Fluxo de trabalho otimizado para branqueamento iterativo amplia a imagem de multiplexidade de amostras clínicas altamente autofluorescentes

Summary

A implementação de uma técnica de fotoirradiação versátil e de baixo custo com o método IBEX manual permite imagens ideais de tecido humano com autofluorescência nativa significativa. Este protocolo detalha como obter imagens multiplexadas de lâminas inteiras de amostras clínicas arquivadas usando um microscópio invertido, reagentes amplamente disponíveis e software de código aberto para alinhamento e processamento de imagens.

Abstract

A prevalência de doença pulmonar por micobactérias não tuberculosas (MNT) vem aumentando globalmente. Embora a doença pulmonar induzida por MNT frequentemente se apresente com bronquiectasias, nódulos pulmonares e doença cavitária, a resposta do hospedeiro associada a esses padrões distintos de lesão pulmonar não foi bem caracterizada in situ. Procuramos avaliar os mecanismos da patologia induzida por MNT realizando uma análise fenotípica profunda de populações de células imunes no tecido pulmonar de indivíduos com doença por MNT em comparação com um padrão-ouro de inflamação granulomatosa, doença pulmonar tuberculosa (TB).

Bloqueios pulmonares fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) de pacientes com MNT disseminada, MNT pulmonar ou doença pulmonar por TB foram seccionados e corados seguindo uma versão modificada do método de imagem Iterative Bleaching Extends multi-pleXity (IBEX). A otimização do método IBEX foi necessária primeiro para abordar a fluorescência endógena significativa das seções pulmonares devido à alta densidade de colágeno, elastina e eritrócitos nativos do tecido pulmonar que é agravada pela preservação do FFPE e pela idade dos blocos FFPE. Neste protocolo, detalhamos um protocolo de fotoirradiação e um método de recuperação de antígeno modificado que reduz a autofluorescência de amostras clinicamente arquivadas.

Além disso, fornecemos orientação sobre o design do painel de anticorpos, incluindo desafios comuns, como reatividade cruzada, perda de epítopos após fotoirradiação, sobreposição espectral entre fluoróforos adjacentes e baixa relação sinal-ruído para determinados alvos. Para facilitar a imagem eficiente de seções de tecido pulmonar inteiro, as lâminas foram fotografadas com um microscópio de campo amplo e pós-processadas com software de código aberto para melhorar a qualidade da imagem. Juntos, esse fluxo de trabalho atende a uma necessidade crítica, documentando como obter imagens de lâminas inteiras altamente multiplexadas e de alta resolução de amostras desafiadoras usando instrumentação e reagentes amplamente disponíveis. Além da imagem quantitativa de amostras clínicas, essas técnicas podem ser aplicadas a diversos tipos de amostras para superar fontes endógenas e exógenas de fluorescência.

Introduction

A tuberculose (TB) é uma das principais causas de morte, com aproximadamente 1,3 milhão de pessoas morrendo de infecção por TB a cada ano¹. Embora não seja tão letal quanto a tuberculose, houve um aumento significativo de infecções pulmonares e subsequentes doenças causadas por micobactérias não tuberculosas (MNT) nos últimos anos². No nível tecidual, a resposta imune do hospedeiro à infecção pulmonar por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) tem sido bem estudada e inclui a formação de granulomas, agregados heterogêneos de linfócitos, células dendríticas, macrófagos e neutrófilos

Protocol

Cortes de tecido pulmonar de autópsia e ressecção cirúrgica arquivados foram coletados sob protocolo 09-H-0172 (NCT00943514), História Natural da Bronquiectasia, no Laboratório de Patologia do Centro Clínico do National Institutes of Health. Este protocolo foi aprovado pelo IRB e os participantes forneceram consentimento informado.

1. Recuperação automatizada de antígenos

NOTA: A desparafinização e a recuperação do antígeno foram realizadas usando uma plataforma automatizada de coloração de pesquisa (Figura 1). Trabalhos anteriores determinaram que....

Results

Projetar um painel de imagem multiplexado baseado em anticorpos requer tempo, esforço e recursos significativos¹². Esses desafios são especialmente pronunciados ao projetar um painel para amostras FFPE arquivadas de tecidos altamente autofluorescentes, conforme descrito aqui (Figura 1). Para superar esses desafios, primeiro identificamos os fluoróforos mais brilhantes compatíveis com nosso protocolo de inativação de corante (Tabela 1). Por exemplo, os.......

Discussion

A patologia pulmonar clínica da tuberculose pulmonar é caracterizada por inflamação granulomatosa necrosante. A patologia pulmonar por MNT ocorre principalmente em duas populações distintas de pacientes com dois padrões patológicos distintos: lesão pulmonar isolada marcada por inflamação granulomatosa com obliteração bronquiolar e formação de cavidades em indivíduos imunocompetentes, ou doença nodular difusa que afeta os pulmões e outros órgãos em indivíduos imunodeficientes 13,14,15,16<.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,3% Tritão-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Solução para bloquear o buffer
1% BSA	Sigma-Aldrich	Rolamento A4503	Solução para bloquear o buffer
1% Bloco BD Fc Humano	BD Biociências	564220	Bloqueio Fc necessário para bloquear o buffer
Lâmpada LED de 150 W	Amazona	B07VH3CVSF	Fonte de luz LED para fotoirradiação de tecido
1x PBS	Gibco	10010-023	Solução para bloquear o buffer e as etapas de lavagem
Recipiente de armazenamento de 20 galões	Amazona	B001B1C4G0	Recipiente para processo de fotoirradiação
Lâmpada LED de inundação RGBW de 40 W	Amazona	B08QFPJSMD	Fonte de luz RGB para fotoirradiação de tecido
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Actina de músculo liso alfa DyLight 755	Novus Biológicos	NBP2-345221R/NA	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Kit de bloqueio Avidin/Biotina	Abcam	ab64212	Solução de bloqueio de avidina e biotina
BD Cytofix / Cytoperm	BD Biociências	554714	Solução de fixação
Solução de desparafinação BOND	Leica Biosystems	NC0221076	Solução de desparafinização
Solução de recuperação de epítopos BOND 1	Leica Biosystems	NC0235529	Solução de recuperação de epítopos de pH 6 à base de citrato (ER1)
Solução de Recuperação de Epítopos BOND 2	Leica Biosystems	NC0235530	Solução de recuperação de epítopos de pH 9 à base de EDTA (ER2)
Sistema de detecção de pesquisa BOND	Leica Biosystems	NC0396648	Reagente de coloração de pesquisa automatizado
Corante de pesquisa BOND RX	Leica Biosystems	NA	Plataforma automatizada de coloração de pesquisa
Solução de lavagem BOND	Leica Biosystems	NC0221077	Tampão de lavagem
CD15	BD Biociências	347420/AB_400298	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Científico	50-0202-82/AB_11150959	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
CD4 Alexa Fluor 488	R& D Sistemas	FAB8165G/AB_2728839	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
CD45 Ficoeritrina (PE)	Novus Biológicos	NBP2-34528PE/NA	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
CD68 iFluor 594	Caprico Biotecnologias	1064135/AB_2892745	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Científico	A32814/AB_2762838	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Burro anti-rato IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Científico	A32787/ AB_2762830	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Burro anti-rato IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020/AB_2340844	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Burro anti-coelho IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Científico	A32794/AB_2762834	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Sistema de coloração EasyDip	Fornecimento para recém-chegados	5300KIT	Sistema de coloração de lâminas
Fluoromount-G	Thermo Fisher Científico	00-4958-02	Mídia de montagem
Hoechst	Biotium	40046	Coloração nuclear para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Conversor de arquivos Imaris x64 10.2.0	Imaris Oxford Instrumentos		Conversor de arquivos gratuito
Software ImarisViewer x64 10.2.0	Imaris Oxford Instrumentos		Software de processamento de imagem gratuito
Caneta ImmEdge	Laboratórios de vetores	H-4000	Caneta de barreira hidrofóbica
Borohidreto de lítio (1 grama)	Produtos químicos STREM	93-0397	Produto químico para inativação de corantes, compre pequenas alíquotas deste produto químico (1 grama)
Biotina Lumican	R& D Sistemas	BAF2846	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Micro Óculos de Cobertura	VWR	48393-241	Tampas de slides de vidro
Pan-citoqueratina Alexa Fluor 750	Novus Biológicos	NBP2-33200AF750/AB_2868569	Anticorpo para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Sistema de micro-ondas PELCO BioWave Pro	Ted Pella Inc	36500-230	Microondas científicas sem aquecimento
PELCO SteadyTemp Pro	Ted Pella Inc	50062	Controle de temperatura totalmente automatizado para micro-ondas científico
SimpleITK	Software de código aberto		Software de registro e processamento de canais
Estreptavidin Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Científico	S11227	Reagente de marcação para imagens IBEX. Veja a Tabela 1.
Microscópio de campo amplo	Leica Microsystems	NA	Gerador de imagens THUNDER da Leica Microsystems com fonte de luz LED8 e software LAS X (3.7.1.21655). Para imagens de fluorescência, um filtro quad-band personalizado com roda de filtro externo (PN: 11536075) com dois filtros adicionais de banda única (PN: 8118215) foi usado para obter imagens de sete canais de corante por passagem. As linhas de excitação, dicróica e de emissão do filtro são (1) cubo de banda quádrupla: dicróico em 391/32, 479/33, 554/24, 638/31, sem filtros de excitação ou emissão; (2) Roda do filtro externo posição 1: 434/32, posição 2: 520/40, posição 3: 585/20, posição 4: 720/60, posição 5: passagem; (3) banda única 1— 585/22 excitação, 594 dicróica, 625/30 emissão; (4) banda única 2— 635/20 excitação, 647 dicróica, 667/30 emissão.
Limpador de lentes ópticas Zeiss	Amazona	B00GPVQVCO	Limpador de lentes objetivas para microscópio
Anticorpos
Ag85B	Abcam	AB43019	IgG policlonal de coelho, ciclo 1
Actina de músculo liso alfa DyLight 755	Novus Biológicos	NBP2-345221R	1A4/asm-1, ciclo 1
CD4 Alexa Fluor 488	R& D Sistemas	FAB8165G	IgG policlonal de cabra, ciclo 1
CD8 Alexa Fluor 647	BioLegend	372906	C8/144B, ciclo 1
CD68 iFluor 594	Caprico Biotecnologias	1064135	KP1, ciclo 1
Burro anti-cabra IgG Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Científico	Rolamento A32814	Burro Policlonal, ciclo 1
Burro anti-rato IgG Alexa Fluor Plus AF647	Thermo Fisher Científico	Rolamento A32787	Burro Policlonal, ciclo 1
Burro anti-coelho IgG Alexa Fluor Plus AF555	Thermo Fisher Científico	Rolamento A32794	Burro Policlonal, ciclo 1
Hoechst	Biotium	40046	Rótulo nuclear, ciclo 1
CD15	BD Biociências	347420	MMA, ciclo 2
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Científico	50-0202-82	L26, ciclo 2
CD45 Ficoeritrina (PE)	Novus Biológicos	NBP2-34528PE	2B11 + PD7/26, ciclo 2
Burro anti-rato IgM Alexa Fluor 488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020	Burro Policlonal, ciclo 2
Biotina Lumican	R& D Sistemas	BAF2846	IgG policlonal de cabra, ciclo 2
Pan-citoqueratina Alexa Fluor 750	Novus Biológicos	NBP2-33200AF750	AE-1/AE-3, ciclo 2
Estreptavidin Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Científico	S11227	N/A, ciclo 2
Hoechst	Biotium	40046	Ciclo 2
Soluções
Buffer de bloqueio (Ciclo 1)
Tritão-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	0,3% em volume
BSA	Sigma-Aldrich	Rolamento A4503	1% em volume
Bloco BD Fc Humano	BD Biociências	564220	1% em volume
1x PBS	Gibco	10010-023	97,7% em volume
Solução de coloração de anticorpos primários #1 (Ciclo 1)
Buffer de bloqueio (ciclo 1)	Veja acima		Aumente o volume após adicionar anticorpos
Hoechst	Biotium	40046	1:5000
CD8 AF647	BioLegend	372906	1:10
Solução de coloração de anticorpos primários #2 (Ciclo 1)
Buffer de bloqueio (ciclo 1)	Veja acima		Aumente o volume após adicionar anticorpos
CD4  AF488	R& D Sistemas	FAB8165G	1:10
Ag85B	Abcam	ab43019/NA	1:100
Solução de coloração de anticorpos secundários #1 (Ciclo 1)
Buffer de bloqueio (ciclo 1)	Veja acima		Aumente o volume após adicionar anticorpos
Burro Anti-Cabra AF Plus 488	Thermo Fisher Científico	A32814/AB_2762838	1:100
Burro anti-coelho AF Plus 555	Thermo Fisher Científico	A32794/AB_2762834	1:100
Burro anti-rato AF Plus 647	Thermo Fisher Científico	A32787/AB_2762830	1:50
Solução de coloração de anticorpos primários #3 (Ciclo 1)
Buffer de bloqueio (ciclo 1)	Veja acima		Aumente o volume após adicionar anticorpos
CD68 iF594	Caprico Biotecnologias	1064135	1:10
a-SMA DL755	Novus Biológicos	NBP2-345221R/NA	1:30
BSA-free Blocking Buffer (Ciclo 2)
Tritão-X-100	Sigma-Aldrich	T8787	0,3% em volume
Bloco BD Fc Humano	BD Biociências	564220	1% em volume
1x PBS	Gibco	10010-023	98,7% em volume
Solução de coloração de anticorpos primários #4 (Ciclo 2)
Buffer de bloqueio sem BSA (Ciclo 2)	Veja acima		Aumente o volume após adicionar anticorpos
CD15	BD Biociências	347420	1:30
Biotina Lumican	R& D Sistemas	BAF2846	1:100
CD45 PE	Novus Biológicos	NBP2-34528PE	1:20
CD20 eFluor 660	Thermo Fisher Científico	50-0202-82	1:10
Pan-citoqueratina AF750	Novus Biológicos	NBP2-33200AF750	1:10
Solução de coloração de anticorpos secundários #2 (Ciclo 2)
Buffer de bloqueio sem BSA (Ciclo 2)	Veja acima		Aumente o volume após adicionar anticorpos
Burro anti-rato IgM AF488	Jackson ImmunoResearch	715-545-020/AB_2340844	1:100
Estrepavidina AF594	Thermo Fisher Científico	S11227	1:200