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Artigo de método

Construção do Modelo de Xenoenxerto de Adenocarcinoma de Pulmão em Camundongos e Avaliação da Eficiência da Decocção XY através da Via MAPK

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DOI:

10.3791/68023

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25 de abril de 2025

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1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Respiratory Department, First Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Active Substances and Biological Mechanisms of Ginseng Efficacy, Changchun University of Chinese Medicine, 4Jilin Provincial Key Laboratory of Bio-Macromolecules of Chinese Medicine, Ministry of Education, Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

Este estudo demonstra que a decocção XY exerce efeitos terapêuticos contra o adenocarcinoma de pulmão, regulando a via MAPK.

Resumo

O adenocarcinoma de pulmão está aumentando em todo o mundo, levando à exploração e desenvolvimento de métodos de tratamento eficazes. Nos últimos anos, o potencial terapêutico da medicina tradicional chinesa para adenocarcinoma de pulmão, como a decocção XiaoYi (XY), tem sido cada vez mais reconhecido. O mecanismo de ação da medicina tradicional chinesa no tratamento do adenocarcinoma de pulmão continua a ser elucidado. Neste estudo, modelos animais foram usados para investigar os efeitos terapêuticos da decocção XY no tratamento do adenocarcinoma de pulmão. Os componentes químicos de entrada no sangue da decocção XY em camundongos foram separados e analisados nos modos de íons positivos e negativos usando UHPLC-QE-MS. Os resultados foram então validados por meio de experimentos in vivo , que demonstraram redução do tamanho do tumor, melhora das alterações patológicas e aumento da apoptose. Como resultado, quinze componentes absorvidos no sangue após a administração da decocção XY foram identificados: Estaquiose, quercetina-3-O-beta-glicopiranosil-7-O-alfa-ramnopiranosídeo; Imperialine; Espinosina B; Peimine; Base de flavona + 3O, 2MeO, O-Hex; Picropodofilotoxina; (2S,3R,4S,5S,6R)-2-[(2R,3R,4S,5S,6R)-4,5-di-hidroxi-2 [[(3S,5R,8R,10R,12R,13R,14R,17S)-12-hidroxi-17-(2-hidroxi-6-metilhept-5-en-2-il) 4,4,8,10,14-pentametil-2,3,5,6,7,9,11,12,13,15,16,17-dodecahidro-1H ciclopenta[a]fenantreno-3-il]oxi]-6-(hidroximetil)oxano-3-il]oxi-6-(hidroximetil)oxano-3,4,5-triol; Tricina; Ginsenosídeo Rg1; (20R)-ginsenosídeo Rh1; Jujubosídeo B; Aucubina; Ginsenosídeo Rg3; e ácido beta-elemonico. Experimentos com animais demonstraram que a decocção XY inibiu o crescimento do tumor, melhorou as alterações patológicas e promoveu a apoptose das células tumorais de maneira dose-dependente. Os mecanismos envolvidos podem estar relacionados à regulação positiva da expressão das proteínas p-JNK e p-P38 na via MAPK e à regulação negativa da expressão da proteína p-ERK na via MAPK. Em conclusão, a decocção XY tem o potencial de regular a via MAPK e exercer efeitos terapêuticos contra o adenocarcinoma de pulmão.

Introdução

A incidência de câncer de pulmão está aumentando em todo o mundo. É responsável por 18% de todas as neoplasias malignas e é responsável por um número significativo de mortes relacionadas ao câncer 1,2. O câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP) é uma forma prevalente de câncer de pulmão, sendo o adenocarcinoma o principal tipopatológico 3. Devido aos seus sintomas insidiosos, o CPCNP é frequentemente diagnosticado em estágio avançado e apresenta alta taxa de mortalidade 4,5. Pacientes com NSCLC em estágio IV têm uma taxa de sobrevida de cinco anos de apenas 5%6, enquanto mesmo NSCLC em estágio inicial ressecável cirurgicamente tem uma taxa de sobrevida de cinco anos de apenas 50%7.

Atualmente, o tratamento do adenocarcinoma de pulmão inclui cirurgia, radioterapia, quimioterapia, imunoterapia e terapia direcionada. Além disso, a medicina tradicional chinesa (MTC) para adenocarcinoma de pulmão está sendo cada vez mais reconhecida e valorizada8. A MTC tem uma longa história e tem sido utilizada no tratamento de várias doenças oncológicas com resultados terapêuticos efetivos 9,10. Considera o corpo humano como uma entidade inteira, com o princípio terapêutico focado em restaurar o movimento do Qi (Qi refere-se à energia vital que promove a circulação do sangue e dos fluidos corporais, contribuindo para aumentar a imunidade e reduzir a inflamação em pacientes com NSCLC) nos órgãos internos para restaurar o equilíbrio geral e inibir a progressão do câncer.

A MTC não apenas trata doenças oncológicas com baixa toxicidade, múltiplos alvos e alta eficiência11, mas também facilita o reparo de danos causados por radioterapia e quimioterapia, prolongando a sobrevida12.

A tecnologia de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) integra cromatografia líquida com espectrometria de massa para obter a separação e detecção de componentes em misturas complexasde compostos 13. O LC-MS oferece alta resolução, alta sensibilidade e alta especificidade, permitindo a separação e identificação de vários componentes químicos em decocções da medicina tradicional chinesa (MTC). Quando combinada com a química medicinal sérica, que separa e detecta os componentes ativos de entrada sanguínea após administração oral14,15, a LC-MS permite a previsão e análise de potenciais mecanismos de ação da droga. Essa abordagem ajuda a entender a composição química e os componentes farmacológicos das decocções da MTC, fornecendo dados essenciais para pesquisas aprofundadas sobre seus efeitos farmacológicos e aplicações clínicas, tornando-a altamente aplicável na pesquisa da MTC16,17.

A via de sinalização MAPK desempenha um papel crucial na gênese, progressão, metástase e invasão do câncer de pulmão, com Erk, p38 e JNK como subfamílias importantes. As decocções de MTC demonstraram influenciar a expressão de proteínas na via MAPK18. A decocção XiaoYi (XY) é derivada da decocção YiGuan e é usada para tratar adenocarcinoma de pulmão no Primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina Chinesa de Changchun (Figura 1), demonstrando eficácia clínica precisa. No entanto, seu mecanismo terapêutico permanece obscuro.

Neste estudo, a cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas Q-Exactive Orbitrap (UHPLC-QE-MS) foi empregada para elucidar o possível mecanismo terapêutico da decocção XY contra o adenocarcinoma de pulmão, e seus efeitos foram validados por meio de estudos in vivo .

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Changchun (Ética nº 2024008). Camundongos machos C57BL/6 com seis semanas de idade (20 ± 2 g), criados em condições específicas livres de patógenos (FPS), exibiram padrões típicos de atividade física em um ambiente controlado com temperatura e umidade constantes. Eles tinham acesso ad libitum a comida e água e eram mantidos sob um ciclo claro/escuro de 12 horas. Detalhes dos reagentes e equipamentos usados neste estudo são fornecidos na Tabela de Materiais.

1. Preparação do extrato aquoso de decocção XY

  1. Coloque Panax ginseng C.A. Mey (Renshen, 15 g), Chinemys reevesii (Gray) (Guiban, 30 g) e Trionyx sinensis Wiegmann (Biejia, 30 g) em um pote de decocção. Adicione 1000 mL de água deionizada e deixe de molho por 30 min em temperatura ambiente.
  2. Ferva as três ervas da etapa 1.1 por 1 h. Simultaneamente, mergulhe Rehmannia glutinosa Libosch (Dihuang, 30 g), Trichosanthes kirilowii Maxim. (Tianhuafen, 30 g), Coix lacryma-jobi L. var. mayuen (Roman.) Stapf (Yiyiren, 20 g), Paeonia lactiflora Pall. (Baishao, 30 g), Boswellia carterii Birdw. (Ruxiang, 7 g), Commiphora myrrha Engl. (Moyao, 7 g), Agrimonia pilosa Ledeb. (Xianhecao, 20 g), Alpinia oxyphylla Miq. (Yizhiren, 20 g), Ziziphus jujuba Mill. var. spinosa (Bunge) (Suanzaoren, 30 g), Melia toosendan Sieb. et Zucc. (Chuanlianzi, 5 g), Fritillaria thunbergii Miq. (Zhebeimu, 15 g), Anemarrhena asphodeloides Bge. (Zhimu, 10 g), Platycodon grandiflorum (Jacq.) (Jiegeng, 10 g), Polygala tenuifolia Willd. (Yuanzhi, 15 g) e Phragmites communis Trin. (Lugen, 30 g) em outro recipiente por 30 min. Após a imersão, transfira-os para a panela de decocção da etapa 1.1.
  3. Ferva todas as 18 ervas das etapas 1.1 e 1.2 por 30 min. Despeje o líquido de ervas, adicione 1000 mL de água deionizada e ferva por mais 30 min. Repita este processo de fervura três vezes para obter três porções de líquido de ervas, depois misture e misture bem.
  4. Filtre o líquido de ervas misturado através de um pano de 400 malhas. Concentre o filtrado sob pressão reduzida e, em seguida, transfira o líquido de ervas concentrado para o equipamento de resfriamento para processamento posterior.
  5. Despeje o líquido concentrado de ervas em uma bandeja de liofilização e coloque-o na câmara de pré-congelamento de um liofilizador a vácuo. Quando o pré-congelamento estiver concluído, transfira a bandeja para a câmara de secagem por sublimação para remover a água.
  6. Remova qualquer umidade residual em alta temperatura. Pulverize o extrato de ervas liofilizado usando um pulverizador para obter pó de decocção XY liofilizado fino (Figura 2).

2. Preparação de soro contendo medicamento

  1. Atribua aleatoriamente camundongos machos C57BL/6 de seis semanas de idade (20 ± 2 g) no grupo XiaoYi (XY) ou no grupo controle.
    NOTA: A dose do camundongo foi calculada usando o fator de conversão de humano para camundongo:
    Dose experimental equivalente para camundongos (g/kg) = {Dose humana (g/kg) / Peso corporal (70 kg)} x 9,1
    Com base neste cálculo, a dosagem para camundongos foi determinada em 2,6 g / kg.
  2. Pese 0,9152 g de pó de decocção XY liofilizado e dissolva-o em 3,2 mL de água destilada para preparar a solução do medicamento.
    NOTA: Os camundongos foram jejuados por 12 h antes da administração oral.
  3. Administre a decocção XY aos camundongos do grupo XY por meio de gavagem, enquanto administra ao grupo controle um volume equivalente de água deionizada.
  4. 2 h após a administração oral, anestesiar os camundongos com pentobarbital sódico (seguindo protocolos aprovados institucionalmente). Enuclear os globos oculares usando uma pinça para coletar amostras de sangue e, em seguida, sacrificar os camundongos por asfixia por CO2 seguida de luxação cervical seguindo as diretrizes éticas19.
  5. Deixe as amostras de sangue estabilizarem à temperatura ambiente por 90 min. Centrifugar a 3450 x g (4 °C) durante 15 min para recolher o sobrenadante.

3. Análise UHPLC-QE-MS

  1. Adicionar 100 mg de pó liofilizado por decocção XY a 500 μL de solução de extracção (metanol: água = 4:1). Misture bem, sonicate e incube em banho de água gelada por 1 h.
  2. Mantenha a mistura a -40 °C por 1 h e, em seguida, centrifugue a 13.800 x g (4 °C) por 15 min. Filtre o sobrenadante através de uma membrana de filtro de 0,22 μm e, em seguida, combine 100 μL de cada sobrenadante para criar amostras de controle de qualidade (CQ).
  3. Após descongelar as amostras de plasma, retire 400 μL da amostra de plasma do grupo controle e 400 μL das amostras de plasma do grupo XY. Adicione 40 μL de ácido clorídrico (2 mol/L) a cada amostra. Vortex por 1 min e deixe a mistura repousar a 4 °C por 15 min. Repita esta etapa quatro vezes.
  4. Adicione 1,6 mL de acetonitrila e vórtice por 5 min. Centrifugue a 13.800 x g por 5 min a 4 °C. Submeter 1.800 μL do sobrenadante à secagem de nitrogênio.
  5. Reconstituir as amostras secas em 150 μL de metanol a 80% contendo 10 μg/mL do padrão interno por vórtice por 5 min. Centrifugue a 13.800 × g por 5 min a 4 ° C e, em seguida, transfira 120 μL do sobrenadante para um frasco de vidro fresco para análise de LC-MS (Figura 3).

4. Cultura celular e preparação animal

  1. Semear 1 mL de células de carcinoma de pulmão de Lewis em uma placa de cultura contendo o meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina. Incubar as células em condições controladas a 37 °C com 5% de CO2.
  2. Quando as células atingirem 80% de confluência, passe-as com tripsina a 0,25%. Continue passando até que o estado da célula se estabilize e, em seguida, ajuste a concentração da célula para 3 x 106 células/mL.
  3. Injete 0,1 mL da suspensão celular preparada por via subcutânea na axila direita de camundongos C57BL / 6 machos para estabelecer o modelo de adenocarcinoma de pulmão.
    NOTA: O tecido tumoral pode ser palpado na axila de camundongos 5 dias após a inoculação.
  4. Após 5 dias, dividir aleatoriamente os camundongos em cinco grupos (n = 6 por grupo): Grupo modelo (M) - Sem tratamento; Grupo de baixa dose de decocção XY (XY-L) - 1,3 g/kg; grupo de dose média de decocção XY (XY-Z) - 2,6 g/kg; Grupo de alta dose de decocção XY (XY-H) - 5,2 g / kg; Grupo cisplatina (DDP) - Tratado com cisplatina20.
  5. Dissolva o pó de decocção XY em 200 μL de água destilada na dose correspondente e administre-o por gavagem. Os grupos M e DDP recebem um volume igual de água destilada por gavagem .
  6. Administre cisplatina ao grupo DDP por injeção intraperitoneal (3 mg/kg) uma vez a cada 3 dias. Injete o mesmo volume de solução salina fisiológica nos outros grupos.

5. Análise patológica do tecido tumoral

  1. Após 21 dias, eutanasiar todos os camundongos usando asfixia por CO2 seguida de luxação cervical (seguindo as diretrizes éticas) e excisar o tecido tumoral21. Meça o volume e o peso do tumor (Figura 4).
  2. Fixe os tecidos tumorais excisados em paraformaldeído a 4% por 24 h). Desidrate o tecido usando soluções graduadas de etanol.
  3. Limpe os blocos de tecido desidratado usando xileno e incorpore-os em cera de parafina derretida. Deixe a cera solidificar em um bloco de parafina. Corte o bloco de tecido em fatias de 5 μm de espessura usando um micrótomo.
  4. Desparafinar as seções de tecido em xileno, seguido de reidratação em soluções graduadas de etanol. Pinte as seções com hematoxilina por 5 min e depois enxágue com água deionizada.
  5. Contra-corar as seções com solução de eosina a 0,5% por 1 min. Observe as seções coradas sob um microscópio óptico e capture imagens para análise.

6. Análise imuno-histoquímica do tecido tumoral

  1. Realize a desparafinação e a reidratação seguindo os procedimentos descritos nas etapas 5.2-5.4.
  2. Incubar as seções em um bloqueador de peroxidase endógena em temperatura ambiente por 15 min. Bloqueie a ligação não específica incubando as seções com soro de cabra.
  3. Aplique os anticorpos primários: Ki-67 (1:600) e Caspase-3 (1:100). Incubar as secções durante a noite a 4 °C. Lavar com tampão PBS), aplicar um anticorpo secundário de uso geral (1:500) e incubar a 37 °C durante 30 min.
  4. Desenvolva a reação de cor adicionando a solução DAB. Contra-corar as seções com solução de hematoxilina.
  5. Realize a desidratação, limpeza e selagem das seções manchadas. Observe a expressão da proteína sob um microscópio óptico e capture imagens para análise.

7. Análise de Western blot

  1. Homogeneizar os tecidos tumorais usando um lisador de tecidos. Extraia a proteína total e determine sua concentração usando um kit de ensaio de ácido bicinconínico (BCA) (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Realize a quantificação de proteínas, seguida de eletroforese SDS-PAGE e transferência de proteínas para uma membrana.
  3. Incubar a membrana durante a noite a 4 °C com anticorpos primários: P38 (1:2000), p-P38 (1:1000), ERK (1:20000), p-ERK (1:500), JNK (1:2000), p-JNK (1:5000), β-actina (1:200) (ver Tabela de Materiais).
  4. No dia seguinte, incube a membrana com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (HRP) à temperatura ambiente por 1,5 h. Detecte bandas de proteínas usando um sistema de quimioluminescência aprimorada (ECL).
    NOTA: As intensidades das bandas proteicas foram quantificadas usando o software ImageJ.

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Resultados

A solução em pó XY e as amostras de soro do grupo controle e do grupo XY foram analisadas usando UHPLC-QE-MS, revelando picos bem separados. Os diagramas de ionização total para os modos de íons positivos e negativos são mostrados na Figura 3. A composição da decocção XY foi identificada com base no tempo de retenção, modo de aquisição e fragmentos do espectro de massa. Quinze componentes de entrada de sangue foram identificados comparando-se o soro dos grupo...

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Discussão

A incidência de câncer está aumentando anualmente, atraindo significativo interesse clínico e de pesquisa22,23. Estudos recentes demonstraram a eficácia da medicina tradicional chinesa (MTC) no tratamento do câncer de pulmão 24,25,26. Por exemplo, a decocção de Maimendong demonstrou aumentar o número e a atividade das células NK, inibind...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Item do Plano de Desenvolvimento Científico e Tecnológico da Província de Jilin (YDZJ202301ZYTS459).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
AcetonitrilaCNW Technologies08/05/1975
2-Cloro-L fenilalaninaShanghai Hengbo Biotechnology Co., Ltd.103616-89-3
Solução de hidróxido de amônioChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.#2028
Anticorpo-β-actinaAbcamab8228
Anti-Erk1 (pT202/pY204) + Erk2 (pT185/pY187) AnticorpoAbcamab4819
Anti-ERK1/ERK2 AnticorpoAbcamab184699
Anti-JNK1 (pY185) + JNK2 (pY185) + JNK3 (pY223) AnticorpoAbcamab76572
Anticorpo Anti-JNK1/JNK2/JNK3 Abcamab208035
Anti-Ki67 Anticorpode Sinalização CelularGB121141
Anti-p38 (fosfo T180) AnticorpoAbcamab178867
Anti-p38 alfa / MAPK14 AnticorpoAbcamab170099
Kit de ensaio de concentração de proteína BCABoster Biological Technology17E17B46
Albumina de soro bovino (BSA)DAKOBIOFROXX
Inibidor de fosfatase de amplo espectro (100x)Boster Biological TechnologyAR1183
C57bl/6 camundongosLiaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd.SCXK2021-0006
Coluna cromatográficaWatersACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μ m2.1*100 milímetro
CisplatinaChina National Pharmaceutical Group Reagente Químico Co., Ltd.232120
Solução de recuperação de antígeno de citrato (pH 6,0)Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.B2010
Lamínula JiangsuShitai Laboratory Equipment Co., Ltd.10212432C
Estágio criogênicoWuhan Junjie Electronics Co., Ltd.JB-L5
DAB Kit CromogênicoJiangsu Shitai Laboratory Equipment Co., Ltd.
da fábrica WD-9405Ainstrumento do abanador da descoloração do Pequim Liu Yi
, Ltd.JJ-12J
Forno de SecagemXangai Huitai Instrument Manufacturing Co., Ltd.DHG-9140A
Dulbecco modificou a soluçãode recuperação deGibco
EDTA (pH 8,0)Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.B2001
EDTA (pH 9,0) Solução de Recuperação de AntígenoWuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.B2002
Eletroforese bufferNCM Biotech 20230801
Máquina de IncorporaçãoWuhan Junjie Electronics Co., Ltd.JB-P5
EosinChina National Pharmaceutical Group Reagente Químico Co., Ltd.
EtanolChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Soro bovino fetalGibco2166090RP
Ácido fórmicoSIGMA64-18-6
GraphPad SoftwarePrism Software GraphPad, LLCVersão 9.0.0
HematoxilinaChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.H3136
Cromatografia líquida de alta eficiênciaAgilent1260 Infinity II Prime
Centrífuga refrigerada de alta velocidadeThermo Fisher ScientificLegend Micro 17R
Espectrometria de Massa de Alta ResoluçãoThermo Fisher ScientificQ Exactive Focus
HRP-conjugado com cabra Anti-MouseSeraCare5220-0341
Cabra conjugada com HRP Anti-CoelhoSeraCare5220-0336
Anticorpo Secundário Universal de Cabra Anti-Coelho/Rato conjugado com HRPDAKOK5007
Cabra conjugada com HRP Anti-RatoSeraCare5220-0364
Coelho conjugado com HRP Anti-CabraSeraCare5220-0362
Ácido clorídricoChina National Pharmaceutical Group Reagente químico Co., Ltd.H9892
Peróxido de hidrogênioChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.B12555
Kit de quimioluminescência ECL hipersensívelNCM BiotechP10300
Software ImageJInstitutes of Healthv1.8.0
Sistema de imagemNikon (Japão)NIKON DS-U3
Células de carcinoma de pulmão de LewisChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Pano de malhaBaijie100110779650
Instrumento de controle de temperatura de aquecimento de metalBaiwan Electronictechnology Co., Ltd.HG221-X3
MetanolAladdinM116118
MicropipetaDlab Scientific Co., Ltd.KE0003087/KA0056573
Corrediça de microscópioJiangsu Shitai Laboratory Equipment Co., Ltd.10212432C
MicrótomoShanghai Leica Instruments Co., Ltd.RM2016
Forno de MicroondasGalanz Microondas Electrical Appliances Co., Ltd.P70D20TL-P4
Bálsamo NeutroChina National Pharmaceutical Group Reagente Químico Co., Ltd.
Microscópio ópticoNikon (Japão)Nikon Eclipse CI
FornoShanghai Huitai Instrument Manufacturing Co., Ltd.DHG-9140A
PAGE kit de preparação rápida de gelBiosharpPL566B-5
ParaformaldeídoChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.8.18715
Solução salina tamponada com fosfato (1x)Gibco8120485
Marcador de proteína de cor pré-corado (10-180 kDa)Cywin Innovation (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.SW176-02
Tampão de carga de proteína (5X)Boster Biological TechnologyAR1112
pulverizadorShangzhiqiao Co., Ltd.DFT-100A
PVDF (0,45 μ m)Cywin Inovação (Pequim) Biotecnologia Co., Ltd.SW120-01
Solução de transferência rápida de membranaCywin Innovation (Pequim) Biotechnology Co., Ltd.SW171-02
RIPA lisadoBoster Biological Technology Co., Ltd.AR0105
TBS bufferNCM Biotech23HA0102
Estação de trabalho de flotação de tecidosJinhua Kedi Instrument Equipment Co., Ltd., província de Zhejiang.KD-P
NCM Biotech23CA2000
Tripsina (0,25%, 1x)HyCloneJ210045
Aparelho ultrassônico de rupturaNingbo Xinyi ultrasonic equipment Co., Ltd.JY92-IIDN
Nikon (Japão)Liofilizador a vácuo Nikon Eclipse CI
Lanjing Co., Ltd.HD-LG20D
Kylin-BellXW-80A
XilenoChina National Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.
Tecnologia 2005289 desidratador Wuhan Junjie Electronics Co. do antígeno 8121587 212954493511 National 9002010410004160Amortecedor transmembrana celular Microscópio óptico vertical Misturador de vórtice 214736

Referências

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