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In vitro Exposições à Cannabis de Células Epiteliais Pulmonares na Interface Ar-Líquido

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DOI:

10.3791/68102

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20 de junho de 2025

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1Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 2Research Institute of the McGill University Heath Centre, 3SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment Inc., 4Department of Biology, University of Ottawa, 5Department of Medicine, McGill University

Neste artigo

Resumo

Estabelecemos um modelo in vitro padronizado para estudar a exposição ao vapor de cannabis na interface ar-líquido. Este modelo fornece uma abordagem sistemática para examinar os impactos da cannabis vaporizada, abordando o crescente interesse em vaporizadores de cannabis como uma alternativa ao fumo.

Resumo

A cannabis é usada por cerca de 192 milhões de pessoas em todo o mundo. A maioria das pessoas usa cannabis por inalação de fumaça de cannabis, que contém subprodutos da combustão que podem afetar negativamente a saúde pulmonar. O conhecimento desses riscos levou a um interesse crescente pelos vaporizadores de cannabis, que aquecem a flor seca da cannabis sem queimar. A vaporização da cannabis ainda libera canabinóides para inalação, mas aquece o material vegetal a uma temperatura mais baixa. Atualmente, não existe um modelo in vitro padronizado para avaliar os efeitos do vapor seco de cannabis. Portanto, estabelecemos um modelo para a exposição de culturas de células pulmonares em uma interface ar-líquido (ALI), em que as células são expostas apicalmente à cannabis vaporizada, simulando com mais precisão a fisiologia das células epiteliais pulmonares. Este protocolo garante a entrega consistente e reprodutível de vapor de cannabis à superfície celular, fornecendo uma plataforma confiável para investigar os impactos celulares e moleculares da cannabis vaporizada. Este trabalho é o primeiro a padronizar um método de entrega de vapor de cannabis in vitro , que pode servir como referência para futuras pesquisas pré-clínicas de cannabis.

Introdução

A cannabis é normalmente usada pela inalação de fumaça da queima da flor da planta na forma de um baseado, seja para fins recreativos ou medicinais. As principais atividades biológicas da cannabis são devidas a canabinóides como Δ 9-tetrahidrocanabinol (Δ9-THC) e canabidiol (CBD), que são liberados no corpo após a inalação. A fumaça da cannabis também contém compostos pirogênicos, incluindo agentes cancerígenos, mutagênicos e teratógenos, que têm o potencial de causar resultados adversos à saúde1. Dadas essas preocupações, há interesse em recorrer a vaporizadores de cannabis que aquecem a flor de cannabis sem queimar, na esperança de que isso permita a liberação de canabinóides para posterior inalação, mas sem produtos de combustão. Alguns trabalhos têm sido feitos para caracterizar os componentes químicos do vapor de cannabis, mostrando a presença de canabinóides, mas também de vários tóxicos respiratórios, desafiando a noção de que esses dispositivos são seguros 2,3. Existem lacunas significativas no conhecimento sobre como a cannabis vaporizada afeta os pulmões e outros órgãos.

Os estudos de cultura de células são essenciais em toxicologia para isolar e compreender os efeitos específicos das substâncias inaladas no nível celular, permitindo insights mecanicistas de alto rendimento, econômicos e relevantes para a biologia humana. O método de cultura das células também é um determinante importante dos resultados gerais obtidos em um experimento in vitro . A maioria dos estudos de cultura de células é realizada em um ambiente submerso, onde as células são cultivadas em plástico e expostas apicalmente a meios aquosos. As células epiteliais das vias aéreas, no entanto, apresentam um desafio único a esse respeito. Em todo o sistema respiratório, a superfície apical das células epiteliais está em contato com o ar. Dentro dos alvéolos, as células epiteliais produzem surfactante, enquanto outras células epiteliais das vias aéreas produzem muco; Coletivamente, isso protege e mantém a função pulmonar. As culturas submersas não conseguem replicar a exposição ao ar apical, limitando sua capacidade de modelar o ambiente in vivo com precisão. Uma alternativa aos modelos de cultura submersa é a cultura na interface ar-líquido (ALI), onde as células epiteliais respiratórias são cultivadas em uma membrana revestida de colágeno com meio no lado basolateral enquanto são expostas apicalmente ao ar. As células epiteliais cultivadas na LPA são modelos mais precisos do epitélio respiratório devido à sua capacidade de polarizar, produzir surfactante ou muco e formar junções nesse ambiente4.

Uma consideração adicional que os métodos tradicionais de cultura de células submersas enfrentam é que compostos hidrofóbicos como os canabinóides solubilizam mal em meio aquoso5. Os extratos etanólicos são um solvente comum para estudar compostos hidrofóbicos em culturas submersas 6,7,8,9,10,11,12. Esses extratos permitem que compostos hidrofóbicos e hidrofílicos sejam dissolvidos em meio aquoso. No entanto, uma limitação é o potencial de aglomeração de compostos, bem como compostos que interagem com o meio, os quais podem alterar a biodisponibilidade13,14. Recentemente, houve desenvolvimentos para permitir que compostos em fase de aerossol sejam entregues às células na ausência de um solvente ou meio usando sistemas avançados de exposição, como o expoCube15 (ALI / Transwell in vitro / sistema de exposição ex vivo), bem como outros. A deposição direta de aerossóis e suspensões de partículas usando um sistema de exposição avançado elimina o processo de coleta-ressuspensão crucial para exposições submersas, que é conhecido por alterar substancialmente as propriedades físico-químicas das partículas16. Aqui, descrevemos um protocolo padronizado para a exposição de uma linhagem de células epiteliais alveolares na LPA.

Protocolo

1. Cultura de células epiteliais pulmonares em LPA

NOTA: Aqui, um protocolo para cultura de células A549 em ALI é descrito. Por favor, revise a literatura para o tipo de célula a ser usado no estudo. Diferentes linhagens celulares precisam de uma quantidade diferente de tempo no ALI para se diferenciar, formar junções apertadas e produzir surfactante/muco.

  1. Cultura de células
    1. Prepare o meio adicionando 50 mL de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), 5 mL de Glutamax, 5 mL de antibiótico-antimicótico e 500 μL de gentamicina a um frasco de 500 mL de DMEM.
    2. Coloque o meio preparado em banho-maria por 10-15 min para aquecer a 37 °C.
    3. Pulverize o gabinete de biossegurança com etanol 70% e limpe-o. Assim que o meio estiver aquecido, coloque-o sob o gabinete de biossegurança esterilizado.
    4. Sob a capa de cultura, pipete aproximadamente 10 mL de meio em um tubo de 15 mL.
    5. Recupere as células do nitrogênio líquido e descongele agitando suavemente em banho-maria.
    6. Sob a capa de cultura, pipete as células descongeladas do criovial no tubo de 15 mL.
    7. Centrifugue o tubo de 15 ml a 300 g durante 5 min.
    8. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet.
    9. Misturar o pellet com o meio e transferi-lo para o balão T75 .
    10. Verificar o balão T75 ao microscópio.
    11. Incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 com umidade saturada.
    12. Atualize os meios de cultura de células a cada 2-3 dias.
    13. Passe e cresça as células até que a contagem de células desejada seja alcançada. Para semear uma placa de 12 poços, são necessárias 3 × 106 células.
  2. Revestimento de colágeno de transwells
    1. Preparação da solução de colágeno
      1. Dissolver 10 mg de colágeno tipo IV em 20 mL de ddH2O com 50 μL de ácido acético glacial.
      2. Incubar a 37 °C durante 30 min, agitando ocasionalmente, até dissolver totalmente.
      3. Esterilize a solução filtrando através de um filtro de 0,22 μm.
      4. Alíquota de 1,5 ml da solução para tubos de 15 ml e conservar a -20 °C.
    2. Revestimento de filtros transwell com colágeno tipo IV
      1. Descongelar um tubo de colagénio tipo IV (50 μg/ml) a -20 °C.
      2. Adicione 150 μL de colágeno a cada filtro Transwell.
        NOTA: Apenas placas de 12 poços são compatíveis com o sistema de exposição.
      3. Deixe as placas com as tampas abertas no gabinete de biossegurança (BSC) por 18 h para secar.
      4. Esterilize expondo à luz ultravioleta (UV) por 30 min.
    3. Conservar as placas a 4 °C, embrulhadas em parapelícula, durante um período máximo de 30 dias.
    4. Antes de plaquear as células, enxágue ambos os lados dos filtros com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
  3. Semeando células em inserções e fazendo a transição para ALI
    1. Preparação da suspensão da placa e da célula
      1. Pipete 1,5 mL de meio preparado pré-aquecido em cada poço da placa de 12 poços.
      2. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
      3. Preparar uma suspensão celular com uma concentração de 5 × 105 células/ml em meios preparados.
    2. Semeando células em inserções
      1. Remova a placa de cultura de células preparada da incubadora e coloque-a sob um gabinete de biossegurança esterilizado.
      2. Pipetar 0,5 mL da suspensão celular (2,5 × 105 células/inserção) na parte superior da membrana na inserção.
      3. Cubra a placa com a tampa da placa e coloque-a de volta na incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
    3. Estabelecer ALI
      1. Remova o meio apical 24 h após a semeadura das células.
      2. Substitua o meio basolateral por 0,6 mL de meio preparado. Nesse ponto, as células são expostas apicalmente ao ar, estabelecendo o LPA.
      3. Cultive as células A549 em ALI por até 2 semanas, trocando de meio a cada 2 dias para permitir que as células se diferenciem como foi caracterizado anteriormente4.

2. Avaliação dosimetria da exposição ao vapor de cannabis usando LC / MS

NOTA: Nesta parte do protocolo, métodos livres de células foram usados para caracterizar a dose de vapor de cannabis depositada dentro de cada poço, analisando as concentrações de Δ9-THC. O Δ9-THC adere a materiais plásticos, portanto, apenas frascos de vidro devem ser usados para coleta de amostras. Este método requer que a cultivar de cannabis escolhida contenha Δ9-THC.

  1. Preparação e configuração do sistema de exposição
    1. Configure a tubulação para o sistema de exposição de acordo com o caminho de fluxo especificado (Figura 1A, B): Unidade ENDS > Condensador > Bomba de Puffing > Isométrica Sample Conjunto com bomba Aeroneb > expoCube > Sensor de Umidade com Filtro > Porta de Fluxo de Exposição expoCube.
    2. Ligue os controles de temperatura para aquecer o sistema a 35 °C e 50 °C.
    3. Execute testes de fluxo para garantir que o sistema esteja livre de vazamentos e que as pressões estejam ajustadas corretamente (consulte a Nota técnica do SCIREQ Um guia para solucionar problemas de fluxos irregulares no expoCube).
    4. Ligue as bombas Aeroneb para atingir mais de 75% de umidade relativa.
  2. Teste de dosimetria e preparação do vaporizador
    1. Preparação do vaporizador de cannabis
      1. Moa a flor de cannabis usando um moedor de ervas.
      2. Pesar alíquotas de 0,25 g, utilizando um separador de comprimidos para organizar cada porção.
      3. Coloque inserções de aço inoxidável na linha de exposição da placa transwell de 12 poços dentro do sistema de exposição.
  3. Exposição de inserções de aço inoxidável ao vapor de cannabis
    1. Comece a exposição
      1. Embale o forno vaporizador com 0,25 g de cannabis.
      2. Conecte o vaporizador de cannabis à unidade ENDS do sistema de exposição com uma junta segura e inicie o regime de inalação desejado. Defina o vaporizador para a configuração de temperatura Smart Path Nível 2 .
        NOTA: O sistema de exposição usado neste estudo tem quatro níveis de caminho inteligente para escolher, incluindo Nível 1 (176-188 ° C), Nível 2 (188-199 ° C), Nível 3 (199-210 ° C) e Nível 4 (210-221 ° C).
      3. Crie um perfil de sopro no software flexiWare (software de aquisição de dados; consulte SCIREQ Technote: Um guia para criar perfis para flexiWare 8). Para este protocolo, use um volume de sopro de 70 mL com uma frequência de 4 baforadas/min.
      4. Ligue o vaporizador de ervas secas por 5 minutos antes de trocar de cannabis, removendo a flor de cannabis do forno vaporizador e adicionando 0,25 g de cannabis ao vaporizador. Alterne entre dois vaporizadores para exposição contínua.
      5. Continue as etapas 2.3.1.1-2.3.1.4 até atingir o tempo de exposição desejado.
    2. Após cada exposição, remova cuidadosamente as inserções do sistema de exposição usando uma pinça e prepare-as para a coleta de amostras conforme descrito abaixo.
  4. Coleta e preparação de amostras para análise de LC/MS
    1. Usando uma pinça, coloque os filtros correspondentes a cada exposição em um frasco de vidro rotulado contendo 10 mL de metanol de grau LC / MS (por exemplo, Exposição 1, Exposição 2, Exposição 3).
    2. Lave a inserção.
      1. Coloque cada inserto de aço inoxidável exposto em um frasco de vidro rotulado contendo 10 mL de metanol de grau LC / MS.
      2. Rotule os frascos de acordo com a exposição (por exemplo, Exposição 1 Poço 1-4).
    3. Extrato Δ9-THC
      1. Use um banho de sonicador para sonicar os frascos com inserções por 10 min para extrair Δ9-THC.
      2. Transfira as bulas para um segundo conjunto de frascos de vidro com 10 mL de metanol fresco e sonicate por mais 10 min.
    4. Envie todas as amostras preparadas (poços, lavagem e filtro) para análise LC/MS para quantificar os níveis de Δ9-THC.
  5. Cálculos de dosimetria
    1. Usando os resultados da análise LC/MS, calcule a quantidade de Δ9-THC depositado para determinar a dosimetria do fluxo de exposição (quantidade depositada no filtro) e a dosimetria no poço.
    2. Calcular a relação entre o filtro de fluxo de exposição e a deposição do poço para Δ9-THC.
    3. Use essa proporção para determinar a dose que será administrada às células durante as exposições.

3. Avaliação dosimetria da exposição ao vapor de cannabis usando uma microbalança de cristal de quartzo

NOTA: Este método detalha a configuração e calibração de uma Microbalança de Cristal de Quartzo (QCM) para avaliar a massa de partículas de vapor de cannabis depositadas durante as exposições. Cada QCM fornece medições em tempo real, permitindo uma dosimetria precisa da exposição ao vapor de cannabis.

  1. Preparação e configuração do QCM no sistema de exposição
    1. Configure o sistema de exposição conforme descrito anteriormente.
    2. Conecte cada QCM ao seu módulo eletrônico usando o conector de clipe e conecte o módulo às entradas da unidade inExpose (plataforma de exposição por inalação) com um conector de 7 pinos.
    3. Coloque a(s) inserção(ões) de QCM em uma placa de poço no lado de exposição do sistema de exposição, garantindo que o QCM esteja bem alinhado.
    4. Pré-aqueça o sistema de exposição com QCMs acoplados até que o sistema se estabilize nas temperaturas alvo de 35 °C e 50 °C.
    5. Ative microfluxos e fluxos de exposição de acordo com as configurações experimentais.
  2. Calibrando o QCM
    1. Use o assistente de calibração do software de aquisição de dados para calibrar o QCM antes de cada execução de exposição.
    2. Aguarde até que a barra de calibração azul se estabilize e selecione Avançar para registrar a frequência de ressonância do QCM para cálculos de massa precisos.
      NOTA: A faixa de calibração esperada é de -15% a 15%. Os desvios podem indicar problemas como um QCM sujo ou um conector LEMO desconectado.
  3. Monitoramento em tempo real dos sinais de QCM
    1. Monitore as saídas do QCM; O sistema emite a massa acumulada depositada. O valor é exibido no software de aquisição de dados como parte de um gráfico e o valor presente real.
      NOTA: Para cada execução experimental, a deposição máxima e mínima também são relatadas no software.
  4. Limpando o QCM
    1. Para manter a precisão, limpe o QCM após cada experimento.
    2. Adicione 1 mL de álcool isopropílico a 70% dentro de cada inserção de QCM.
    3. Pipete a solução de álcool para cima e para baixo 2-3 vezes para dissolver os resíduos.
    4. Remova a solução de álcool e deixe o QCM secar completamente ao ar em um ambiente livre de poeira antes do próximo uso.

4. Resultados da exposição das células ao vapor de cannabis

NOTA: Este protocolo foi desenvolvido para avaliar os efeitos do vapor de cannabis nas células respiratórias cultivadas na ALI usando o sistema expoCube. Ensaios pós-exposição, incluindo brometo de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) e lactato desidrogenase (LDH), fornecem informações sobre a citotoxicidade dependente da dose e a atividade metabólica.

  1. Entrega de vapor de cannabis
    1. Configure o sistema de exposição conforme descrito acima: Certifique-se de que o sistema atingiu níveis de temperatura e umidade relativa de 35 °C e 50 °C acima de 75%.
    2. Se estiver usando um QCM, conecte o dispositivo ao seu módulo eletrônico usando o conector do clipe e conecte o módulo às entradas da unidade de exposição por inalação com um conector de 7 pinos. Coloque a inserção de QCM singular em uma placa de poço no lado de exposição do expoCube, garantindo que o QCM esteja bem alinhado.
    3. Abra o sistema de exposição e coloque a placa de cultura de células dentro.
    4. Comece o regime de inalação pela duração desejada com base na seção 2. O uso do QCM permitirá o rastreamento em tempo real do vapor total depositado.
    5. Após a exposição, retorne as células à incubadora até o ponto de tempo desejado do ensaio.
    6. Colete amostras conforme necessário de vários compartimentos, incluindo o compartimento basolateral, a lavagem do compartimento apical (para surfactante ou muco) e o lisado celular.
    7. Ensaios de seleção de dose: Use ensaios de LDH e MTT para ajudar a determinar a dose ideal e a citotoxicidade potencial.
  2. Ensaio de LDH para células em ALI
    1. Coletar mídia: No ponto de tempo desejado após a exposição, colete a mídia do compartimento basolateral.
    2. Transfira 100 μL de mídia coletada para uma microplaca transparente de 96 poços.
    3. Adicione 100 μL de mistura de reação de LDH recém-preparada a cada poço.
    4. Incubar a placa à temperatura ambiente (15-25 °C) durante 30 min, protegendo-a da luz.
    5. Meça a absorbância em 490-492 nm, usando um comprimento de onda de referência acima de 600 nm.
    6. Calcular a citotoxicidade utilizando a seguinte fórmula:
      Citotoxicidade (%) = (valor experimental-controlo negativo)/(controlo positivo-controlo negativo) x 100
  3. Ensaio MTT para células em ALI
    1. Cultive células A549 em ALI conforme estabelecido anteriormente.
    2. Após a administração da exposição no sistema de exposição, retorne as células à incubadora até o ponto de tempo desejado do ensaio.
    3. Dissolva 1 mg de MTT em 1 mL de PBS para fazer a solução de MTT.
    4. Adicione 500 μL de solução de MTT ao lado apical das células e 500 μL de solução de MTT ao compartimento basolateral.
    5. Retorne as células à incubadora a 37 °C durante 1 h.
    6. Remova cuidadosamente todas as mídias.
    7. Adicione 500 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) ao lado apical e 1.000 μL de DMSO ao lado basolateral.
    8. Incube por 1 h para dissolver os cristais de formazan.
    9. Coletar e combinar a solução do lado apical e do lado basolateral.
    10. Meça a absorbância a 540 nm (OD540) com uma referência a 690 nm (OD690).
    11. Calcule a viabilidade celular usando a seguinte fórmula:
      Viabilidade celular (%) = 100 × (OD_exposure médio/controle OD_negative médio)

Resultados

Durante os experimentos com o sistema expoCube, quatro poços recebem a exposição ao vapor de cannabis, quatro poços são expostos ao ar condicionado como controles do veículo e os quatro poços restantes são totalmente fechados como controles negativos (Figura 1C) 17 . Essa configuração permite uma comparação precisa entre condições tratadas, veiculares e negativas. O sistema é umidificado para criar um ambiente adequado para culturas de células (Figura 2), e a regulação da temperatura dentro do sistema aumenta a deposição de partículas por meio da termoforese, permitindo a entrega eficiente de compostos vaporizados às células18. Para quantificar a exposição, medimos a quantidade de Δ9-THC como um marcador de deposição de vapor de cannabis no local de exposição celular. Essa quantificação é crucial para otimizar os tempos e doses de exposição, permitindo que os pesquisadores ajustem os períodos de exposição ativa para atingir as doses desejadas em experimentos de cultura de células (Figura 3). Ao calcular a proporção de Δ9-THC coletado no filtro de fluxo de exposição para a quantidade depositada em poços individuais, podemos estimar a dose real fornecida às células (Tabela 1). Essa dose calculada informa a faixa de exposição desejada, auxiliando na determinação de parâmetros ideais para estudar as respostas celulares ao vapor de cannabis de maneira consistente e mensurável. Isso pode ser realizado para outros canabinóides, dependendo do perfil canabinóide da cepa de cannabis selecionada. Além disso, a análise QCM pode ser realizada para medir a deposição de vapor de cannabis em tempo real. A Figura 4 mostra a deposição de vapor de cannabis em um período de 30 minutos em que o vaporizador e o material de cannabis foram trocados a cada 5 minutos. Cada poço exibiu um aumento consistente na massa ao longo do tempo, indicando deposição efetiva e contínua de partículas inteiras de vapor de cannabis.

figure-results-1
Figura 1: Esquema do sistema de exposição in vitro/ex vivo ALI/Transwell para exposição ao vapor de cannabis no ALI. (A) O vaporizador DaVinci MIQRO foi usado para gerar vapor de cannabis. Esta amostra é umidificada e transportada através do amostrador isocinético para o local de exposição. A unidade de controle permite ajustes nas saídas de fluxo de ar e gradientes de temperatura. (B) Fotografias da configuração do sistema de exposição. (C) O interior do expoCube é compartimentado em três fileiras: uma fileira de teste para exposição ao vapor de cannabis, uma fileira de controle do veículo de ar condicionado e a fileira de controle negativo fechada que permanece intocada por qualquer fluxo de ar. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 2: Perfil de umidade relativa (%) registrado ao longo do tempo. Esses dados mostram os níveis de umidade relativa quando os Aeronebs são ativados, atingindo e mantendo uma umidade média de 75%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 3: Quantificação da deposição de Δ 9-THC por meio da análise LC/MS após exposições de 30 minutos ao vapor de cannabis. (UMA-C) A deposição de Δ9-THC foi medida em cada poço após três exposições independentes ao vapor de 30 minutos, cada uma usando 1,5 g de uma cultivar de cannabis com alto teor de THC. Os níveis de Δ9-THC foram quantificados por LC / MS. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 4: Medições de QCM da deposição de vapor de cannabis no sistema de exposição in vitro / ex vivo ALI / Transwell durante um regime de exposição de 30 minutos. (AD) Cada gráfico representa a deposição cumulativa de partículas de vapor de cannabis nos poços 1-4, com massa medida em microgramas (μg) ao longo do tempo. A taxa de deposição demonstra um acúmulo constante em todos os poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Deposição do filtro de fluxo primário (μg)Deposições de poços (μg)Porcentagem de fluxo primário depositado no poço (%)
Exposição 12142.34.70.22
4.40.2
4.60.22
4.40.21
Exposição 22726.54.10.15
3.90.14
4.40.16
4.60.17
Exposição 324003.60.15
3.80.16
50.21
40.17
Média2422.94.30.18
Desvio padrão292.80.40.03

Tabela 1. Comparação da deposição de Δ9-THC no sistema de exposição in vitro/ex vivo ALI/Transwell entre o filtro de fluxo de exposição e o local de exposição celular.

Discussão

A cultura de células na LPA é um método importante na pesquisa respiratória devido à sua capacidade de representar com mais precisão as condições das vias aéreas in vivo em comparação com as culturas submersas tradicionais19. A cultura em LPA permite que as células epiteliais pulmonares sejam expostas diretamente ao ar em sua superfície apical, mantendo os nutrientes essenciais do meio de cultura no lado basolateral. Essa configuração permite que as células produzam surfactante ou muco, componentes-chave do mecanismo de defesa respiratória que são críticos para capturar e remover partículas inaladas e patógenos 20,21,22. As células A549 são comumente empregadas para estudos in vitro, mas são apenas uma das muitas culturas de células epiteliais respiratórias que podem ser usadas para LPA. Silva e col. revisaram linhagens celulares e culturas primárias do epitélio respiratório para LPA da cavidade nasal aos alvéolos22. A flexibilidade do sistema de exposição ALI apresentado permite que ele seja adaptado para diferentes linhagens celulares e células primárias.

As culturas de LPA são cada vez mais consideradas o "padrão ouro" para estudos inalatórios in vitro , particularmente para pesquisas sobre poluentes atmosféricos, material particulado e outros agentes inaláveis23. Uma das principais vantagens dos modelos ALI reside em sua capacidade de fornecer insights que são mais traduzíveis para efeitos humanos in vivo . No entanto, uma desvantagem notável é a falta de protocolos padronizados para exposições à LPA, o que afeta a reprodutibilidade e a comparabilidade entre os estudos. Uma das lacunas é um fluxo de trabalho de exposição padronizado. Ao expor as células ao vapor de cannabis no ALI, os impactos da cannabis na função celular, viabilidade e citotoxicidade podem ser avaliados. Essas exposições permitem uma avaliação detalhada dos resultados biológicos, incluindo marcadores de citotoxicidade, inflamação e estresse oxidativo. A quantificação precisa dos canabinóides depositados permite estudos reprodutíveis sobre os efeitos celulares do vapor de cannabis (e outras formas de produtos de cannabis), avançando nossa compreensão de seus potenciais impactos na saúde em um ambiente de laboratório controlado.

Os sistemas avançados de exposição abordam as limitações das culturas submersas tradicionais, permitindo a deposição direta de partículas na superfície da célula, proporcionando exposições fisiologicamente mais relevantes. Isso também reduz os efeitos potenciais dos solventes ou transportadores. Ao permitir a deposição direta de partículas sem a necessidade desses solventes, os sistemas de exposição ajudam a minimizar os efeitos relacionados ao veículo. No entanto, algumas considerações relacionadas ao veículo permanecem. Por exemplo, níveis de umidade descontrolados podem causar estresse celular indesejado24, potencialmente impactando os resultados experimentais. Garantir que a umidade seja cuidadosamente regulada para atingir níveis ideais é essencial para manter a estabilidade e a precisão dos resultados das células. Além disso, cada partícula, aerossol ou mistura gasosa tem suas próprias propriedades físico-químicas únicas, que podem alterar a deposição na superfície celular25. É, portanto, importante caracterizar um regime de exposição para cada produto exclusivo. Os fatores que podem impactar a deposição de partículas incluem a termoforese, o movimento de partículas de uma região de temperatura mais alta para mais baixa26. A termoforese ajuda a direcionar as partículas para as células e aumenta a eficiência da deposição.

A consistência e a precisão da dosagem são desafios adicionais ao trabalhar com sistemas de exposição no ALI, particularmente quando aerossóis ou partículas estão envolvidos. A deposição de partículas in vivo no pulmão é um processo complexo influenciado pelo tamanho, forma, densidade e solubilidade das partículas, bem como pela região específica do pulmão que está sendo exposta27. Esses fatores resultam em taxas de deposição variadas que podem ser difíceis de replicar in vitro. Modelos matemáticos, como a dosimetria de partículas multi-path (MPPD), são ferramentas úteis para estimar as taxas de deposição in vivo e orientar a tradução da dose in vitro 28. No entanto, combinar a dosagem in vitro com cenários de exposição in vivo continua sendo um desafio, particularmente para aerossóis complexos com composições heterogêneas.

Para caracterização de dose livre de células, é importante observar que as lavagens de insertos de aço inoxidável tendem a superestimar a deposição, pois os compostos podem aderir tanto às paredes do inserto quanto à base onde as células normalmente estariam localizadas. O QCM oferece uma vantagem aqui ao medir apenas a massa depositada diretamente no local da cultura celular, fornecendo uma avaliação mais precisa da deposição especificamente relevante para a exposição celular.

À medida que a toxicologia avança em direção a modelos fisiologicamente mais relevantes, a adoção de protocolos unificados de exposição ao ALI será fundamental para preencher a lacuna entre os achados in vitro e as respostas humanas in vivo , apoiando avaliações mais confiáveis de tóxicos respiratórios e seus impactos na saúde.

Divulgações

PG e BU trabalham na SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. ETW concluiu um estágio na SCIREQ - Scientific Respiratory Equipment, Inc. através do Programa Mitacs Accelerate. Os demais autores não têm conflitos a divulgar

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelo Canadian Institutes for Health Research (CIHR) Project Grant 162273. O CJB foi apoiado pelo Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS). Este estudo também foi apoiado por uma bolsa Mitacs #IT34076 para ETW.

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Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubo de centrífuga de 15 mL, rack (rack de poliestireno), estérilMontreal Biotech Inc.
frascos de vidro de 30 mL ThomasScientific1755F32
A549 célulasATCCCCL-185
Antibiótico-antimicótico (100x)Wisent450-115-EL
Moedor de ervas de cannabisGenchihttps://www.amazon.ca/Genchi-Grinder-Crystal-Threads-Premium/dp/B094WX443Y/ref=sr_1_10?crid=A1EV93N8PW1V&dib=eyJ2Ijo
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Colágeno da placenta humana, tipo IVSigma-AldrichC7521
Costar 12 mm transwell, 0.4 µ Membrana de poliéster de poros m Inserções StemcellTechnologies38023
Kit de detecção de citotoxicidade (LDH)Roche
Davinci MIQRO-CDAVINCIhttps://davincivaporizer.com/products/davinci-miqro-c
Dimetilsulfóxido Sigma-Aldrich34869
Meio DMEMWisent319-005-CL
Flor de cannabis secaSocié té qué bé coise du cannabishttps://www.sqdc.ca/en-CA/dried-cannabis?&fn1=CannabinoidBalanceLookup
Value&fv1=THC		Cannabinoid Content: 17– 23% de THC < 0,1% de CBD 
Soro fetal bovinoWisent080-150FBS
flexiWare SCIREQhttps://www.scireq.com/downloads/Versão 8.4.1
GentamicinaWisent450-134-XL
Ácido acético glacialSigma-Aldrich100063 
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
inExpose expoCube in vitro exposure package   SCIREQIX-XCP 
Infinite 200 PROTECAN30125944
metanol de grau LC/MSSigma-Aldrich106035
Solução salina tamponada com fosfatoThermoFisher Scientific10010-023
T175 EasYFlask, TC Surface, Filter CapThermoFisher Scientific159910
T75 EasYFlask, TC Surface, Filter CapThermoFisher Scientific
Brometo de tetrazólio azul de tiazoliloSigma-AldrichM 2128MTT
Triton X-100Sigma-Aldrich108603
Banho de limpeza ultrassônicoVWR18303Sonicator Bath
Organizador semanal de pílulasHealthSmart640-8223-0000
MBI601051CVaporizador de ervas secas 11644793001 156499

Referências

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