Extração de DNA micobacteriano usando batimento de grânulos em tampão personalizado seguido de fluxo de trabalho NGS

Summary

Este protocolo mostra que o batimento de contas combinado com a purificação de esferas de captura de DNA fornece um método rápido e consistente para extrair DNA de amostras de Mycobacterium tuberculosis , tornando-o uma escolha eficaz para aplicações de sequenciamento de próxima geração.

Abstract

A tuberculose é uma doença mortal, e o surgimento de resistência a antibióticos na bactéria agente causadora, Mycobacterium tuberculosis, piora os resultados do tratamento. A identificação precisa e rápida da resistência aos medicamentos por meio de tecnologias de sequenciamento é necessária para melhorar os resultados dos pacientes com tuberculose por meio de regimes terapêuticos personalizados. O método de extração de DNA é crítico para ensaios moleculares a jusante e é complicado pela parede celular resistente do Mycobacterium, pela baixa carga bacilar de muitas amostras clínicas e pela complexidade da matriz do escarro. Existem vários métodos de extração de DNA de M. tuberculosis relatados, mas atualmente não há um padrão-ouro. Além disso, poucos desses métodos funcionam de forma consistente e muitos não são adequados para ambientes de tuberculose de baixo recurso e alta carga. Consequentemente, os laboratórios frequentemente introduzem suas próprias modificações de procedimento, resultando em variabilidade significativa do método. Aqui, apresentamos um protocolo econômico, rápido e padronizado para extração de DNA micobacteriano de escarro clínico e cultura que produz DNA adequado para qPCR e que deve ser considerado para uso em laboratórios de diagnóstico clínico.

Introduction

A extração de DNA de alta qualidade de M. tuberculosis é necessária para a detecção de tuberculose resistente a medicamentos (TB) usando sequenciamento de próxima geração direcionado (NGS) e sequenciamento do genoma completo (WGS), mas muitas vezes é negligenciado. Desenvolvemos um protocolo padronizado para fornecer DNA consistente e de alta qualidade para aplicações clínicas de NGS, incluindo abordagens de NGS direcionadas como Deeplex-MycTB (GenoScreen) e sequenciamento do genoma completo, que agora são recomendados pela Organização Mundial da Saúde (OMS) para o diagnóstico de tuberculose resistente a medicamentos. Notavelmente, embora a OMS recomende essas estratégias de diagnóstico baseadas em NGS, ela não especifica os protocolos específicos de extração de DNA para apoiá-las. Nosso método pode ser usado com testes endossados pela OMS, bem como com tecnologias emergentes que exigem DNA micobacteriano de alta qualidade.

O desafio de extração decorre da parede celular única do M. tuberculosis, composta de ácidos micólicos e lipídios que tornam excepcionalmente difícil se abrir. As soluções de extração publicadas atualmente têm variação substancial na lise (por exemplo, sonicação, química, calor e batimento de esferas) e nos métodos de extração de DNA (por exemplo, extração de fenol-clorofórmio, precipitação de etanol, métodos baseados em CTAB e baseados em coluna e esfera), o que resulta em diferenças no rendimento, pureza e qualidade do DNA 1,2,3,4,5,6,7,8 ^,9,10,11,12,13,14,15,16. Além disso, os grupos de pesquisa raramente usam o mesmo método de extração de DNA e geralmente medem o sucesso de maneira diferente. Isso dificulta a determinação de qual método funciona melhor, pois a abordagem ideal depende do tipo de aplicação molecular. Por exemplo, resolver variantes estruturais de M. tuberculosis no escarro usando sequenciamento de leitura longa requer DNA de maior qualidade e polimerase mais precisa do que executar uma ferramenta de diagnóstico paga que visa apenas uma pequena região de rpoB. Vários fatores complicam ainda mais o sucesso da extração de DNA. A quantidade de DNA que podemos extrair varia de acordo com o tipo de amostra, quantas bactérias estão presentes e se existem substâncias (DNA não micobacteriano co-extraído e inibidores de PCR) que interferem no processo. Mesmo aspectos técnicos, como a precisão com que um técnico de laboratório pipeta, podem afetar os resultados. Os métodos atuais geralmente falham no processamento de amostras com baixas cargas bacterianas ou altos níveis de DNA contaminante, que são comumente encontrados em ambientes clínicos 17,18,19.

O batimento de contas em buffer personalizado, seguido por um protocolo de limpeza de contas, oferece vantagens importantes sobre outros métodos. É um fluxo de trabalho simples e rápido que reduz a oportunidade de variação dependente do operador e mantém a integridade do DNA para aplicações NGS a jusante. Essa abordagem padronizada é particularmente adequada para laboratórios clínicos que buscam resultados confiáveis e reprodutíveis usando ensaios de resistência a medicamentos NGS recomendados pela OMS e todas as aplicações WGS.

Protocol

Este estudo foi conduzido na Universidade da Califórnia em São Francisco (UCSF) sob a aprovação do Comitê Institucional de Biossegurança (BUA #BU198320-01GBUA/BABB) e segue as diretrizes de ética em pesquisa da UCSF. Obtivemos amostras de escarro remanescente coletadas pela Discovery Life Sciences sob um protocolo de Isenção de Consentimento aprovado pelo IRB de indivíduos com condições respiratórias não TB.

1. Preparação de tampões

1. Tampão Triton personalizado (Tabela 1): Para preparar 100 mL de tampão Triton personalizado, comece combinando 2 mL de NaCl 5 M, 1 mL de Tris-HCl 1 M (pH 8), 1 mL de Triton X-100 e 0,2 mL de ácido etilenodiaminotetracético 0,5 M (EDTA). Adicione água ultrapura para elevar o volume total para 100 mL. Filtre e esterilize antes de usar. O tampão final contém 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM de EDTA e 1% de Triton X-100.
2. Baixo EDTA TE (Tabela 2): Para preparar 100 mL de tampão de baixo EDTA TE, combine 1 mL de 1M Tris-HCl (pH 8) e 0,02 mL de 0,5 M EDTA. Adicione água ultrapura para elevar o volume total para 100 mL. O tampão final contém 10 mM de Tris-HCl e 0,1 mM de EDTA.

2. Preparação de tubos de lise

1. Usando uma lâmina de bisturi, corte cuidadosamente o fundo de um tubo de tampa de rosca de 1,5 mL logo abaixo do ponto de inflexão.
2. Corte a ponta de uma ponta P1000, corte uma cunha em forma de V perto da extremidade e encaixe o fundo preparado do tubo da tampa de rosca nela. Consulte a Figura 1 para obter um diagrama da colher.
3. Encha um recipiente estéril (por exemplo, um reservatório ou placa de Petri) com grânulos de zircônia-silicato de 0.1 mm e use a colher preparada para distribuir uma colher cheia de grânulos (~ 200 mg) em tubos com tampa de rosca de 1.5 mL.

Figura 1: Colher de distribuição interna de contas. A colher foi projetada para a fácil transferência de ~ 200 mg de grânulos de zircônio de 0,1 mm para tubos de processamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparação de entrada

NOTA: Toda a preparação de amostras deve ser conduzida de acordo com os protocolos de biossegurança de suas instalações. Recomendamos fortemente o manuseio de materiais infecciosos dentro de um Gabinete de Biossegurança Classe II (BSC) para minimizar o risco de exposição a aerossóis.

1. Cultura de células bacterianas
   1. Centrifugue ~ 5 mL de cultura de M. tuberculosis (MGIT ou cultura líquida turva) em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL na velocidade máxima (≥ 3.000 x g) por 10 min.
   2. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, remova cuidadosamente tudo, exceto ~ 500 μL do sobrenadante sem perturbar o pellet. Remova o sobrenadante restante com uma pipeta P1000 sem perturbar o pellet.
   3. Ressuspenda o pellet em 350 μL de tampão Triton personalizado pipetando para cima e para baixo. Se necessário (ou seja, para remover amostras para processamento fora de um BSL-3), desative a amostra de acordo com os procedimentos operacionais padrão.
2. Preparação de escarro
   1. Transfira 1-5 mL de amostra de escarro (espontânea ou induzida) para um tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
3. Liquefação de TDT
   1. Adicione quatro volumes de ditiotreitol 100 mM à amostra de escarro (o volume pode variar). Se estiver usando um reagente comercial, siga as instruções de diluição do fabricante.
   2. Vórtice completamente por 30 s. Incubar à temperatura ambiente (20-25 °C) durante 7 min. Vórtice novamente por 30 s.
   3. Repita as etapas 3.3.1. e 3.3.2. 1x, para amostras muito viscosas, execute até 5 ciclos de incubação-vórtice.
   4. Centrifugue na velocidade máxima (≥ 3.000 x g) por 10 min. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, descarte cuidadosamente tudo, exceto ~ 500 μL do sobrenadante. Remova o sobrenadante restante com uma pipeta P1000 sem perturbar o pellet.
   5. Ressuspenda o pellet em 350 μL de tampão Triton personalizado.
4. Liquefação NALC-NaOH
   1. Para preparar a solução de NALC-NaOH, siga as instruções do fabricante para preparação e diluição.
   2. Adicione quatro volumes de solução de NALC-NaOH à amostra de escarro (espontânea ou induzida, o volume pode variar).
   3. Vórtice por 30 s. Incubar à temperatura ambiente (20-25 °C) durante 7 min. Repita as etapas 3.4.1 e 3.4.2. 1x. Para amostras muito viscosas, execute até 5 ciclos de incubação-vórtice.
   4. Adicione PBS à marca de 50 mL. Vórtice brevemente para misturar. Centrifugue na velocidade máxima (≥ 3.000 x g) por 10 min.
   5. Usando uma pipeta sorológica de 50 mL, descarte cuidadosamente tudo, exceto ~ 500 μL do sobrenadante. Remova o sobrenadante restante com uma pipeta P1000 sem perturbar o pellet.
   6. Ressuspenda o pellet em 350 μL de tampão Triton personalizado. Se necessário (ou seja, para remover amostras para processamento fora de um BSL-3), desative a amostra de acordo com os procedimentos operacionais padrão.

4. Extração de DNA

1. Transfira a suspensão bacteriana inativada (350 μL da etapa 3) para um novo tubo de tampa de rosca de 1,5 mL bem rotulado contendo ~ 250 μL de esferas de silicato de zircônia de 0,1 mm.
2. O talão bateu o lisado a 6,5 m/s por 45 s com 2 min de descanso entre as corridas. Repita para um total de três ciclos de batimento de contas.
3. Centrifugue na velocidade máxima (≥ 12.000 x g) por 2 min e transfira 150 μL do sobrenadante para um novo tubo bem rotulado. Tome cuidado para não transferir grânulos ou detritos celulares.
4. Deixe os grânulos magnéticos de limpeza se equilibrarem à temperatura ambiente por 30 min e vórtice completamente para garantir a ressuspensão completa antes do uso.
5. Adicione 180 μL (volume de 1,2x) de esferas magnéticas de limpeza e misture pipetando para cima e para baixo 10x. Incube em temperatura ambiente por 2 min.
6. Coloque em um rack magnético e espere que a solução desapareça por ~ 2 min. Usando uma pipeta P200, descarte cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as esferas magnéticas.
7. Com o tubo ainda no suporte magnético, adicionar 500 μL de etanol a 70 % (v/v) recém-preparado, distribuindo ao longo da parede oposta do tubo às esferas magnéticas. Aguarde 30 s.
8. Repita as etapas 4.5. - 4.7. para um total de duas lavagens. No final da última lavagem, remover o etanol residual com uma pipeta P10. Seque as contas brevemente por ~ 2 min.
9. Imediatamente após o pellet de esferas ficar opaco, remova o tubo do rack magnético e ressuspenda em 20 μL de tampão Tris de baixo EDTA. Não permita que as contas fiquem secas e rachadas.
10. Misture pipetando ou vórtice para garantir que todas as esferas estejam em solução. Incubar em temperatura ambiente por 5 min.
11. Coloque em um rack magnético e espere que a solução fique clara por ~ 2 min. Transfira o DNA eluído para um novo tubo bem marcado para análise a jusante. Aspire <20 μL de DNA extraído para evitar o transporte de esferas magnéticas.

5. Enumeração qPCR do DNA micobacteriano

1. Para quantificar o DNA micobacteriano usando uma PCR quantitativa direcionada a 99 nucleotídeos do atpE micobacteriano (Rv1305), monte uma mistura de reação de 10 μL por amostra em gelo contendo 5 μL de mistura mestre de sonda universal (2x), 0,4 μL de primer direto (5'-AATTCCTGGTGTAGCGGTGG-3', 10 μM) e primer reverso (5'-GTTTACGGCGTGGACTACCA-3', 10 μM), 0,2 μL de sonda TaqMan (5'-VIC-AGGAGGAACACCGGTGGCGA-MGB-3', 10 μM), 2 μL de molde de DNA e 2 μL de água livre de nuclease (Tabela 3).
2. Execute a reação usando as seguintes condições de ciclo térmico: desnaturação inicial a 95 °C por 60 s, seguida por 35 ciclos de 95 °C por 10 s e 60 °C por 30 s (com uma captura aqui, usando uma taxa de rampa de 2,11 °C/s; Tabela 4).
   NOTA: Neste caso, o qPCR foi realizado usando um ensaio TaqMan com sonda marcada com VIC em um sistema de PCR em tempo real QuantStudio 3,
3. Execute todas as amostras, padrões e controles em triplicados técnicos. Gere curvas padrão usando diluições seriais de DNA purificado de M. tuberculosis . Realize análises de quantificação relativa usando software de análise.
4. Exporte os valores de quantificação relativos resultantes para o formato CSV e visualize usando o R Studio (versão 2024.09.1+394) para gerar gráficos de caixa comparando os rendimentos de DNA entre os métodos de extração.

Results

Testamos o protocolo de extração de DNA em amostras de escarro enriquecidas com M. tuberculosis e M. tuberculosis cultivadas (n = 3 para cada condição). Usando M. tuberculosis H37Rv mc² 7901 cultivado, padronizamos a entrada para 8,4 x 10⁶ células por 50 μL, equivalente a 1 mL de uma cultura de MGIT a 200 GU. Para experimentos de escarro, aumentamos 1 mL de escarro agrupado de indivíduos com condições respiratórias não TB (obtidas comercialmente) com duas concentrações bacterianas di...

Discussion

Neste trabalho, apresentamos um protocolo robusto e validado para extração de DNA de M. tuberculosis de alta qualidade usando bead-beating com limpeza de bead magnético para aplicações moleculares e NGS a jusante.

O método oferece várias vantagens sobre os protocolos de extração de DNA de M. tuberculosis existentes. Enquanto a extração tradicional de fenol-clorofórmio normalmente leva vários dias e introduz produtos químicos perigosos, esse m...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 mm de grânulos de zircônia-silicato	Produtos Biospec	11079101Z	Grânulos usados para bater o grânulo para lisar células micobacterianas
Contas AMPure XP	Beckman Coulter	Rolamento A63880	Grânulos magnéticos para limpeza de DNA pós-lise
EDTA (0,5M, pH 8,0)	Thermo Fisher Científico	AM9260G	Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA
Preparação rápida 24	MPbio, EUA	116004500	Equipamento para batimento de contas a 6,5 m/s
Primer Direto	Thermo Fisher Científico	Síntese personalizada	Sequência de primers: AATTCCTGGTGTAGCGGTGG
H2O (Água, grau de biologia molecular)	Thermo Fisher Científico	BP2819-1	Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA
Sonda Universal Luna	Biolabs da Nova Inglaterra	M3004	Reagente de qPCR para enumeração de DNA micobacteriano
MycoPrep Kit	BD	REF 240863	Digestão de amostras BD MycoPrep para processamento de escarro NALC-NaOH
NaCl (cloreto de sódio, solução 5M)	Thermo Fisher Científico	AM9759	Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA
PBS	Millipore Sigma	Pág. 2272	Processamento de Escarro
Primer reverso	Thermo Fisher Científico	Síntese personalizada	Sequência de primer: GTTTACGGCGTGGACTACCA
Sonda TaqMan	Thermo Fisher Científico	Síntese personalizada	Sequência de sonda: AGGAGGAACACCGGTGGCGA
Tris-HCl (1M, pH 8,0)	Thermo Fisher Científico	AM9855G	Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA
Tritão X-100	Thermo Fisher Científico	28314	Tritão personalizado/componentes de buffer de baixo EDTA