Um procedimento de cirurgia Craniotomia para Brain Imaging crônica

Resumo

Este vídeo e protocolo de demonstrar como a implantação de um vidro coberto janela craniana em roedores. Estas preparações podem ser usados ​​para doenças crônicas in vivo de dois fótons de imagens do neocórtex em escalas de tempo de meses. Também pode ser utilizado para outros tipos de imagem, incluindo imagens sinal óptico intrínseco.

Resumo

Técnicas de imagem estão se tornando cada vez mais importante na função cerebral estudo. Entre eles, dois fótons microscopia de varredura a laser tem emergido como um método extremamente útil, pois permite o estudo do cérebro vivo intacta. Com preparações adequadas, esta técnica permite a observação da mesma área cortical cronicamente, de minutos a meses. Neste vídeo, mostramos uma preparação para a crônica in vivo de imagens do cérebro usando dois fótons de microscopia. Esta técnica foi desenvolvida pioneiramente pelo Dr. Karel Svoboda, que agora é um Howard Hughes Medical Institute na Janelia Farm. Preparações como a mostrada aqui pode ser usado para geração de imagens da estrutura neocortical (por exemplo, a dinâmica dendríticas e axonal), para gravar a atividade neuronal de cálcio utilizando-sensíveis corantes, a imagem dinâmica do fluxo sanguíneo cortical, ou para estudos de imagem óptico intrínseco. Imagem profunda do neocórtex é possível com ótima janela cirurgias cranianas. Funcionar nas condições mais estéril possível, para evitar infecções, juntamente com o uso extremo cuidado para não danificar a dura-máter durante a cirurgia, irá resultar em sucesso e de longa duração coberto de vidro janelas do crânio.

Protocolo

1. Anestesiar ratos com isoflurano (4% para a indução, 1,5-2% para a cirurgia), utilizando IACUC procedimentos aprovados. É importante que a cauda e / ou pitadas toe são usados ​​para garantir que o animal está completamente sedado.
2. Usando um cortador de roedores, raspar o cabelo na parte de trás do pescoço até os olhos.
3. Posicione o mouse em uma moldura estereotáxica, sobre um cobertor cirurgia de água re-circulação. Fixe de forma segura a cabeça com barras de ouvido.
4. Aplicar pomada, para evitar que o olho do animal de secar.
5. Administrar, por via subcutânea, dexametasona (0,2 mg / Kg) e carprofeno (5 mg / Kg) para evitar o inchaço do cérebro e / ou uma resposta inflamatória, respectivamente.
6. Antes de iniciar a cirurgia, esterilizar a área operacional, limpando a pele com três golpes alternados de álcool 70% e betadine.
7. Todos os instrumentos cirúrgicos foram pré-esterilizados usando um copo esterilizador talão. Usando a tesoura que foram esterilizadas com etanol, retire a pele ao longo do topo do crânio, começando com um corte horizontal em toda a base da cabeça, seguido de dois cortes no sentido rostral, quase alcançando as pálpebras, em seguida, dois cortes oblíquos que convergem para a linha média.
8. Uma gota de solução de lidocaína + adrenalina é aplicado neste ponto sobre o periósteo para evitar sangramento excessivo ou dor. Com um bisturi, retirar o periósteo para as bordas do crânio. Além disso, levemente retrair a musculatura da parte de trás do pescoço.
9. Raspe toda a área exposta do crânio com o bisturi para criar uma superfície seca. Isto é muito importante, pois permitirá que a cola para aderir melhor quando aplicado mais tarde.
10. Uma vez que um site de imagens foi escolhido, um está pronto para criar a janela do crânio. Em primeiro lugar, gentilmente "desenhar" um círculo de cerca de 4 mm de diâmetro com o martelo pneumático dental.
11. Depois de um ligeiro de perfuração, aplicar solução de lidocaína + adrenalina novamente sobre a superfície do crânio. Parar a perfuração quando uma camada muito fina de osso é esquerda. Empurrando suavemente o centro da craniotomia para sentir como ele dá forma, pode-se geralmente sabem que este estágio é atingido.
12. De acordo com uma gota de soro fisiológico e tomar vantagem das trabéculas ósseas - a estrutura esponjosa do osso - elevador de distância da craniotomia do crânio com uma pinça ponta fina. A solução salina é importante, pois ajudará a levantar o crânio e prevenir o sangramento da dura-máter.
13. Aplicar Gelfoam que tenha sido previamente embebido em soro fisiológico para a dura-máter para evitar qualquer sangramento pequeno que ocasionalmente ocorre quando o crânio é removido.
14. Após a secagem da superfície dura-máter ea garantia de que não há sangramento, deite cuidadosamente estéril 5 milímetros lamínula de vidro em cima da dura-máter. (Nota: outros grupos, também, colocar uma gota de baixo ponto de fusão de agarose (1,2%) sobre a dura e colocar a lamela em cima do agar).
15. Aplique uma gota de cola à base de cianoacrilato, para o hemisfério oposto do crânio. Com a ajuda de uma agulha, aplicar suavemente a cola ao redor da janela, embora não tendo o cuidado de colocá-lo sob o vidro. Cola pode agora ser aplicada em uma camada fina sobre toda a superfície do crânio.
16. Uma vez que a cola secar, misture acrílica dental e aplicá-lo em toda a superfície do crânio, cobrindo também uma pequena borda da lamínula, para prendê-lo.
17. Depois de garantir a cobertura de vidro, faça um buraco pequeno em torno da janela com acrílico dental. Além disso, incorporar um bar de titânio no acrílico dental. Este bar, mais tarde, ser usado para anexar o mouse de forma segura para o palco do microscópio para a imagem latente. É importante garantir que o bar é o nível, de modo que ela fique paralela com a janela do crânio. Colocando um pedaço de papel sob a barra pode permitir que o bar para permanecer enquanto o nível de acrílico endurece.
18. O acrílico dental é permitido a cura (endurecimento) por 10 minutos, altura em que a barra de titânio é fixado no lugar. Colocar o animal em uma gaiola quente até que ela se recupera.
19. Após a recuperação da anestesia, o animal pode ser trabalhada no mesmo dia.

Discussão

Como temos mostrado no vídeo e nas figuras complementares, a preparação janela cranial, combinado com o uso de dois fótons de microscopia, é uma ferramenta muito poderosa para estudar in vivo a estrutura e função do neocórtex. A técnica requer um rigoroso treinamento para se familiarizar com a anatomia relevante e os procedimentos cirúrgicos fina e habilidades que esta preparação exige. Apenas cirurgias pristine pode ser usado para geração de imagens crônica. Se a duração é manipulado excessivamente ou perfurado, a preparação não deve ser u...

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