Artigo de método

Tela CRISPR em todo o genoma para revelar genes radiossensíveis e radiorresistentes

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DOI:

10.3791/67982

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23 de maio de 2025

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1Department of Pulmonary Oncology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 2Tumor Precision Diagnosis and Treatment Technology and Translational Medicine, Hubei Engineering Research Center, Zhongnan Hospital of Wuhan University, 3Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors, Zhongnan Hospital of Wuhan University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Uma abordagem meticulosa e estruturada é dada para selecionar genes resistentes e sensíveis de radiação por meio da aplicação de um método de triagem CRISPR / Cas9 em todo o genoma. Este protocolo também tem o potencial de servir como uma estrutura versátil para outros empreendimentos de pesquisa que investigam os mecanismos de resistência a drogas químicas administradas clinicamente.

Resumo

O sistema CRISPR-Cas9 foi aproveitado e reaproveitado em uma poderosa ferramenta de edição de genoma. Ao alavancar essa tecnologia, os pesquisadores podem cortar, colar e até reescrever sequências de DNA com precisão dentro de células vivas. No entanto, a aplicação da tecnologia de tela CRISPR vai muito além da mera experimentação. Ele serve como uma ferramenta fundamental na luta contra doenças genéticas, dissecando sistematicamente paisagens genéticas complexas, capacitando os pesquisadores a desvendar os mecanismos moleculares subjacentes aos fenômenos biológicos e permitindo que os cientistas identifiquem e direcionem as causas profundas de doenças como câncer, fibrose cística e anemia falciforme. Entre todos, o câncer representa um desafio formidável para a medicina, estimulando os esforços de erradicação. A radioterapia, como tratamento tradicional, produz resultados, mas tem limitações. Erradica as células cancerígenas, mas também danifica os tecidos saudáveis, causando efeitos adversos que reduzem a qualidade de vida. Além disso, nem todas as células cancerígenas respondem à radioterapia e algumas podem desenvolver resistência, piorando a condição. Para resolver isso, é introduzida uma tecnologia abrangente de tela CRISPR de genoma inteiro, pois permite a identificação eficiente de genes radiossensíveis e radiorresistentes, avançando assim no campo da pesquisa e tratamento do câncer. Uma triagem CRISPR em todo o genoma foi realizada em células de adenocarcinoma de pulmão expostas à irradiação seguindo o protocolo descrito, por meio do qual foram identificados genes associados à radiorresistência e à radiossensibilidade.

Introdução

A investigação de fenômenos biológicos está inerentemente entrelaçada com o estudo de comportamentos celulares e, por sua vez, o exame de comportamentos celulares está fundamentalmente ligado à exploração de seu genoma. À medida que a tecnologia moderna continua a evoluir, os pesquisadores médicos estão progressivamente redirecionando sua atenção para a alteração do comportamento celular por meio da edição de genes, a fim de melhorar os resultados do tratamento de várias doenças. Nesse sentido, a tecnologia de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR) surgiu como uma ferramenta revolucionária para edição de genoma devido à sua aplicação relativamente simples1. O sistema CRISPR-Cas9 consiste em nuclease Cas9 e RNA de guia único (sgRNA), que reconhece e se liga especificamente à sequência de DNA alvo, guiando a nuclease Cas9 para cortar naquele local, resultando em uma quebra de fita dupla (DSB) no DNA do genoma 2,3,4. Além disso, a introdução de outras substâncias pode levar a inserções, deleções ou mutações específicas no genoma, permitindo a edição de genes direcionada.

Na pesquisa genômica funcional, a triagem de interferência de RNA (RNAi) já foi um método amplamente utilizado para conduzir experimentos de perda de função em larga escala para investigar os papéis dos genes no câncer. A tecnologia RNAi estuda a função do gene silenciando especificamente os genes-alvo, ajudando os pesquisadores a identificar fatores oncogênicos críticos. No entanto, é limitado por efeitos fora do alvo e eficiência incompleta de knockdown de genes. Efeitos fora do alvo podem levar ao silenciamento de outros genes não-alvo, comprometendo assim a precisão e a confiabilidade dos resultados experimentais 1,2. Além disso, o RNAi exibe baixa eficiência de knockdown para certos genes, potencialmente falhando em suprimir totalmente a expressão do gene alvo. Em contraste com as telas tradicionais de RNAi, a tela CRISPR demonstra maior especificidade e eficiência3. Essa tecnologia não apenas permite a edição precisa de genes específicos, mas também permite a triagem em larga escala em todo o genoma, fornecendo suporte robusto para a pesquisa da função gênica. A tecnologia de tela CRISPR, uma poderosa ferramenta de edição de genes baseada no sistema CRISPR-Cas9, é usada para rastrear e revelar com eficiência funções desconhecidas de genes específicos nas células 5,6,7,8. Os pesquisadores projetam sgRNAs em lotes para genes ou regiões de genes específicos e preparam bibliotecas de sgRNAs correspondentes com precisão e rigor, garantindo sua integridade e funcionalidade9. Essas bibliotecas de sgRNA são então encapsuladas em partículas lentivirais, que são utilizadas para infectar eficientemente as células hospedeiras. Após a infecção bem-sucedida, as células infectadas são cultivadas sob condições de triagem definidas pessoalmente. Após a triagem, o DNA genômico das células rastreadas é extraído, mantendo altos padrões de pureza e quantidade. Posteriormente, regiões-alvo de interesse de sgRNA são submetidas à amplificação por PCR, um processo que replica com precisão os segmentos desejados de ácidos nucléicos 3,9. Finalmente, o sequenciamento de alto rendimento é realizado nos fragmentos de DNA amplificados, permitindo uma análise abrangente e eficiente das regiões-alvo, fornecendo informações valiosas sobre a função e o comportamento dos genes em estudo4.

O câncer representa uma ameaça formidável à saúde humana como uma doença complexa. Em todo o mundo, pesquisadores e médicos estão fazendo esforços conjuntos para desvendar os mecanismos moleculares da carcinogênese e desenvolver novas estratégias terapêuticas. Colaborações internacionais foram estabelecidas para acelerar a tradução de resultados de pesquisa básica em aplicações clínicas, com o objetivo final de melhorar os resultados dos pacientes. Sasmal et al. propuseram uma estratégia de montagem bio-ortogonal baseada em um sistema sintético hospedeiro-hóspede para direcionamento preciso de células cancerígenas metastáticas, o que ajudou significativamente dezenas de cientistas no avanço das tecnologias médicas. Seu excelente trabalho de pesquisa tem alta inovação e insights únicos, fazendo contribuições significativas para a comunidade científica10. O câncer é caracterizado pelo estado tumultuado de instabilidade genômica, decorrente da regulação errática das respostas de dano ao DNA11-14. O dano ao DNA inclui defeitos de nucleotídeo único, quebras de fita simples e DSBs. A recombinação homóloga (HR) e a junção final não homóloga (NHEJ) participam do reparo de DSBs em diferentes estágios 15,16,17. Com base nisso, a radioterapia surgiu como uma opção de tratamento viável, que utiliza raios de alta energia (como raios-X e γ raios) para irradiar o tecido tumoral, causando danos ao DNA nas células tumorais, interrompendo seu crescimento e proliferação18. No entanto, a radioterapia nem sempre produz os efeitos desejados em uma proporção significativa de pacientes oncológicos, podendo ser decorrente de danos aos tecidos paracancerosos e limitações impostas pelas características inerentes ao tumor, como baixa sensibilidade à radioterapia 19,20,21.

Teoricamente, qualquer tipo de célula pode ser usado para uma tela CRISPR. No entanto, manter uma representação suficiente em populações mutantes requer um grande número de células iniciais. Tipos de células com baixa abundância não são particularmente adequados para triagem de todo o genoma. Quanto à escolha da biblioteca, a maioria das bibliotecas contém 3-6 gRNAs por gene alvo, e manter a distribuição de cada gRNA dentro da população é crítico18. A perda de representação devido ao enriquecimento ou esgotamento de gRNAs específicos pode levar a uma distribuição desigual dos resultados. Para resolver esse problema, optar por bibliotecas CRISPR disponíveis comercialmente que foram testadas no mercado pode ser uma escolha preferível20. In vitro A triagem CRISPR usando linhagens homogêneas de células cancerígenas pode não capturar totalmente a heterogeneidade genética e epigenética dos tumores in vivo . Embora a triagem in vitro tenha revelado genes-chave envolvidos no reparo de danos ao DNA e na sinalização autócrina induzida por radiação, ela não replicou totalmente o microambiente tumoral, incluindo radiorresistência induzida por hipóxia (via ROS, adaptação metabólica e autofagia), efeitos parácrinos mediados imunologicamente e modulação de citocinas dependente de MEC. Antes de empregar a tela CRISPR para explorar genes associados à sensibilidade ou resistência à radiação, esses fatores devem ser cuidadosamente considerados. À luz do cenário atual do tratamento, é urgente identificar e estudar profundamente os fatores associados à radiorresistência e à radiossensibilidade para aumentar efetivamente a eficácia da radioterapia22. Dada a principal vantagem da tela CRISPR no estudo das funções de genes desconhecidos, uma tecnologia de tela CRISPR de genoma completo sistematicamente detalhada é fornecida para identificar com eficiência genes radiossensíveis e radiorresistentes.

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Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Selecionando uma dose apropriada de radiação

  1. Preparação e plaqueamento de células aderentes
    1. Ajuste a densidade celular para 5 x 105 células por mL com o meio de cultura celular completo RPMI 1640 contendo 10% de FBS para passagem e crescimento celular. Distribua as células em placas de cultura de 3,5 cm para radiação em diferentes doses. Adicione 2 mL (1 x 106 células) a cada prato e incube durante a noite a 37 ° C com 5% de CO2.
  2. Aplicação de diferentes doses de radiação
    1. Numere as placas de cultura de 3,5 cm de 1 a 5. Utilize o Grupo #1 como grupo de controle, com os 4 grupos restantes designados como grupos de tratamento.
    2. Sele as bordas das placas de 6 poços com uma membrana de vedação para grupos de tratamento e administre doses de radiação de 2, 4, 6 e 8 Gy, respectivamente. Após o tratamento, devolva os pratos à incubadora.
  3. Plaqueamento de linhagens celulares após radiação
    1. Prepare placas de 6 e 96 poços. Lave as células nas placas de cultura de 3,5 cm uma vez com PBS, digerir as células de crescimento logaritmical com 0,25% de tripsina e ajustar a densidade celular para 1 x 105 células por mL com meio completo RPMI 1640 contendo 10% de FBS.
    2. Semeie 10 μL / poço (1.000 células / 100 μL) nas placas de 6 poços em 3 repetições para cada dose de radiação. Adicione 2 mL de meio completo a cada poço e conte após 14 dias (quando cada grupo de clones tiver aproximadamente 50 células).
    3. Semeie 30 μL / poço (3.000 células / 100 μL) nas placas de 96 poços em 5 repetições para cada dose de radiação. Adicione 70 μL de meio completo a cada poço e meça a viabilidade celular após 72 h.
  4. Medição da viabilidade celular
    NOTA: Taxa de inibição clonogênica = 1 - (número de clones no grupo de tratamento/número de clones no grupo controle) x 100%. O ensaio CCK-8 utiliza um sal de tetrazólio solúvel em água (WST-8) que pode ser reduzido por desidrogenases celulares para gerar um produto de formazan amarelo altamente solúvelem água 11. A quantidade de formazan produzida é diretamente proporcional ao número de células viáveis, e sua densidade óptica (medida no comprimento de onda de 450 nm) reflete com precisão a atividade metabólica celular e o estado proliferativo11,13. Com base nesse princípio bem estabelecido, o ensaio CCK-8 foi amplamente adotado para várias aplicações, incluindo ensaios de proliferação celular e testes de sensibilidade a drogas tumorais. Neste protocolo, o ensaio CCK-8 é empregado para avaliar sistematicamente a viabilidade celular sob diferentes doses de radiação.
    1. Misture o reagente CCK8 com meio RPMI 1640 sem FBS na proporção de 1:9. Descarte o meio nas placas de 96 poços e adicione 100 μL do meio contendo CCK8 a cada poço.
    2. Incubar na obscuridade durante 1 h e medir o valor de diâmetro externo a 450 nm utilizando um leitor de microplacas.
      NOTA: Taxa de sobrevivência celular = [(valor OD do grupo de tratamento - valor OD do poço em branco) / (valor OD do grupo controle - valor OD do poço em branco)] x 100%
  5. Seleção da dose de radiação
    1. Integrar a taxa de inibição clonogênica com a taxa de sobrevivência celular, a fim de selecionar uma dose de radiação apropriada com base nas necessidades de pesquisa. Selecione uma dose de radiação com uma taxa de inibição de 50% para rastrear genes radiorresistentes e radiossensíveis.

2. Selecionando a concentração apropriada de MOI e puromicina

  1. Plaqueamento de células aderentes
    1. Ajuste a densidade celular para 3 x 105 células por mL e inocule 1 mL (3 x 105 células) por poço em uma placa de 12 poços. Incubar a placa durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Infecção lentiviral
    1. Use uma pipeta para aspirar o meio da placa de 12 poços e substitua-o por 1 mL de meio completo RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Prepare uma biblioteca lentiviral CRISPR de genoma completo com qualidade verificada (bibliotecas disponíveis comercialmente são recomendadas) e configure um gradiente de concentração logarítmica (por exemplo, 0-10-50-100-200-400-800)4,5,6,7,8.
    2. Adicione a quantidade correspondente de lentivírus a 2 μL / prato de polibreno e equilibre em temperatura ambiente por 5 min. Goteje lentamente a mistura de lentivírus e polibreno em cada poço, misture bem e incube durante a noite a 37 ° C com 5% de CO2.
  3. Determinação da concentração mínima de puromicina para a morte celular
    1. Ajuste a densidade celular parental para 3 x 105 células/mL e inocule 1 mL (3 x 105 células) por poço em uma placa de 12 poços. Incubar a placa durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
    2. Adicionar puromicina a cada alvéolo da placa de 12 poços num gradiente de concentração de 0-0,1-0,2-0,5-1-2-4-8 μM. Contar as células após 72 h. A concentração mínima que mata todas as células no poço é a concentração mínima de puromicina para morte celular, que será usada para triagem subsequente de células infectadas por vírus.
  4. Seleção de puromicina pós-infecção
    1. No segundo dia após a infecção, aspire o meio de cada poço e substitua-o por 1 mL de meio completo RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Continue cultivando por 48 h.
    2. Após 72 h de infecção, substitua o meio existente por meio completo contendo a concentração mínima de puromicina para matar as células. Configure 2 poços na placa de 12 poços sem infecção lentiviral como controles negativos e positivos. Trate o controle negativo com puromicina e deixe o controle positivo sem tratamento. Continue cultivando por 72 h.
    3. Após 72 h de seleção de puromicina, todas as células parentais no controle negativo estarão mortas, enquanto as células parentais no controle positivo mostram morte mínima. Calcule o MOI para cada poço.
      NOTA: MOI = (Número de células no grupo infectado pelo vírus / Número de células no grupo de controle positivo) x 100%. Use a concentração de vírus com um MOI de ~0,3 para triagem subsequente.

3. Infecção da biblioteca lentiviral CRISPR em todo o genoma

  1. Semeadura de linhagens celulares aderentes
    1. Ajuste a densidade celular para 1 x 107 células por mL em meio completo RPMI 1640 contendo 10% de FBS para passagem e crescimento celular. Inocular 1 ml de células (1 x 107 células) em cada placa de cultura de 15 cm a 37 °C com 5% de CO2 durante 8 h. Uma vez que as células aderiram e atingiram uma confluência de 70% a 80%, elas estavam prontas para a infecção viral (perfazendo um número de cópias de aproximadamente 500).
  2. Infecção lentiviral
    1. Aspire o meio das placas de cultura de 15 cm e substitua-o por 15 mL de meio completo RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Prepare uma biblioteca lentiviral CRISPR de genoma completo com qualidade verificada.
    2. Adicione a quantidade correspondente de lentivírus com o MOI = 0,3 a 30 μL / prato de polibreno e equilibre à temperatura ambiente por 5 min, pingue lentamente a mistura de lentivírus e polibreno nos pratos de cultura de 15 cm, misture bem e incube a 37 ° C com 5% de CO2 durante a noite. Simultaneamente, prepare uma placa de cultura de 15 cm com a célula parental como contraste.
  3. Seleção de puromicina pós-infecção
    1. No segundo dia após a infecção viral, aspirar o meio das placas de cultura de 15 cm e substituí-lo por 15 mL de meio completo RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Continue cultivando por 48 h.
    2. Às 72 h após a infecção, substitua o meio por meio completo contendo a concentração mínima letal de puromicina. Trate as células parentais não infectadas como um controle negativo da mesma maneira e continue a cultura por 72 h. Após 72 h de seleção de puromicina, as células parentais no grupo de controle negativo serão todas mortas e as células sobreviventes da infecção lentiviral serão consideradas infectadas com sucesso.
  4. Extração do genoma do Dia 0
    1. Digerir as células de uma placa de cultura de 15 cm utilizando tripsina a 0,25%, ressuspender em meio completo RPMI 1640 contendo 10% de FBS e contar o número de células. Rotule este exemplo como Dia 0.
    2. Centrifugue a 300 x g durante 5 min (à temperatura ambiente) e elimine o sobrenadante. Ressuspenda em 1 mL de PBS, centrifugue a 300 x g por 5 min e descarte o sobrenadante. Extraia o DNA genômico do dia 0, meça a concentração e a pureza do DNA usando um espectrofotômetro UV nanodrop.
    3. Para detecção de integridade de sgRNA, use a eletroforese em gel de agarose para analisar a biblioteca de sgRNA amplificada, garantindo que as bandas estejam claras e sem degradação significativa, preservando assim a integridade da biblioteca23. Para avaliação da cobertura da biblioteca lentiviral, empregue a tecnologia de sequenciamento profundo para realizar análises de sequenciamento nos sgRNAs dentro da biblioteca24,25.
    4. Na tela CRISPR, a amplificação por PCR serve como uma verificação preliminar da integridade do fragmento de sgRNA e da qualidade da biblioteca6. Para analisar de forma mais abrangente a cobertura da biblioteca e os padrões de distribuição de sgRNA e garantir a representação adequada de sgRNAs para cada gene alvo durante a triagem, execute NGS para obter informações detalhadas sobre a robustez da triagem9.
      NOTA: Ao detectar mudanças na abundância de sgRNA pré e pós-triagem e identificar a potencial integração de sgRNA fora do alvo ou contaminação da biblioteca, a precisão e a confiabilidade da tela CRISPR podem ser melhoradas ainda mais. Essas amostras do Dia 0 servem como controles negativos cruciais e passam por uma avaliação de qualidade abrangente por meio de amplificação por PCR e NGS para atingir 2 objetivos principais: (1) confirmação da depleção de genes essenciais (indicando representação adequada da biblioteca) e (2) demonstração de expressão estável em genes não essenciais (estabelecendo condições experimentais de linha de base)9.
    5. Garantir que a cobertura atinja o nível esperado para garantir a diversidade e representatividade da biblioteca e evitar vieses no processo de triagem. Para medição da eficiência da infecção, use imagens de fluorescência para avaliar a eficiência da infecção, garantindo que ela atenda aos requisitos do experimento.

4. Aplicação de radiação como condição de triagem

  1. Agrupamento
    1. Ajuste a densidade das células infectadas por CRISPR para 1 x 107 células por mL e inocule 1 mL em cada placa de Petri de 15 cm. Incubar durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Tratamento de radiação
    1. Divida aleatoriamente as células em 2 grupos: um grupo de tratamento e um grupo de controle, com 6 pratos por grupo. Administre uma dose apropriada de radiação às células do grupo de tratamento, enquanto deixa as células do grupo de controle sem tratamento para se propagarem normalmente. Após a radiação, continuar a incubar a 37 °C com 5% de CO2 durante 7 dias.
    2. Na segunda semana, repita a administração de uma dose apropriada de radiação às células do grupo de tratamento, deixando as células do grupo de controle sem tratamento e permitindo que elas se propaguem normalmente. Após a radioterapia, continue a incubar a 37 °C com 5% de CO2 por mais 7 dias.

5. Extração e sequenciamento do genoma

  1. Extração do Dia 14
    1. Após 14 dias de tratamento, digerir as células dos grupos de tratamento e controle com 0,25% de tripsina, ressuspendê-las usando meio RPMI 1640 completo contendo 10% de FBS e rotulá-las como Dia 14-RT ou Dia 14-NC.
    2. Centrifugue as células a 300 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante. Ressuspenda em 1 ml de PBS, centrifugue a 300 x g durante 5 min e elimine novamente o sobrenadante. Extraia o DNA genômico do dia 14 e detecte a concentração e a pureza do DNA usando espectroscopia de absorbância UV nanodrop.
  2. amplificação por PCR
    1. Prepare os primers correspondentes da sequência (consulte a Tabela de Materiais) e dilua-os a 10 μM.Configure um sistema de reação de 20 μL adicionando os reagentes em um tubo de microcentrífuga estéril, centrifugue por 5 s a 300 x g e misture bem. Defina os parâmetros do instrumento de PCR de acordo com a condição de amplificação para obter produtos de PCR.
  3. Detecção de eletroforese em gel de agarose
    1. Prepare uma placa de fundição de gel, sele as bordas do molde com agarose, insira o pente e prepare um gel de agarose de concentração apropriada de acordo com o comprimento do DNA da amostra.
    2. Pese com precisão uma certa quantidade de pó de agarose, adicione uma quantidade adequada de tampão de eletroforese, misture bem e aqueça em um forno de micro-ondas para derreter. Depois de esfriar um pouco, adicione uma quantidade adequada de corante de ácido nucleico, misture delicadamente e despeje lentamente no molde de fundição de gel. Deixe o gel solidificar por 30 min.
    3. Remova o pente e adicione uma quantidade adequada de tampão de eletroforese ao tanque de eletroforese até cobrir o gel. Adicione uma quantidade apropriada de tampão de carga à amostra de DNA, misture bem e use uma pipeta para adicionar lentamente a mistura ao poço da amostra.
    4. Defina a voltagem apropriada com base no tamanho do fragmento de DNA e na concentração do gel de agarose. Após a eletroforese, remova cuidadosamente o gel e coloque-o em um gerador de imagens de gel para observar os resultados e verificar se a amplificação por PCR foi bem-sucedida.
  4. Sequenciamento Illumina
    1. Colete o DNA genômico dos três grupos (grupo do Dia 0, grupo de controle e grupo de tratamento) e envie-o a uma empresa para construção de biblioteca e sequenciamento Illumina. Realizar análise bioinformática e visualização dos resultados do sequenciamento para obter genes sensíveis e resistentes à radioterapia26.
    2. Configure vários experimentos repetidos para análise de dados e conduza análises estatísticas sobre os resultados experimentais para garantir a consistência e reprodutibilidade dos dados27,28.
  5. Avaliação da qualidade dos dados de sequenciamento
    1. Submeter os dados brutos a rigorosos mecanismos de filtragem e controle de qualidade para garantir a precisão do sequenciamento das informações5. Calcule a pontuação Phred (Qphred) para cada nucleotídeo com base na taxa de erro de sequenciamento, usando um algoritmo de conversão especificado e um modelo que avalia a probabilidade de ocorrência de um erro durante a chamada de base28.
    2. Mantenha a taxa de erro de sequenciamento para cada posição base abaixo de 1% (equivalente a um limite Q30) e certifique-se de que pelo menos 80% dos dados de sequenciamento atinjam esse padrão Q30 para dar suporte a procedimentos analíticos subsequentes.
  6. Processamento de dados e controle de qualidade em nível de amostra
    NOTA: Para obter detalhes, consulte os relatórios publicados anteriormente 29,30.
    1. Alinhe as leituras filtradas dos dados de sequenciamento com as sequências da biblioteca sgRNA. Estatísticas de relatório, incluindo a contagem de sgRNAs na biblioteca com alinhamento perfeito, a abundância média de sgRNAs, o número de sgRNAs não detectados e a proporção de leituras de amostras individuais mapeadas com sucesso para a biblioteca de sgRNA. Use uma taxa de mapeamento mais alta para indicar maior cobertura.
    2. Conte o enriquecimento de leituras para cada gene (direcionado por diferentes sgRNAs) em cada amostra. Normalize as leituras de suporte para cada sgRNA em amostras usando o método de normalização "mediana" do MAGeCK. Realize o controle de qualidade em nível de amostra avaliando a distribuição das contagens de leitura de sgRNA, gerando gráficos de caixa, conduzindo a análise de componentes principais (PCA) e construindo mapas de calor de correlação.
    3. Suponha que as contagens de leitura de sgRNA sigam uma distribuição de Poisson. Represente contagens normalizadas de sgRNA de diferentes grupos em gráficos de caixa para visualizar a distribuição geral de dados dentro das amostras e comparar distribuições entre grupos.
    4. Use a PCA para simplificar a análise de dados, refletindo as diferenças entre os componentes principais e a taxa de variação dentro de cada componente, facilitando a observação de variações intra e intergrupos. Use um mapa de calor de correlação para ilustrar as relações entre as amostras.
  7. Análise básica
    1. Realize análises diferenciais de sgRNA entre os grupos e identifique genes essenciais após controle de qualidade e processamento preliminar de dados. Realizar análise de enriquecimento funcional dos genes relevantes30. Classifique os genes essenciais com base na pontuação de agregação de classificação robusta (RRA) calculada pelo MAGeCK ou outros métodos estatísticos, como MLE, com uma pontuação RRA mais baixa indicando maior importância.
    2. Use a linguagem R ou outras linguagens de programação para realizar análises de bioinformática nos resultados classificados e visualize os resultados usando os diagramas de análise GO e KEGG30. Vincule genes ou proteínas aos termos GO correspondentes (função molecular, processo biológico e componente celular) por meio de mapeamento de ID ou anotação de sequência.
    3. Use o KEGG como um banco de dados para entender funções de alto nível e sistemas biológicos, conectando o catálogo de genes identificados às funções do sistema nos níveis celular, de espécie e do ecossistema. Selecione os 10 ou 20 principais caminhos das análises GO e KEGG para uma exibição intuitiva das direções do caminho.

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Resultados

O câncer de pulmão, com a principal taxa de mortalidade, representa uma doença médica altamente agressiva e prevalente. Usando a linha celular de câncer de pulmão A549 como exemplo para conduzir uma triagem CRISPR em todo o genoma com radiação como condição de triagem, o fluxo de trabalho esquemático é mostrado na Figura 1. Primeiro, explore a sensibilidade das células A549 a diferentes doses de radiação por meio da formação de clones e experimentos com CCK8 (Figura 2

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Discussão

Como uma tecnologia de edição de genes de ponta, a tela CRISPR provocou mudanças profundas no campo da pesquisa científica5. Oriunda do sistema CRISPR-Cas9, essa tecnologia tornou-se uma ferramenta essencial para o estudo das funções gênicas devido à sua alta eficiência eprecisão9. O princípio de engenharia CRISPR/Cas9 envolve projetar e introduzir sgRNAs específicos com aproximadamente 20 nucleotídeos para guiar a nuclease Cas9 para locali...

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Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pelo Projeto Regional de Inovação em Ciência e Tecnologia da Província de Hubei (2024EIA001) e pelo Projeto de Apoio à Construção da Plataforma de Inovação em Ciência e Tecnologia Médica do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan (PTXM2025001). A Figura 1 foi criada usando o Figdraw.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Placa de cultura de células e tecidos de 150 mmWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.715011Placa
cultura de células e tecidos de 35 mmWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.706011
Linha celular de cultura celular A549ATCC-
Kit de contagem de células-8Shanghai Beyotime Biotech IncC0041Para ensaio de viabilidade celular
Meio independente de CO< sub>2< / sub>-independentePHCbiMCO-50AICContador
células automatizado Countess 3 FLThemo ScientificAMQAF2001Para contagem de células
EDTAGibco25200056Cultura de células
Soro bovino fetalGibco10099141Cultura de células
Microscopia de fluorescênciaLEICAebq 100-04Para microscópio de fluorescência
Biblioteca lentiviral CRISPR de todo o genomaShanghai OBiO Technology Co., Ltd.H5070Para infecção lentiviral
MiniAmp mais PCRThemo ScientificC37835Para placas de cultura de células NEST de amplificação por PCR
, 12 poçosWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.712002
Placas de cultura de células NEST de cultura de células, 6 poçosWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.703002
Placas de cultura de células NEST de cultura de células, 96 poçosWuxi NEST Biotechnology Co., Ltd.701001Cultura de células
PBSGibcoC10010500BT
Primer de PCR de cultura celular (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Para amplificação de PCR
PCR primer reverso (GATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCA)Beijing AuGCT Biotech Co., Ltd.-Para amplificação de PCR
PolybreneShanghai Beyotime Biotech IncC0351Para infecção lentiviral
PuromicinaMCEHY-K1057Para seleção pós-infecção lentiviral
RPMI 1640 meio de cultura de célulasGibco23400-021
DNA genômico TIANGENampBeijing TIANGEN Biotech Co., Ltd.DP304para extração de DNA genômico
difratômetro de pó de raios-XPerkinElmerpara radioterapia
de de Kit de de cultura de células

Referências

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