Para entender melhor a resposta da lesão de condrócitos a uma sobrecarga mecânica da cartilagem, o protocolo descreve o desenvolvimento de um modelo de impacto de cartilagem ex vivo que foi subletal por 24 h.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
In vitro Modelo de impacto para gerar lesão subletal de condrócitos em explantes de cartilagem bovina
Neste artigo
Resumo
Resumo
A osteoartrite pós-traumática (PTOA) é uma doença articular progressiva prevalente, degenerativa e dolorosa que normalmente surge após trauma articular significativo, afetando mais de 6 milhões de americanos. O trauma da cartilagem induzido por impacto resulta em uma resposta de lesão de condrócitos que culmina em PTOA. Compreender os eventos moleculares associados à lesão de condrócitos é necessário para desenvolver terapias para prevenir a PTOA ou retardar sua progressão. Para facilitar isso, foi desenvolvido um modelo de impacto de cartilagem ex vivo que foi subletal por 24 h. Explantes osteocondrais foram colhidos de articulações metacarpofalângicas bovinas, e uma torre de queda foi usada para fornecer cargas de impacto aos explantes. Para garantir que a tensão e o impacto fossem aplicados de maneira relativamente uniforme à cartilagem articular, os explantes foram posicionados com a superfície óssea voltada para cima e o osso foi impactado por cima. Diferentes cargas foram aplicadas aos explantes a partir de alturas de carro de 4,0 cm, 4,5 cm e 5,0 cm, resultando em tensões de pico médias de 10,87 ± 1,84 MPa, 11,69 ± 0,67 MPa e 12,98 ± 0,75 MPa, respectivamente. O estudo analisou o papel da presença do osso subcondral na cartilagem durante a cultura pós-impacto e o efeito do uso de um suporte ajustado ou solto durante o impacto, avaliando a viabilidade celular e a apoptose. A cartilagem articular impactada a partir de 4,5 cm, combinada com um suporte ajustado e remoção óssea imediata, forneceu o modelo ideal para induzir lesão da cartilagem com morte celular mínima em 24 h pós-impacto.
Introdução
A osteoartrite pós-traumática (PTOA) é uma doença debilitante que afeta mais de 5 milhões de adultos nos Estados Unidos1. Um único impacto traumático na cartilagem pode desencadear uma resposta de lesão de condrócitos, levando a sintomas de início precoce e uma luta ao longo da vida com dor e disfunção articular2. A cartilagem tem pouca ou nenhuma capacidade intrínseca de reparo e, portanto, existe uma necessidade não preenchida de desenvolver terapias para modificar a progressão da doença3. Como a PTOA está correlacionada com um único evento traumático claramente definido, há uma oportunidade de intervir antes que a doença progrida. No entanto, o desenvolvimento desses tratamentos é dificultado pela lacuna no conhecimento sobre a sinalização molecular que regula a resposta à lesão de condrócitos e leva à osteoartrite pós-traumática 2,3,4. Uma melhor compreensão dos eventos moleculares após a lesão de condrócitos pode ajudar a projetar novos tratamentos terapêuticos que resgatem a resposta à lesão de condrócitos e previnam ou retardem o desenvolvimento de PTOA 2,5,6.
Para entender melhor a sinalização molecular da lesão de condrócitos, pesquisas anteriores utilizaram torres de queda ou dispositivos semelhantes que impactam mecanicamente os explantes de cartilagem para que uma resposta de lesão seja iniciada. Esses estudos têm procurado caracterizar muitos aspectos dessa resposta, incluindo mudanças nas propriedades mecânicas e estrutura 7,8, dano à matriz e síntese 6,9,10,11, disfunção mitocondrial12,13,14,15, vias de transporte iônico 16,17,18,19 e expressão gênica 9,11,20,21,22,23. No entanto, em muitos desses estudos, a viabilidade celular não foi relatada ou foi comprometida, com viabilidade celular de 50% ou menor em alguns estudos 24,25,26. Os efeitos de confusão da baixa viabilidade celular podem dificultar o estudo da resposta à lesão. A morte de condrócitos que se segue imediatamente ao trauma articular é irreversível, mas as terapias que tratam a lesão de condrócitos atenuam a PTOA subsequente27. Para identificar alterações moleculares associadas à lesão de condrócitos e não à perda de células viáveis, é necessário um modelo de impacto da cartilagem que mantenha a viabilidade dos condrócitos por um período de tempo. Além disso, um impacto na cartilagem que gera uma resposta de lesão de condrócitos relativamente uniforme em todo o tecido cartilaginoso forneceria os resultados mais consistentes na análise do comportamento celular.
O objetivo do estudo foi desenvolver e caracterizar um modelo de lesão por impacto ex vivo de baixo custo para cartilagem articular que conserve a capacidade de estudar vias de sinalização inerentes à resposta aguda à lesão da cartilagem. Além disso, esse modelo pode ser usado para avaliar possíveis tratamentos para resgatar a resposta à lesão. Para conseguir isso, primeiro desenvolvemos uma técnica estéril para colher explantes de cartilagem de articulações metacarpofalângicas bovinas de animais esqueleticamente maduros usando uma broca com ponta de diamante montada em uma furadeira. As articulações metacarpofalângicas são descartadas pelo abatedouro quando os animais são processados para consumo alimentar, tornando essa articulação uma fonte de tecido de fácil acesso e baixo custo. Em seguida, estabelecemos um modelo de lesão por impacto em que o espécime osteocondral foi colocado em um suporte sob um dispositivo de torre de queda. Neste modelo, os espécimes osteocondrais foram colocados com a superfície articular voltada para baixo em uma superfície de aço inoxidável polido espelhado # 8, e o osso foi submetido a um impacto de cima, fornecendo uma carga relativamente uniforme ao tecido da cartilagem. Foram determinados os parâmetros de impacto que mantêm a viabilidade dos condrócitos por 24 h após o impacto, enquanto ainda desencadeiam uma resposta de lesão molecular apoptótica. Os suportes que permitiram diferentes quantidades de movimento lateral da amostra durante o impacto foram avaliados quanto ao seu efeito na viabilidade celular e apoptose; Por fim, avaliou-se o efeito da remoção da cartilagem do osso subcondral após o impacto.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
O uso de membros bovinos obtidos de um matadouro local não exigiu aprovação ética, pois os tecidos foram coletados post-mortem de animais processados para consumo alimentar.
1. Colheita de explante osteocondral
- Esterilize os seguintes materiais usando uma autoclave antes da colheita do explante: solução salina tamponada com fosfato (PBS; aproximadamente 1 L por junta), broca de perfuração, adaptador giratório de água, um frasco de lavagem autoclavável, um cabo de bisturi, duas pinças e uma lâmina de serra de autópsia.
- Configure a capa de cultura de tecidos com furadeira e torno dentro de uma bacia para conter o PBS. Monte a broca de perfuração e o adaptador giratório na furadeira e conecte o bico adaptador giratório com uma mangueira a um garrafão cheio de PBS esterilizado. Monte a serra de autópsia e coloque-a dentro do capô (Figura 1A-B).
- Espalhe almofadas descartáveis em uma pilha na capa de cultura de tecidos, uma para cada junta.
NOTA: As almofadas absorvem PBS e líquido sinovial que pode pingar durante a abertura da articulação. O empilhamento de várias almofadas permite a fácil remoção da camada superior quando ela fica muito molhada, proporcionando um espaço de trabalho limpo e seco durante todo o procedimento. - Prepare um tubo de ensaio de 50 mL contendo 70% de etanol e outro tubo de ensaio de 50 mL contendo 0,13% v/v betadina em PBS e coloque-os no exaustor. Coloque a pinça e o cabo do bisturi no tubo de ensaio de etanol para manter a esterilidade durante o manuseio do tecido e coloque uma placa de cultura de células estéril de 6 poços na parte de trás do capuz.
- Prepare 3 mL de meio de cultura celular por amostra prevista. Os meios de cultura consistem em meio de Eagle modificado (DMEM) com piruvato de sódio 0,9 mM, insulina, transferrina e selênio (ITS), 50 mg / mL de ácido L-ascórbico, aminoácidos não essenciais de meio essencial mínimo (MEM), penicilina, estreptomicina e anfotericina B. Adicione ácido L-ascórbico e ITS no dia do uso28.
- Obter patas dianteiras de bovinos de animais esqueleticamente maduros de um matadouro local dentro de 6 h após o sacrifício. Mantenha o lenço de papel no gelo durante o transporte.
- Isole a articulação metacarpofalângica removendo o casco usando uma serra de fita de carne sem abrir a cápsula da junta. Remova a pele usando lâminas de bisturi # 22 sem perfurar a cápsula articular.
- Enxágue bem cada perna fora do gabinete de biossegurança com água fria para remover a sujeira e cubra com betadine para desinfetar.
- Dentro da capa de cultura de tecidos, abra a cápsula articular usando uma nova lâmina de bisturi #22. Isole a articulação distal e mantenha a cartilagem articular hidratada com PBS de um frasco de lavagem (Figura 1C). Cubra a cartilagem articular com gaze estéril embebida em PBS para manter a hidratação.
- Isole ainda mais a articulação metacarpofalângica distal cortando o metatarso com a serra de autópsia (Figura 1D). Coloque a articulação distal no torno com a cartilagem coberta voltada para cima e aperte até ficar firme. Durante todo o processo, umedeça a gaze da cartilagem regularmente com PBS.
- Dobre a gaze para longe de um côndilo e ajuste a posição do torno de modo que a broca de perfuração fique acima da região mais plana da superfície articular (Figura 1E).
- Abra a válvula do garrafão para permitir que o PBS flua através da broca de perfuração. Use um frasco de lavagem para hidratar continuamente o tecido com PBS e resfriar as amostras durante a perfuração.
NOTA: PBS do garrafão e da garrafa de lavagem tem um efeito de resfriamento durante o processo de retirada do núcleo. - Núcleo no côndilo lentamente, pressionando a broca na superfície do côndilo. Libere a pressão com frequência e deixe o calor se dissipar. Continue até que a profundidade de perfuração seja de aproximadamente 2 mm no osso subcondral. Repita para cada lado (Figura 1E).
NOTA: Os sinais de superaquecimento incluem evaporação rápida do fluido ou cheiro de queimado. - Use a serra de autópsia para liberar núcleos osteocondrais cortando o osso paralelamente à superfície da cartilagem articular, continuando a espremer o PBS do frasco de lavagem para a interface da serra de autópsia e do osso osteocondral durante o corte. Durante esta etapa, mantenha a gaze umedecida na superfície da cartilagem articular para evitar a desidratação.
- Armazenar os núcleos osteocondrais (Figura 1F) em solução diluída de betadina (ver passo 1.3) até que todas as articulações tenham sido processadas.
- Enxágue os núcleos osteocondrais em PBS e transfira as amostras para poços individuais de uma placa estéril de 6 poços contendo 3 mL de meios de cultura pré-aquecidos (DMEM com piruvato de sódio 0,9 mM, insulina-transferrina-selênio (ITS), 50 mg / mL de ácido L-ascórbico, aminoácidos não essenciais, penicilina, estreptomicina e anfotericina B) 28. Manter as amostras numa incubadora humidificada a 37 °C com 5% de CO2 até ao procedimento de impacto no dia seguinte.
2. Impacto do explante osteocondral
- Fabrique o suporte de impacto de aço inoxidável com uma superfície de impacto polida espelhada (Figura Suplementar 1 e Figura Suplementar 2) e faça os furos correspondentes na placa de base da torre de queda (Figura Suplementar 3).
- Esterilize os seguintes materiais usando uma autoclave antes do procedimento de impacto: cabeça esférica de impacto de aço inoxidável de 15 mm de diâmetro, suporte de aço inoxidável com superfície de impacto polida espelhada, 4 parafusos 6/32, 4 arruelas, pinça.
- Coloque uma torre de queda que havia sido projetada e fabricada anteriormente29 em um gabinete de biossegurança. Utilizar uma torre de queda com uma cabeça de impactor esférica de 15 mm de diâmetro montada num carro equipado com uma célula de carga e um acelerómetro (figura 2A), com uma massa total do carro de 358,4 g para este estudo.
- Fixe o suporte à placa de base da torre de queda com quatro parafusos autoclavados (Figura 2B). Neste estudo, foram testados suportes com aberturas circulares de 8,7 mm e 9,1 mm de diâmetro.
- Coloque um núcleo osteocondral no suporte (Figura Suplementar 1, Figura Suplementar 2, Figura Suplementar 3) sob a cabeça do impactor da torre de queda com o osso voltado para cima.
NOTA: Optou-se por colocar o núcleo osteocondral com o osso voltado para cima e a superfície articular voltada para baixo30 para uma carga mais homogênea. - Ajuste o carro da torre de queda para a altura desejada em relação ao topo do osso. Determine a altura aproximada da torre de queda a partir de estudos piloto. Alturas de 4,0, 4,5 e 5,0 cm foram avaliadas neste estudo.
- Clique no botão Iniciar no software de aquisição de dados (Codificação Suplementar File 1) antes de liberar o carro da torre de queda, liberando o batente do fuso (Figura 2A) e permitindo que a cabeça do impactor caia sob o peso da gravidade sobre a amostra. Levante imediatamente o carro e apoie-o no batente do fuso.
NOTA: Durante o impacto, os dados serão coletados a 100 kHz usando um software de aquisição de dados conectado a um módulo de aquisição de dados, que registra sinais de uma célula de carga posicionada entre a cabeça do impactor e o carro, bem como de um acelerômetro. Embora levantemos o carro o mais rápido possível após o impacto, ele não possui um recurso anti-rebote ou outro mecanismo para evitar um segundo impacto. - Coloque o arquivo .txt gerado pelo software de aquisição de dados na mesma pasta que o código de análise de dados do Matlab (Arquivo de Codificação Suplementar 2, também disponível em https://github.com/sogol-younesi/cartilage-impact-analysis) e execute o código de análise de dados para filtrar dados brutos e calcular parâmetros de impacto.
NOTA: O código de análise de dados usa uma espessura de cartilagem de 0,563 mm para calcular a energia de impacto. Isso foi determinado como a espessura média da cartilagem retirada de > 50 locais em cada um dos cinco espécimes em um estudo separado usando o método da agulha31 e um testador mecânico Biomomentum Mach-1. Os parâmetros de impacto são calculados conforme descrito anteriormente32. - Remova a cartilagem do osso com uma lâmina de bisturi # 11, conforme apropriado. Retorne a amostra ao meio e à incubadora umidificada a 37 ° C com 5% de CO2 até a imagem no dia seguinte.
NOTA: O efeito da remoção da cartilagem do osso imediatamente após o impacto ou 24 h após o impacto foi avaliado neste estudo.
3. Caracterização da viabilidade celular em espécimes de cartilagem
- Remova a cartilagem do osso, se necessário. Corte a amostra de cartilagem ao meio com um bisturi afiado. Evite fazer cortes múltiplos; Procure uma única incisão para garantir uma borda lisa.
- Mergulhe cada meia amostra de interesse em uma solução consistindo de homodímero de etídio de 5 μM e 2,5 μM de cálcio AM em PBS. Proteja da luz e incube em temperatura ambiente por 30 min para completar a coloração de mortos-vivos.
- Enxágue as amostras com PBS 2x e mantenha as amostras em PBS até a obtenção de imagens. Imagem assim que possível após a conclusão da coloração.
- Coloque a amostra de cartilagem em pé com algumas gotas de PBS em uma placa de microscopia para que o semicírculo completo seja visível da frente do microscópio. Capture imagens com um microscópio confocal invertido. Dobre a cartilagem levemente com uma pinça se ela não conseguir ficar em pé sozinha.
- Usando FIJI, uma distribuição do ImageJ com plug-ins33 incluídos, primeiro converta a imagem para 8 bits clicando em Imagem > Digite > 8 bits. Em seguida, defina o limite em Imagem > Ajustar > Limite e clique em Aplicar. Em seguida, execute a função Bacia Hidrográfica em Processar > Binário e execute Analisar Partículas... em Analisar para os canais verde e vermelho. Analise imagens capturadas a uma altura z consistente para cada amostra para comparações precisas entre os grupos.
- Calcule a viabilidade celular dividindo o número de células vivas pelo número total de células na amostra.
4. Caracterização da apoptose em espécimes de cartilagem
- Mergulhe cada meia amostra de interesse em 8 μM de reagente de detecção verde Caspase-3/7 em PBS. Proteger da luz e incubar a 37 °C durante 30 min.
- Lave as amostras com PBS 3x. Fixe as amostras coradas incubando em paraformaldeído a 4% (PFA) por 15 min. Lave com PBS novamente e guarde em PBS até a geração de imagens. Imagem dentro de 24 h após a coloração.
- Imagem com microscópio confocal (consulte a etapa 3.4 acima). Para comparações válidas da intensidade de fluorescência entre os grupos, mantenha parâmetros de imagem consistentes para todas as amostras, incluindo lente objetiva, potência do laser de excitação, ganho do detector de tubo fotomultiplicador, tamanho do orifício, espessura da fatia óptica, velocidade de varredura, média da linha e resolução da imagem.
- Usando a extensão FIJI do ImageJ, selecione Valor médio de cinza no menu Analisar > Definir medidas....
- Use a ferramenta Seção de polígono para contornar toda a área da amostra mostrada em uma imagem. Execute a função Medir no menu Analisar e registre o valor médio de cinza, usando os mesmos parâmetros de processamento entre grupos.
- Use a ferramenta Seção de polígono para selecionar uma área da imagem que não contenha a amostra e execute a função Medir novamente. Registre isso como o valor médio de cinza do plano de fundo.
- Calcule a intensidade de fluorescência subtraindo o valor médio de cinza de fundo do valor médio de cinza da amostra.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
A carga de impacto mecânico aos explantes osteocondrais foi aplicada usando uma torre de queda com alturas de 4,0 cm, 4,5 cm e 5,0 cm acima do tecido (n = 3 ou 4). O aumento da altura do carro antes de ser liberado resultou em maiores forças de impacto, tensões médias de pico, taxas de carregamento e energias de impacto (Tabela 1).
Procuramos desenvolver um modelo de lesão de cartilagem ex vivo que fosse subletal por 24 h após o impacto. A caracterização da coloração ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O objetivo deste estudo foi caracterizar e otimizar um modelo de impacto da cartilagem que não comprometa a viabilidade celular para o estudo de eventos moleculares após lesão de condrócitos, com o objetivo final de desenvolver um tratamento que resgate as células lesadas para prevenir a progressão da PTOA. Em busca desse objetivo, uma carga mecânica foi aplicada à porção óssea dos núcleos osteocondrais, transferindo a carga para o tecido cartilaginoso. Além disso, examinamos diferentes ...
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi apoiado pelo NIH NIAMS Grant R21 AR080255. Os autores gostariam de agradecer a Kevin Carr por fornecer sua experiência em usinagem e fabricação para este projeto. Os autores agradecem ao Mooresville Butcher Shop (Mooresville, IN) por fornecer tecido para este estudo. Os autores agradecem à equipe do Centro de Microscopia Biológica de Indiana por sua assistência com a microscopia confocal.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| #11 lâmina de bisturi estéril | Thermo Fisher Scientific | 10-001-823 | Remove cartilagem do osso |
| #22 lâmina de bisturi estéril | Thermo Fisher Scientific | 10-001-833 | Remove a pele dos tecidos bovinos e abre a articulação cortando os ligamentos |
| 10-1000 pontas de pipeta ul | Thermo Fisher Scientific | 02-707-411 | Meça e transfira PBS, meios de cultura e outras soluções |
| Etanol de 200 provas | Thermo Fisher Scientific | 03-007-647 | Usado para preparar etanol a 70% como agente esterilizante para desinfetar ferramentas cirúrgicas e manter um ambiente estéril durante a preparação e processamento de tecidos. |
| Tubo de centrífuga de 50 mL (estéril) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | Usado para armazenar mídia e amostras |
| Garrafão de 5 galões | Thermo Fisher Scientific | 04-355-233 | Recipiente PBS estéril que é conectado ao adaptador giratório por mangueira. |
| Placa de 6 poços (estéril) | Thermo Fisher Scientific | 140685 | Usado para armazenar temporariamente núcleos osteocondrais em um ambiente estéril com meios pré-aquecidos durante a coleta, incubação antes de estudos de impacto, e imagem Acelerômetro |
| Kistler | 8743A5 | Usado para medir a aceleração produzida durante um | |
| kit de coloração de apoptose de impacto (CellEvent) | Thermo Fisher Scientific | C10423 | Usado para detectar e visualizar células apoptóticas |
| Frascos de lavagem autoclaváveis | Nalgene | 2405-0500 | Encha com PBS estéril para hidratar a cartilagem durante a colheita de tecidos. |
| Serra de autópsia | Mopec | BD 810 | Remova qualquer excesso de osso após abrir a articulação ou extrair o núcleo osteocondral |
| Lâmina de serra de autópsia | Mopec | BD 101 | Usado para cortar o osso para isolar e liberar explantes osteocondrais. |
| Betadine | Avrio Saúde L.P. | n/a | Utilizado para desinfecção do exterior de amostras de bovinos antes de serem movidas para o exaustor e diluídas para desinfecção das amostras osteocondrais finais. |
| Mangueira transparente de 4 pés | n/a | n/a | Usada para conectar o garrafão de 5 litros contendo PBS ao adaptador giratório da furadeira para transportar PBS. |
| Broca de retirada do núcleo | UKAM Industrial Superhard Tools | 3EDCD7160 | Usado para extrair explantes osteocondrais do osso perfurando a cartilagem articular e o osso subcondral.- diâmetro da broca: 7/16" (Brocas de Núcleo de Diamante Eletrodepositadas) |
| Chave crescente | McMaster Carr | 5362A1 | Usado para apertar a braçadeira (que mantém a junta no lugar) e apertar a broca de retirada do núcleo |
| Pipetas sorológicas descartáveis | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | Medir e transferir PBS e meios de cultura |
| Underpad descartável | Thermo Fisher Scientific | 23-666-062 | Usado para cobrir o espaço de balcão para absorver água e líquidos durante a colheita para maior conveniência e higiene |
| Unidades de filtro a vácuo descartáveis | Thermo Fisher Scientific | SCGP00525 | Filter PBS e outras soluções |
| Furadeira | WEN | 433TV 3,25 polegadas | Aplique força para perfurar amostras osteocondrais - WEN 433TV |
| Torno de ângulo de inclinação da furadeira | WEN | TV434 | Fixa amostras osteocondrais em uma posição fixa no ângulo desejado durante o processo de retirada do núcleo. |
| Torre de queda | feita sob medida | n/a | Usado para impactar as amostras |
| FIJI (ImageJ Extension) | n/a | n/a | Software usado para processar e analisar imagens de microscopia, incluindo viabilidade celular e quantificação de apoptose |
| Fórceps | Fisherbrand | 12-000-163 | Usado para cortar tecido no capuz, abrir a junta e transferir as amostras |
| Gaze (estéril) | Dukal | 6412 | Usado para hidratar a cartilagem articular após a abertura da cápsula articular |
| Garrafa de mídia de vidro de 1 litro | Sigma Aldrich | CLS13951LHTC | Usado para armazenar PBS estéril |
| Luvas | Thermo Fisher Scientific | 19-130-1597D | Usado para proteger a equipe de coleta |
| Insulina-Transferrina-Selênio (ITS) | Gibco | 41400-045 | Suplemento de mídia |
| Software de aquisição de dados LabVIEW National | Instruments | n/a | Captura dados da célula de carga e acelerômetro durante o teste de impacto para análise subsequente. |
| Ácido L-ascórbico | Merck | A4403 | Suplemento de mídia |
| Microscópio de varredura confocal a laser | Olympus | FV1000D | Usado para capturar imagens tridimensionais de alta resolução de amostras de tecido manchado. |
| Kit de coloração de ensaio vivo e morto | Thermo Fisher Scientific | L3224 | Usado para diferenciar entre células vivas e mortas em amostras de tecido para avaliar a viabilidade celular |
| Célula de carga | Kistler | 9712B5000 | Usado para medir a força aplicada durante um impacto. |
| MATLAB | A MathWorks Inc. | n/a | |
| Serra de fita para carne | Skymsen | MSKLE | Remover casco do carpo de amostras de bovinos |
| Micropipeta 10-100 uL | Thermo Fisher Scientific | FBE00100 | Medição e transferência PBS e meios de cultura |
| Meio essencial mínimo (MEM) solução de aminoácidos não essenciais | Gibco | 11140-050 | Suplemento de mídia |
| Modified Eagle' s Meio (DMEM) | Gibco | 10566-016 | Cultura de explante osteocondral. |
| Penicilina-Estreptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15-140-148 | Suplemento de mídia |
| Solução salina tamponada com fosfato | Thermo Fischer Scientific | BP399-20 | Usado para enxaguar, hidratar e resfriar tecidos para manter as condições fisiológicas, prevenir a desidratação e preparar soluções de coloração |
| Porta-amostras na torre de queda | feito sob medida | n/a | Protege o núcleo osteocondral durante o impacto. |
| Cabo de bisturi | Thermo Fisher Scientific | 16-100-107 | Usado para corte preciso, dissecção de tecido e abertura da junta. |
| Parafusos (adicionar ao cad) | Rosca 6-32 Tamanho-18-8 Parafusos de cabeça de soquete de aço inoxidável | ||
| Piruvato de sódio | Gibco | 11360-070 | Suplemento de mídia |
| Cabeça de impactor esférica | McMaster Carr | 9292K52 | Autoclave antes do procedimento de impacto |
| Máscaras cirúrgicas | Filtermask | 375101 | Usado para proteger a equipe de coleta |
| Adaptador giratório de água | UKAM Industrial Superhard Tools | 7035812 | Conecta-se à broca de perfuração para fornecer um fluxo contínuo de PBS para resfriamento durante o processo de perfuração. |
Referências
- Thomas, A. C., Hubbard-Turner, T., Wikstrom, E. A., Palmieri-Smith, R. M. Epidemiology of Posttraumatic Osteoarthritis. J Athletic Training. 52 (6), 491(2017).
- Dilley, J. E., Bello, M. A., Natoli, R. M., McKinley, T. O., Sankar, u Post-traumatic Osteoarthritis: A Review of Pathogenic Mechanisms and Novel Targets for Mitigation. Bone Rep. 18, 101658(2023).
- Grande, D. A., Schwartz, J. A., Brandel, E., Chahine, N. O., Sgaglione, N. Articular Cartilage Repair: Where We Have Been, Where We Are Now, and Where We Are Headed. Cartilage. 4 (4), 281(2013).
- Punzi, L., et al. Post-traumatic Arthritis: Overview On Pathogenic Mechanisms and Role of Inflammation. RMD Open. 2 (2), e000279(2016).
- Chubinskaya, S., Wimmer, M. A. Key Pathways to Prevent Posttraumatic Arthritis for Future Molecule-Based Therapy. Cartilage. 4 (3 Suppl), 13S(2013).
- Ding, L., et al. Mechanical Impact Induces Cartilage Degradation via Mitogen Activated Protein Kinases. Osteoarthritis Cartilage. 18 (11), 1509(2010).
- Bonnevie, E. D., et al. Characterization of Tissue Response to Impact Loads Delivered Using a Hand-Held Instrument for Studying Articular Cartilage Injury. Cartilage. 6 (4), 226(2015).
- Nishimuta, J. F., Levenston, M. E. Response of Cartilage and Meniscus Tissue Explants to In Vitro Compressive Overload. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (5), 422(2012).
- Liu, Q., et al. Effects of Mechanical Stress on Chondrocyte Phenotype and Chondrocyte Extracellular Matrix Expression. Sci Rep. 6 (1), 1-8 (2016).
- Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
- Natoli, M. R., Scott, C. C., Athanasiou, A. K. Temporal Effects of Impact on Articular Cartilage Cell Death, Gene Expression, Matrix Biochemistry, and Biomechanics. Ann Biomed Eng. 36 (5), 780-792 (2008).
- Huser, C. A. M., Davies, M. E. Calcium Signaling Leads to Mitochondrial Depolarization in Impact-Induced Chondrocyte Death in Equine Articular Cartilage Explants. Arthritis Rheumatism. 56 (7), 2322-2334 (2007).
- Delco, M. L., Bonnevie, E. D., Bonassar, L. J., Fortier, L. A. Mitochondrial Dysfunction is An Acute Response of Articular Chondrocytes to Mechanical Injury. J Ortho Res. 36 (2), 739-750 (2018).
- Goodwin, W., et al. Rotenone Prevents Impact Induced Chondrocyte Death. J Ortho Res. 28 (8), 1057(2010).
- Bartell, L. R., et al. Mitoprotective Therapy Prevents Rapid, Strain-Dependent Mitochondrial Dysfunction After Articular Cartilage Injury. Ortho Res. 38 (6), 1257-1267 (2020).
- Zhang, K., et al. Mechanosensory and Mechanotransductive Processes Mediated by Ion Channels in Articular Chondrocytes: Potential Therapeutic Targets for Osteoarthritis. Channels. 15 (1), 339(2021).
- Xu, B. Y., et al. The Potential Role of Mechanically Sensitive Ion Channels in the Physiology, Injury, and Repair of Articular Cartilage. J Ortho Surg. 28 (3), 2309499020950262(2020).
- Lee, W., et al. Synergy Between Piezo1 and Piezo2 Channels Confers High-strain Mechanosensitivity to Articular Cartilage. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), E5114-E5122 (2014).
- Jia, Y. Double-Edged Role of Mechanical Stimuli and Underlying Mechanisms in Cartilage Tissue Engineering. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1271762(2023).
- Chan, P. S., et al. Gene Expression Profile of Mechanically Impacted Bovine Articular Cartilage Explants. J Ortho Res. 23 (5), 1146-1151 (2005).
- Burton-Wurster, N., et al. Genes in Canine Articular Cartilage that Respond to Mechanical Injury: Gene Expression Studies with Affymetrix Canine GeneChip. J Heredity. 96 (7), 821-828 (2005).
- Ashwell, M. S., et al. Changes in Chondrocyte Gene Expression Following In Vitro Impaction of Porcine Articular Cartilage in an Impact Injury Model. J Ortho Res. 31 (3), 385-391 (2013).
- Karnik, S., et al. Decreased SIRT1 Activity Is Involved in the Acute Injury Response of Chondrocytes to Ex Vivo Injurious Mechanical Overload. Int J Mol Sci. 24 (7), 6521(2023).
- Martin, J. A., McCabe, D., Walter, M., Buckwalter, J. A., McKinley, T. O. N-Acetylcysteine Inhibits Post-Impact Chondrocyte Death in Osteochondral Explants. J Bone Joint Surg Am. 91 (8), 1890(2009).
- Argote, P. F., et al. Chondrocyte Viability is Lost During High-Rate Impact Loading by Transfer of Amplified Strain, But not Stress, to Pericellular and Cellular Regions. Osteoarth Cartil. 27 (12), 1822(2019).
- Bush, P. G., Hodkinson, P. D., Hamilton, G. L., Hall, A. C. Viability and Volume of In Situ Bovine Articular Chondrocytes-Changes Following a Single Impact and Effects of Medium Osmolarity. Osteoarth Cartil. 13 (1), 54-65 (2005).
- Coleman, M. C., et al. Targeting Mitochondrial Responses to Intra-Articular Fracture to Prevent Posttraumatic Osteoarthritis. Sci Transl Med. 10 (427), 5372(2018).
- Garrity, J. T., Stoker, A. M., Sims, H. J., Cook, J. L. Improved Osteochondral Allograft Preservation Using Serum-Free Media at Body Temperature. Am J Sports Med. 40 (11), 2542-2548 (2012).
- Bonitsky, C. M., et al. Genipin Crosslinking Decreases the Mechanical Wear and Biochemical Degradation of Impacted Cartilage In Vitro. J Ortho Res. 35 (3), 558-565 (2017).
- Henson, F. M. D., Vincent, T. Chondrocyte Outgrowth Into a Gelatin scaffold in a Single Impact Load model of Damage/RepairEffect of BMP-2. BMC Musculoskel Disorders. 8, 120(2007).
- Jurvelin, J. S., Räsänen, T., Kolmonens, P., Lyyra, T. Comparison of Optical, Needle Probe and Ultrasonic Techniques for the Measurement of Articular Cartilage Thickness. J Biomech. 28 (2), 231-235 (1995).
- Dilley, J., et al. A Reproducible Cartilage Impact Model to Generate Post-Traumatic Osteoarthritis in the Rabbit. J Vis Exp. (201), e64450(2023).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an Open-Source Platform for Biological-Image Analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Buckwalter, J. A., Brown, T. D. Joint injury, repair, and remodelling: Roles in post-traumatic osteoarthritis. Clin Ortho Related Res. 423, 7-16 (2004).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
