Neste estudo, descrevemos um protocolo passo a passo e enfatizamos os principais detalhes para determinar as características morfológicas das mitocôndrias em células vivas, incluindo preparação de amostras, aquisição de imagens e análise de dados. Este método é comumente usado para examinar a morfologia mitocondrial para estudar várias condições.
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Artigo de método
Determinação da morfologia mitocondrial em células vivas usando microscopia confocal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O equilíbrio dinâmico da fusão e fissão mitocondrial contribui diretamente para a homeostase mitocondrial, que influencia inúmeras funções celulares, além da homeostase do trifosfato de adenosina (ATP). Portanto, avaliar a morfologia mitocondrial sob condições de estresse é essencial para a pesquisa mecanicista. Este estudo descreve um protocolo detalhado para análise da morfologia mitocondrial, abrangendo a preparação de uma solução MitoTracker, coloração de mitocôndrias, otimização de parâmetros de imagem e detecção de características morfológicas. Os MitoTrackers são corantes específicos para mitocôndrias comumente usados e econômicos. No entanto, algumas mudanças na morfologia mitocondrial podem ocorrer devido ao manuseio inadequado, que pode ser imperceptível e não refletir o verdadeiro estado das mitocôndrias. Portanto, é necessário entender como analisar as mudanças na morfologia mitocondrial usando MitoTrackers. O protocolo utilizou células SH-SY5Y estimuladas com iodeto de 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+) para ilustrar o protocolo de análise morfológica mitocondrial. Em comparação com as células de controle, as células estimuladas por MPP+ exibiram mitocôndrias menores e mais fragmentadas, com parâmetros morfológicos indicando diminuição da pegada mitocondrial. Esses resultados sugerem que a coloração MitoTracker é um método eficaz e viável para análise morfológica mitocondrial que (com pequenas modificações) pode ser aplicado para estudar várias condições.
Introdução
A morfologia mitocondrial é mantida pelo equilíbrio dinâmico da fusão e fissão mitocondrial e, portanto, afeta a homeostase energética e inúmeras outras funções celulares, levando a várias patologias, como doenças neurodegenerativas, câncer e inflamação 1,2,3,4,5 . Para observar a morfologia mitocondrial, várias colorações seletivas de mitocôndrias, incluindo sondas e anticorpos, foram desenvolvidas para uso com um microscópio confocal. Algumas sondas específicas da mitocôn....
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Protocolo
1. Preparação
- Dissolva o MPP+ com dimetilsulfóxido (DMSO) para fazer uma solução de estoque de 1 mM e armazene-a a -30 °C no escuro (consulte a Tabela de Materiais).
- Dissolva 50 μg de MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) em 94 μL de DMSO para fazer uma solução estoque de 1 mM. Aliquotar a solução de reserva em vários tubos de microcentrífuga e conservá-la protegida da luz a -30 °C até nova utilização.
- Incube as células SH-SY5Y em frascos com o meio Eagle Modificado / Mistura de Nutrientes F-12 de Dulbecco suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS....
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Resultados
Este protocolo descreve um procedimento detalhado e passo a passo para análise morfológica mitocondrial por meio de três módulos de otimização interdependentes: padronização de protocolos de preparação de amostras, otimização sistemática de parâmetros ópticos para imagens de microscopia confocal e diretrizes de processamento de imagem computacional. O protocolo ideal de preparação de amostras é fundamental para obter dados confiáveis de imagem mitocondrial. A avaliação sistemática das concentrações do MitoTracker Red CMX.......
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Discussão
O presente estudo estabelece uma metodologia sistemática para análise da morfologia mitocondrial em células vivas sob condições de estresse. As etapas cruciais do procedimento na imagem mitocondrial envolvem: uma concentração apropriada de sondas MitoTracker, lavagem completa das placas confocais antes da aquisição da imagem, minimização de distúrbios no estado celular e definição de parâmetros de imagem adequados.
O uso de concentrações mais altas de MitoTrac.......
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Divulgações
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81974501).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Iodeto de 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+) | Macklin | M875357 | Usado para induzir estresse oxidativo |
| Prato confocal | NINHO | 801001 | Usado para cultivar as células |
| Microscópio confocal | Nikon | C2 | Usado para capturar imagens |
| Meio Eagle Modificado de Dulbecco/Mistura de Nutrientes F-12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | Usado para fornecer nutrição às células |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Beyotime | ST038 | Usado para dissolver a sonda mitotracker |
| Soro fetal bovino (FBS) | ThermoFisher Scientific | A3161001C | Usado para fornecer nutrição às células |
| ImagemJ | Institutos Nacionais de Saúde | ImagemJ | Usado para analisar a morfologia mitocondrial |
| MitoTracker Vermelho CMXRos | ThermoFisher Scientific | M7512 | Usado para visualizar mitocôndrias |
| Tampão fosfato salino (PBS) | ThermoFisher Scientific | C10010500BT | Usado para lavar as células em pratos confocais |
| Célula SH-SY5Y | ATCC | CRL-2266 | Usado para demonstrar o fluxo de trabalho da análise da morfologia mitocondrial |
| Adaptador de palco TI-SH-U | Nikon | MEC59110 | Usado para proteger espécimes |
Referências
- von der Malsburg, A., et al. Structural mechanism of mitochondrial membrane remodelling by human OPA1. Nature. 620 (7976), 1101-1108 (2023).
- Giacomello, M., Pyakurel, A., Glytsou, C., Scorrano, L. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics. Nat Rev Mol Cell Biol
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Reimpressões e permissões
