagem), usamos uma resolução máxima de 5.
  9. Clique em Registrar para começar. Assim que o registro for concluído, aguarde até que o botão Reamostrar e Salvar Imagem Combinada apareça, clique nele e aguarde a conclusão da barra de progresso.
  10. Abra o arquivo de saída concluído no software de processamento. A imagem registrada com todos os ciclos e informações do canal estará disponível e pronta para análise ou publicação.

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Resultados

Projetar um painel de imagem multiplexado baseado em anticorpos requer tempo, esforço e recursos significativos12. Esses desafios são especialmente pronunciados ao projetar um painel para amostras FFPE arquivadas de tecidos altamente autofluorescentes, conforme descrito aqui (Figura 1). Para superar esses desafios, primeiro identificamos os fluoróforos mais brilhantes compatíveis com nosso protocolo de inativação de corante (Tabela 1). Por exemplo, os...

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Discussão

A patologia pulmonar clínica da tuberculose pulmonar é caracterizada por inflamação granulomatosa necrosante. A patologia pulmonar por MNT ocorre principalmente em duas populações distintas de pacientes com dois padrões patológicos distintos: lesão pulmonar isolada marcada por inflamação granulomatosa com obliteração bronquiolar e formação de cavidades em indivíduos imunocompetentes, ou doença nodular difusa que afeta os pulmões e outros órgãos em indivíduos imunodeficientes 13,14,15,16<...

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Divulgações

A.J.R. é funcionário da Leica Microsystems, Inc. Os demais autores declaram não haver interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do DIR/NIAID, NCI e NHLBI. A Figura 1 foi criada usando o BioRender sob um contrato de licença institucional com o NIH.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,3% Tritão-X-100Sigma-AldrichT8787Solução para bloquear o buffer
1% BSASigma-AldrichRolamento A4503Solução para bloquear o buffer
1% Bloco BD Fc HumanoBD Biociências564220Bloqueio Fc necessário para bloquear o buffer
Lâmpada LED de 150 WAmazonaB07VH3CVSFFonte de luz LED para fotoirradiação de tecido
1x PBS Gibco10010-023Solução para bloquear o buffer e as etapas de lavagem
Recipiente de armazenamento de 20 galõesAmazonaB001B1C4G0Recipiente para processo de fotoirradiação
Lâmpada LED de inundação RGBW de 40 W AmazonaB08QFPJSMDFonte de luz RGB para fotoirradiação de tecido
Ag85BAbcamab43019/NAAnticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Actina de músculo liso alfa DyLight 755Novus BiológicosNBP2-345221R/NAAnticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Kit de bloqueio Avidin/BiotinaAbcamab64212Solução de bloqueio de avidina e biotina
BD Cytofix / CytopermBD Biociências554714Solução de fixação
Solução de desparafinação BONDLeica BiosystemsNC0221076Solução de desparafinização
Solução de recuperação de epítopos BOND 1Leica BiosystemsNC0235529Solução de recuperação de epítopos de pH 6 à base de citrato (ER1)
Solução de Recuperação de Epítopos BOND 2Leica BiosystemsNC0235530Solução de recuperação de epítopos de pH 9 à base de EDTA (ER2)
Sistema de detecção de pesquisa BONDLeica BiosystemsNC0396648Reagente de coloração de pesquisa automatizado
Corante de pesquisa BOND RXLeica BiosystemsNAPlataforma automatizada de coloração de pesquisa
Solução de lavagem BONDLeica BiosystemsNC0221077Tampão de lavagem
CD15BD Biociências347420/AB_400298Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Científico50-0202-82/AB_11150959Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
CD4 Alexa Fluor 488R& D SistemasFAB8165G/AB_2728839Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
CD45 Ficoeritrina (PE)Novus BiológicosNBP2-34528PE/NAAnticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
CD68 iFluor 594Caprico Biotecnologias1064135/AB_2892745Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher CientíficoA32814/AB_2762838Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Burro anti-rato IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher CientíficoA32787/ AB_2762830Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Burro anti-rato IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_2340844Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Burro anti-coelho IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher CientíficoA32794/AB_2762834Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Sistema de coloração EasyDipFornecimento para recém-chegados5300KITSistema de coloração de lâminas
Fluoromount-GThermo Fisher Científico00-4958-02Mídia de montagem
HoechstBiotium40046Coloração nuclear para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Conversor de arquivos Imaris x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentosConversor de arquivos gratuito
Software ImarisViewer x64 10.2.0Imaris Oxford InstrumentosSoftware de processamento de imagem gratuito
Caneta ImmEdgeLaboratórios de vetoresH-4000Caneta de barreira hidrofóbica
Borohidreto de lítio (1 grama)Produtos químicos STREM93-0397Produto químico para inativação de corantes, compre pequenas alíquotas deste produto químico (1 grama)
Biotina LumicanR& D SistemasBAF2846Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Micro Óculos de CoberturaVWR48393-241Tampas de slides de vidro
Pan-citoqueratina Alexa Fluor 750Novus BiológicosNBP2-33200AF750/AB_2868569Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Sistema de micro-ondas PELCO BioWave ProTed Pella Inc36500-230Microondas científicas sem aquecimento
PELCO SteadyTemp ProTed Pella Inc50062Controle de temperatura totalmente automatizado para micro-ondas científico
SimpleITKSoftware de código abertoSoftware de registro e processamento de canais
Estreptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher CientíficoS11227Reagente de marcação para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Microscópio de campo amploLeica MicrosystemsNAGerador de imagens THUNDER da Leica Microsystems com fonte de luz LED8 e software LAS X (3.7.1.21655). Para imagens de fluorescência, um filtro quad-band personalizado com roda de filtro externo (PN: 11536075) com dois filtros adicionais de banda única (PN: 8118215) foi usado para obter imagens de sete canais de corante por passagem. As linhas de excitação, dicróica e de emissão do filtro são (1) cubo de banda quádrupla: dicróico em 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, sem filtros de excitação ou emissão; (2) Roda do filtro externo posição 1: 434/32, posição 2: 520/40, posição 3: 585/20, posição 4: 720/60, posição 5: passagem; (3) banda única 1— 585/22 excitação, 594 dicróica, 625/30 emissão; (4) banda única 2— 635/20 excitação, 647 dicróica, 667/30 emissão.
Limpador de lentes ópticas ZeissAmazonaB00GPVQVCOLimpador de lentes objetivas para microscópio
Anticorpos
Ag85BAbcamAB43019IgG policlonal de coelho, ciclo 1
Actina de músculo liso alfa DyLight 755Novus BiológicosNBP2-345221R1A4/asm-1, ciclo 1
CD4 Alexa Fluor 488R& D SistemasFAB8165GIgG policlonal de cabra, ciclo 1
CD8 Alexa Fluor 647BioLegend372906C8/144B, ciclo 1
CD68 iFluor 594Caprico Biotecnologias1064135KP1, ciclo 1
Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Fisher CientíficoRolamento A32814Burro Policlonal, ciclo 1
Burro anti-rato IgG Alexa Fluor Plus AF647Thermo Fisher CientíficoRolamento A32787Burro Policlonal, ciclo 1
Burro anti-coelho IgG Alexa Fluor Plus AF555Thermo Fisher CientíficoRolamento A32794Burro Policlonal, ciclo 1
HoechstBiotium40046Rótulo nuclear, ciclo 1
CD15BD Biociências347420MMA, ciclo 2
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Científico50-0202-82L26, ciclo 2
CD45 Ficoeritrina (PE)Novus BiológicosNBP2-34528PE2B11 + PD7/26, ciclo 2
Burro anti-rato IgM Alexa Fluor 488Jackson ImmunoResearch715-545-020Burro Policlonal, ciclo 2
Biotina LumicanR& D SistemasBAF2846IgG policlonal de cabra, ciclo 2
Pan-citoqueratina Alexa Fluor 750Novus BiológicosNBP2-33200AF750AE-1/AE-3, ciclo 2
Estreptavidin Alexa Fluor 594Thermo Fisher CientíficoS11227N/A, ciclo 2
HoechstBiotium40046Ciclo 2
Soluções
Buffer de bloqueio (Ciclo 1)
Tritão-X-100Sigma-AldrichT87870,3% em volume
BSASigma-AldrichRolamento A45031% em volume
Bloco BD Fc HumanoBD Biociências5642201% em volume
1x PBS Gibco10010-02397,7% em volume
Solução de coloração de anticorpos primários #1 (Ciclo 1)
Buffer de bloqueio (ciclo 1)Veja acimaAumente o volume após adicionar anticorpos
HoechstBiotium400461:5000
CD8 AF647BioLegend3729061:10
Solução de coloração de anticorpos primários #2 (Ciclo 1)
Buffer de bloqueio (ciclo 1)Veja acimaAumente o volume após adicionar anticorpos
CD4  AF488R& D SistemasFAB8165G1:10
Ag85BAbcamab43019/NA1:100
Solução de coloração de anticorpos secundários #1 (Ciclo 1)
Buffer de bloqueio (ciclo 1)Veja acimaAumente o volume após adicionar anticorpos
Burro Anti-Cabra AF Plus 488Thermo Fisher CientíficoA32814/AB_27628381:100
Burro anti-coelho AF Plus 555Thermo Fisher CientíficoA32794/AB_27628341:100
Burro anti-rato AF Plus 647Thermo Fisher CientíficoA32787/AB_27628301:50
Solução de coloração de anticorpos primários #3 (Ciclo 1)
Buffer de bloqueio (ciclo 1)Veja acimaAumente o volume após adicionar anticorpos
CD68 iF594Caprico Biotecnologias10641351:10
a-SMA DL755Novus BiológicosNBP2-345221R/NA1:30
BSA-free Blocking Buffer (Ciclo 2) 
Tritão-X-100Sigma-AldrichT87870,3% em volume
Bloco BD Fc HumanoBD Biociências5642201% em volume
1x PBS Gibco10010-02398,7% em volume
Solução de coloração de anticorpos primários #4 (Ciclo 2)
Buffer de bloqueio sem BSA (Ciclo 2)Veja acimaAumente o volume após adicionar anticorpos
CD15BD Biociências3474201:30
Biotina LumicanR& D SistemasBAF28461:100
CD45 PENovus BiológicosNBP2-34528PE1:20
CD20 eFluor 660Thermo Fisher Científico50-0202-821:10
Pan-citoqueratina AF750Novus BiológicosNBP2-33200AF7501:10
Solução de coloração de anticorpos secundários #2 (Ciclo 2)
Buffer de bloqueio sem BSA (Ciclo 2)Veja acimaAumente o volume após adicionar anticorpos
Burro anti-rato IgM AF488Jackson ImmunoResearch715-545-020/AB_23408441:100
Estrepavidina AF594Thermo Fisher CientíficoS112271:200

Referências

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