Method Article

Montagem modular padronizada de operons policistrônicos com clonagem modular (MoClo) usando o kit de ferramentas In-Cloning

DOI:

10.3791/68103

⸱

September 2nd, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Systems and Synthetic Biology (SSB), Wageningen University and Research, Agrotechnology and Food Sciences, 2Max Planck Institute for Terrestrial Microbiology, 3Center for Molecular Biology of Heidelberg University (ZMBH), 4Center for Synthetic Microbiology, Philipps-University Marburg

In This Article

Summary

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Este artigo apresenta um protocolo passo a passo demonstrando como a Clonagem Modular (MoClo) pode ser adaptada para a clonagem de operons policistrônicos.

Abstract

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Os kits de ferramentas de clonagem modular (MoClo) permitem a montagem rápida de construções multigênicas. Eles são baseados na clonagem Golden Gate, que usa enzimas de restrição Tipo IIS que cortam fora de seu local de reconhecimento. Como o reconhecimento e a sequência de corte são desacoplados, as saliências criadas pelas enzimas de restrição do Tipo IIS podem ser escolhidas deliberadamente, e as estratégias de clonagem normalmente impedem o corte de fragmentos de DNA corretamente unidos. Isso permite montagens altamente eficientes de vários fragmentos de DNA em uma única reação. No MoClo, partes funcionais individuais de DNA, como promotores, locais de ligação ribossômica, sequências de codificação e terminadores, bem como montagens de ordem superior, recebem saliências padronizadas, de modo que bibliotecas de peças reutilizáveis possam ser criadas. A maioria dos kits de ferramentas MoClo bacterianos são projetados para clonar unidades transcricionais monocistrônicas e não fornecem um caminho estruturado para a montagem de operons policistrônicos. Este protocolo demonstra a montagem de unidades de transcrição policistrônica com o kit de ferramentas de clonagem interna e externa . A mesma abordagem é transferível para outros kits de ferramentas MoClo.

Introduction

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A clonagem molecular, a introdução de DNA recombinante em um replicon como um plasmídeo, é uma metodologia fundamental em biologia molecular. Os métodos de construção e montagem do DNA tornaram-se cada vez mais sofisticados nas últimas décadas. Até agora, os pesquisadores podem construir cromossomos sintéticos inteiros e até genomas a partir do DNA sintetizado1. A clonagem molecular tradicional geralmente depende de estratégias de clonagem ad hoc e pode ser trabalhosa e cara para grandes construções multigênicas2. Nos últimos anos, a clonagem Golden Gate (GG) e os kits de ferramentas de clonagem modular hierárquica derivada (MoClo) 2,3 tornaram-se soluções populares para permitir a montagem de DNA com eficiência de tempo e custo.

As enzimas de restrição do tipo IIS são endonucleases que reconhecem uma sequência direcional (não palindrômica) e clivam fora dessa sequência de reconhecimento4. Como resultado, as sequências de saliência criadas pela clivagem não dependem do local de reconhecimento, mas podem ser escolhidas4. Além disso, fragmentos de DNA funcionais, aqui chamados de 'partes', podem ser projetados de forma que a clivagem remova o local de reconhecimento das extremidades das partes a serem unidas2. As estratégias de clonagem GG aproveitam isso para permitir montagens eficientes de DNA de várias partes em reações de um pote5. Os kits de ferramentas MoClo são baseados na clonagem GG e visam fornecer uma maneira modular e hierárquica para a montagem de construções multigênicas. As saliências utilizadas para montar peças são padronizadas, permitindo a criação de bibliotecas de peças reutilizáveis e intercambiáveis. Os kits de ferramentas MoClo dependem de plasmídeos aceptores, que são projetados para aceitar várias sequências de DNA e liberar o produto montado. Cada plasmídeo aceitador contém dois locais de reconhecimento de duas enzimas diferentes do Tipo IIS, sendo uma usada para aceitar carga de DNA e a outra paraliberar DNA 3,6 montado. Uma ilustração desse princípio é mostrada na Figura 1 para a clonagem de uma parte individual, um terminador, em um plasmídeo aceitador MoClo (Nível 0). Tanto o plasmídeo aceitador quanto a inserção são cortados pela enzima de restrição BbsI, de forma a deixar saliências compatíveis e remover os locais de reconhecimento de BbsI. Os plasmídeos corretamente ligados, portanto, não são mais cortados por BbsI. O corte do plasmídeo resultante com a enzima tipo IIS SapI libera o fragmento inserido anteriormente na próxima etapa de montagem (Nível 1).

Neste protocolo, a caixa de ferramentas In- e Out-Cloning MoClo é usada7. Aqui, os plasmídeos de Nível 0 contêm partes genéticas fundamentais definidas, como promotores com regiões 5 'não traduzidas (UTRs), sequências de codificação e terminadores com 3'UTRs, a Figura 1 mostra uma visão geral esquemática do Nível 0. No Nível 1, várias partes estão sendo montadas em uma unidade de transcrição (TU), a Figura 2 mostra uma visão geral esquemática das peças de Nível 1 e clonagem. Clonagem interna e externa O MoClo foi projetado para montagem sem cicatrizes de unidades de transcrição no Nível 1 usando uma enzima Tipo IIS que cria saliências de 3 nucleotídeos. Isso permite que as saliências estejam totalmente dentro do raster de códon da sequência de codificação, usando os códons de parada ATG start e TGA para montagem. Os níveis M e P são usados para a montagem de múltiplas unidades de transcrição liberadas de plasmídeos de nível 1 3,8. A Figura 3 mostra uma visão geral esquemática das partes para clonagem nos níveis M e P e a montagem de um operon bicistrônico no nível M (um operon bicistrônico é uma unidade transcricional que expressa múltiplas sequências de codificação (CDSs)). Os níveis P e M foram projetados para permitir o ciclo iterativo de um para o outro, de modo que não haja limite teórico para o número de peças que podem ser montadas, mas isso não é descrito neste protocolo, pois o foco principal deste protocolo é mostrar a montagem de um operon bicistrônico. Embora não haja limite para o número de peças que podem ser montadas, há um limite para o tamanho de uma construção que pode ser montada; até 100.000 bp foram montados usando um kit MoClo9. Além disso, grandes construções ou construções que contêm genes tóxicos podem causar uma carga na célula; Para esses casos, protocolos modificados foram publicados10.

A clonagem interna e externa inicialmente não descreveu um esquema para a montagem de unidades de transcrição policistrônicas. Os operons policistrônicos são um modo de organização gênica muito comum em bactérias 11,12,13 e, portanto, há um interesse notável em sua montagem de baixo para cima de forma modular 14. Aqui, um esquema estruturado para a montagem de operons policistrônicos usando clonagem interna e externa é descrito. O esquema apresentado permite a troca fácil da posição das sequências de codificação dentro de unidades de transcrição policistrônicas, bem como montagens que consistem em transcrição mono e policistrônica.

O protocolo passo a passo a seguir mostra o design e a clonagem de um operon policistrônico usando clonagem interna e externa. A estratégia apresentada para clonagem de unidades de transcrição policistrônica pode ser facilmente adaptada a outros kits de ferramentas MoClo.

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Protocol

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NOTA: Este protocolo descreve o projeto e a montagem de um operon policistrônico por meio de três níveis do padrão In-Cloning (0, 1 e M). O operon policistrônico montado aqui começa com um promotor, seguido por um sítio de ligação ribossômica (RBS), uma sequência de codificação (CDS), um segundo RBS, um segundo CDS e, finalmente, um terminador (Figura S1). É altamente recomendável usar software de clonagem molecular para simular a clonagem in silico, para garantir que a estratégia de clonagem projetada esteja correta. Um exemplo de montagem de um promotor como uma peça de Nível 0, montagem de um RBS com uma sequência de codificação e um terminador em uma Unidade de Transcrição de Nível 1 e a montagem de um operon bicistrônico no Nível M é descrito aqui, e uma visão geral esquemática de toda a montagem é mostrada na Figura S1.

1. Nível 0: Domesticação de peças

NOTA: O termo "domesticação" é usado para indicar que uma peça molecular foi integrada a uma biblioteca de peças MoClo e pode ser montada em todos os níveis do kit MoClo. Normalmente, todos os locais de reconhecimento de enzimas de restrição Tipo IIS usados no kit são removidos da parte a ser domesticada, por exemplo, por recodificação sinônima.

  1. Design da pastilha
    1. Escolha as partes moleculares, como promotor, CDS e terminador, a serem montadas juntas no operon.
      NOTA: Neste protocolo, o operon inicia com o promotor PLuxB, que pode ser ativado pela proteína LuxR na presença do composto indutor N-(β-Ketocaproyl)-L-homoserina lactona (OC6)17. GFP é o primeiro CDS do operon; seu RBS é iGEM BBa_B0064. O GFP é seguido por um ligante não terminal, a 'ponte terminadora'. O segundo CDS é mTurquoise. Seu RBS foi projetado por uma calculadora RBS18. Finalmente, o operon termina com o terminador L3S2P2119.
    2. Escolha a posição em que a peça deve ser montada, uma visão geral é mostrada na Figura 1. Com base na posição, escolha o plasmídeo aceitador a ser usado no GG.
      NOTA: As peças podem ser domesticadas para uso posterior em várias posições. Por exemplo, um promotor pode ser montado como uma única peça posteriormente conectando-se com uma peça 5'UTR (pSL252), ou pode ser domesticado com um 5'UTR já contido (pSL099). Um CDS pode ser montado em quatro plasmídeos aceitadores, para ser montado sem uma etiqueta (pSL102), para ser montado com uma etiqueta N-terminal (pSL104), para ser montado com uma etiqueta C-terminal (pSL101) ou para ser montado com uma etiqueta N-terminal e uma etiqueta C-terminal (pSL103). No exemplo dado, o promotor é domesticado em pSL252, o primeiro RBS é domesticado em pSL253, o primeiro CDS é domesticado em pSL102, a ponte terminadora é domesticada em pSL106, o segundo RBS é domesticado em pSL099, o segundo CDS é domesticado em pSL102 e o terminador é domesticado em pSL106.
    3. Adicione extensões à inserção projetada com base no plasmídeo aceitador escolhido. A Tabela 1 fornece uma visão geral da extensão necessária para a montagem GG por plasmídeo aceitador. Essas extensões devem ser adicionadas durante o projeto dos primers para PCR, o projeto dos oligos no caso de recozimento de dois oligos para construir uma peça ou durante a síntese gênica.
      NOTA: Para que uma peça seja domesticada, é necessário garantir que a própria peça não contenha locais de reconhecimento das enzimas Tipo IIS usadas no kit, SapI (5'-GCTCTTC-3'), BbsI (5'-GAAGAC-3') e BsaI (5'-GGTCTC-3'). A presença de locais de reconhecimento nas peças reduz drasticamente a eficiência da montagem correta porque o produto final pode ser cortado pela enzima Tipo IIS usada (ver Figura 1).
  2. Reação GG
    1. Para a reação GG, adicione 50 fmol do inserto desejado, 50 fmol do plasmídeo aceitador, 1 μL de tampão 10x T4 DNA ligase, 1 μL de T4 ligase e 1 μL de BbsI. Adicione água livre de nuclease a um volume total de 10 μL. Além disso, inclua um controle negativo com a mesma reação sem a inserção desejada.
    2. Execute o seguinte programa em um termociclador: 25 ciclos de 37 °C por 3 min (37 °C é a temperatura ideal da enzima de restrição) e 16 °C por 4 min (16 °C é a temperatura ideal de T4 ligase), seguidos por uma digestão final a 50 °C por 20 min (a 50 °C, T4 ligase mostra muito pouca ou nenhuma atividade, enquanto a enzima de restrição ainda é capaz de funcionar, limitando assim a quantidade de plasmídeo aceptor não cortado no produto final) e uma inativação térmica das enzimas a 80 ° C por 20 min (a 80 ° C, todas as enzimas são inativadas pelo calor e a reação é encerrada) 6.
    3. Transformar a reação GG adicionando 5 μL da reação GG em 50 μL de células de E. coli quimicamente competentes e realizar uma transformação de choque térmico com uma etapa de recuperação, conforme descrito em um protocolo publicado anteriormente15.
    4. Espalhe 100 μL do crescimento da transformação em uma placa de ágar Luria-Bertani (LB) com 100 μg / mL de espectinomicina. Incubar a placa durante a noite a 37 °C.
    5. Comparar a eficiência de transformação do controlo negativo com a do conjunto completo, contando o número de colónias brancas em ambas as placas. Prossiga para a próxima etapa se o conjunto tiver cerca de 10 vezes (ou mais) colônias brancas do que o controle negativo.
      NOTA: A maioria das colônias resultantes deve ser branca, com apenas uma pequena fração das colônias vermelhas. Os plasmídeos aceptores no kit de ferramentas In-Cloning têm um de seleção dupla, contendo mCherry (Nível 0 e Nível 1) ou LacZα (Nível M e Nível P), e um gene ccdB, que codifica um inibidor de girase. A transformação da reação GG é realizada em células de E. coli sensíveis ao ccdB, portanto, apenas as células que possuem o plasmídeo montado podem crescer, enquanto o plasmídeo aceitador original não pode ser propagado. Exemplos de cepas sensíveis ao ccdB incluem DH5α e TOP10. O mCherry / LacZα permite a identificação visual de células que escapam do mecanismo ccdB 16.
    6. Para cada montagem, cultive duas colônias brancas pegando algum material da colônia com uma ponta de pipeta e ressuspendendo-o em 5 mL de meio LB com 100 μg / mL de espectinomicina cada e incube durante a noite a 37 ° C em uma incubadora agitada a 250 rpm. Execute uma extração de plasmídeo baseada em coluna de acordo com as instruções do fabricante. Verifique se o plasmídeo extraído tem a sequência esperada por sequenciamento de Sanger.

2. Nível 1: Determinação das posições

NOTA: O nível 1 é o nível entre a domesticação de peças e a montagem de um operon policistrônico (Figura 2). Aqui, as posições dos conjuntos intermediários na construção final são determinadas. A posição de um conjunto de Nível 1 dentro do operon pode ser alterada usando um plasmídeo aceitador de Nível 1 diferente. O exemplo dado descreve a montagem de uma unidade bicistronic, mas o esquema fornecido pode ser facilmente adaptado para a montagem de até seis sequências de codificação (com um RBS cada). A montagem de mais sequências de codificação também requer o ciclo entre os níveis P e M. Com o ciclo iterativo entre os níveis P e M, não há limite superior fixo para o número de sequências de codificação que podem ser montadas em um único operon.

  1. Escolha de peças e plasmídeos aceptores
    1. Escolha as peças de nível 0 a serem montadas em uma unidade de transcrição. No mínimo, eles precisam incluir um promotor, um CDS e um exterminador.
    2. Escolha a posição em que a unidade de transcrição deve ser montada no operon. Com base nessa posição, escolha o plasmídeo aceitador apropriado. Uma visão geral é mostrada na Figura 2.
      NOTA: Os 7 fragmentos de DNA para a construção do operon bicistrônico mostrado como exemplo são montados em duas construções de Nível 1. O promotor, o primeiro RBS, o primeiro CDS e a ponte terminadora são montados em pSL68; o segundo RBS, o segundo CDS e o terminador são montados em pSL69.
  2. Reação GG
    1. Para a reação GG, adicione 50 fmol de cada uma das inserções desejadas, 50 fmol do plasmídeo aceitador, 1 μL de tampão 10x T4 DNA ligase, 1 μL de T4 ligase e 1 μL de SapI. Adicione água livre de nuclease a um volume total de 10 μL.
    2. Execute o seguinte programa em um termociclador: 25 ciclos de 37 ° C por 3 min e 16 ° C por 4 min, seguidos por uma digestão final a 50 ° C por 20 min e inativação térmica das enzimas a 80 ° C por 20 min6.
    3. Opcional: Adicione 0,5 μL de SapI à reação GG e incube a 37 °C por 1 h.
      NOTA: SapI não é tão estável quanto as outras enzimas de restrição do tipo IIS usadas. Verificou-se que uma etapa de digestão com SapI após a reação GG reduz a quantidade de colônias que carregam o plasmídeo aceptor religado. O SapI tem um isosquizômero, BspQI, que pode não precisar dessa etapa final de digestão.
    4. Transformar 5 μl da reação GG em 50 μl de células de E. coli quimicamente competentes e realizar uma transformação por choque térmico, de preferência com uma etapa de recuperação, como a realizada na etapa 1.2.3.
    5. Placa 100 μL do crescimento da transformação em uma placa de ágar LB com 100 μg / mL de ampicilina. Incubar a placa durante a noite a 37 °C.
    6. Para cada um, cultive duas colônias brancas pegando algum material da colônia com uma ponta de pipeta e ressuspendendo-o em 5 mL de meio LB com 100 μg / mL de ampicilina cada. Incubar durante a noite a 37 °C numa incubadora agitada a 250 rpm. Execute uma extração de plasmídeo baseada em coluna de acordo com as instruções do fabricante.
    7. Confirme a montagem correta por meio de um resumo de restrição com BbsI, verificando se o tamanho do recorte corresponde ao tamanho esperado da pastilha. Digerir 1000 ng de DNA plasmidial adicionando 1 μL do tampão de digestão 10x apropriado e 1 μL de BbsI. Adicionar água isenta de nuclease a um volume total de 10 μl. Incubar a reacção a 37 °C durante 15 min.
    8. Realize a eletroforese em gel carregando o plasmídeo digerido em um gel de agarose a 1%, execute o gel a 100 V por 35 min.
      NOTA: Uma digestão in silico do plasmídeo esperado pode ser realizada para simular um gel de agarose para prever o resultado.

3. Nível M: Montagem de um operon policistrônico

NOTA: Nesta etapa, o operon policistrônico está sendo montado. No caso apresentado de um operon bicistrônico, duas pastilhas de Nível 1 são montadas nas posições 1 e 2. Assim, o plasmídeo aceptor pMA60 é escolhido. Além disso, é necessário um vinculador final. Todos os plasmídeos aceitadores de nível M e P têm a saliência GGGA como a segunda saliência. Os ligantes finais fazem a ponte entre o inserto e o plasmídeo aceitador e permitem a montagem de uma construção de Nível P no Nível M e vice-versa. Para uma montagem de Nível P de duas pastilhas de Nível 1, o ligante final pMA668 é usado e assumirá a terceira e última posição. Uma visão geral dos níveis M e P e uma visualização da etapa de clonagem são mostradas na Figura 3. Com montagem apenas no Nível M (ou P), operons de até 6 sequências de codificação podem ser clonados (posições 1-6). A posição 7 está sendo ocupada pelo vinculador final. A montagem de um número maior de sequências de codificação em um operon é possível, mas requer o ciclo para o Nível M (ou P), que não é descrito neste protocolo.

  1. Para a reação GG, adicione 50 fmol de cada inserção desejada, 50 fmol do plasmídeo aceptor, 1 μL de tampão 10x T4 DNA ligase, 1 μL de T4 ligase e 1 μL de BbsI. Adicione água livre de nuclease a um volume total de 10 μL.
  2. Execute o seguinte programa em um termociclador: 50 ciclos de 37 ° C por 3 min e 16 ° C por 4 min, seguidos por uma digestão final a 50 ° C por 20 min e inativação térmica das enzimas a 80 ° C por 20 min6.
  3. Transformar 5 μL da reação GG em 50 μL de células de E. coli quimicamente competentes e realizar uma transformação por choque térmico com uma etapa de recuperação, conforme realizado na etapa 1.2.3.
  4. Espalhe 100 μL do crescimento da transformação em uma placa de ágar LB com 100 μg / mL de espectinomicina. Incubar a placa durante a noite a 37 °C, ou a 30 °C se estiver a esperar uma carga metabólica ou toxicidade do conjunto.
  5. Para cada assembleia, faça uma cultura de duas colônias brancas. Para este fim, mergulhe uma ponta de pipeta na colônia e use-a para inocular 5 mL de LB com 100 μg / mL de espectinomicina. Incubar durante a noite a 37 °C ou 30 °C numa incubadora agitada a 250 rpm. Execute uma extração de plasmídeo baseada em coluna de acordo com as instruções do fabricante.
  6. Confirme a montagem correta por meio de um resumo de restrição com BsaI, verificando se o tamanho do recorte corresponde ao tamanho esperado da pastilha, conforme realizado na etapa 2.2.7.
    NOTA: A construção pode ser muito longa para ser coberta pelo sequenciamento de Sanger para confirmação. Em seguida, pode ser confirmado pelo sequenciamento de plasmídeo completo, que está disponível como um serviço comercial de vários provedores de serviços de sequenciamento.

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Results

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Aqui, são mostrados os resultados de uma montagem de baixo para cima de um operon policistrônico do Nível 0 ao Nível M (Figura S1). O operon inicia-se com o promotor PLuxB, que pode ser ativado pela proteína LuxR na presença do composto indutor N-(β-Ketocaproyl)-L-homoserina lactona (OC6)17. GFP é o primeiro CDS do operon, seu RBS é iGEM BBa_B0064. O GFP é seguido por um ligante não terminal, a 'ponte terminadora'. O segundo RBS é proje...

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Discussion

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A clonagem molecular pode ser demorada e complicada, especialmente com estratégias de clonagem ad hoc. Os kits de ferramentas MoClo podem melhorar a clonagem molecular por sua modularidade, montagem hierárquica e reações de um pote altamente eficientes. Eles dependem da montagem do DNA por meio de reações Golden Gate. Graças às saliências padronizadas, as bibliotecas de peças moleculares podem ser reutilizadas e compartilhadas com outras 3,6

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Disclosures

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Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TAL, STdV e DS foram apoiados pela Sociedade Max Planck no âmbito do projeto MaxGENESYS.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AmpicilinaMerck Life ScienceA9518
Ágar bacterianoFisher Scientific & nbsp;P0011B
BbsI-HFBiolaboratórios da Nova InglaterraR3539
BsaI-HF V2Biolaboratórios da Nova InglaterraR3733
E. coli DH5α Células competentes
Eppendorf  Mastercycler  Cicladores Térmicos NexusEppendorf6333000014
Espectrofotômetro de Microvolume EzDrop 1000Blue-Ray BiotechBRED-1000
Kit de Minipreparação para Plasmídeos GeneJETTermo CientíficaK0503
In- & Fora - Kit de Ferramentas de Clonagem
Buffer da ligaseBiolaboratórios da Nova InglaterraB0216
NaClFisher Scientific & nbsp;BP358
New Brunswick Innova®   42/42R - Shaker Incubadora EmpilhávelEppendorfM1335-0080
PhenoBooth+Instrumentos SingerPHB-007
SaViBiolaboratórios da Nova InglaterraR0569
EspectinomicinaMerck Life ScienceS4014
Utensílios de laboratório padrão
Ligase de DNA T4Biolaboratórios da Nova InglaterraM0202
Thermomix MMB. Braun Biotech International
TriptonaFisher Scientific & nbsp;LP0042B
Extrato de leveduraFisher Scientific & nbsp;LP0021B

References

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