Artigo de método

Determinação da morfologia mitocondrial em células vivas usando microscopia confocal

DOI:

10.3791/68167

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3 de julho de 2025

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1NMPA Key Laboratory for Research and Evaluation of Drug Metabolism & Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Screening, School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, 2Central Laboratory, Southern Medical University

Neste artigo

Resumo

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Neste estudo, descrevemos um protocolo passo a passo e enfatizamos os principais detalhes para determinar as características morfológicas das mitocôndrias em células vivas, incluindo preparação de amostras, aquisição de imagens e análise de dados. Este método é comumente usado para examinar a morfologia mitocondrial para estudar várias condições.

Resumo

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O equilíbrio dinâmico da fusão e fissão mitocondrial contribui diretamente para a homeostase mitocondrial, que influencia inúmeras funções celulares, além da homeostase do trifosfato de adenosina (ATP). Portanto, avaliar a morfologia mitocondrial sob condições de estresse é essencial para a pesquisa mecanicista. Este estudo descreve um protocolo detalhado para análise da morfologia mitocondrial, abrangendo a preparação de uma solução MitoTracker, coloração de mitocôndrias, otimização de parâmetros de imagem e detecção de características morfológicas. Os MitoTrackers são corantes específicos para mitocôndrias comumente usados e econômicos. No entanto, algumas mudanças na morfologia mitocondrial podem ocorrer devido ao manuseio inadequado, que pode ser imperceptível e não refletir o verdadeiro estado das mitocôndrias. Portanto, é necessário entender como analisar as mudanças na morfologia mitocondrial usando MitoTrackers. O protocolo utilizou células SH-SY5Y estimuladas com iodeto de 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+) para ilustrar o protocolo de análise morfológica mitocondrial. Em comparação com as células de controle, as células estimuladas por MPP+ exibiram mitocôndrias menores e mais fragmentadas, com parâmetros morfológicos indicando diminuição da pegada mitocondrial. Esses resultados sugerem que a coloração MitoTracker é um método eficaz e viável para análise morfológica mitocondrial que (com pequenas modificações) pode ser aplicado para estudar várias condições.

Introdução

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A morfologia mitocondrial é mantida pelo equilíbrio dinâmico da fusão e fissão mitocondrial e, portanto, afeta a homeostase energética e inúmeras outras funções celulares, levando a várias patologias, como doenças neurodegenerativas, câncer e inflamação 1,2,3,4,5 . Para observar a morfologia mitocondrial, várias colorações seletivas de mitocôndrias, incluindo sondas e anticorpos, foram desenvolvidas para uso com um microscópio confocal. Algumas sondas específicas da mitocôndria, como tetrametilrosamina e rodamina 123, funcionam com base no potencial de membrana mitocondrial (MMP), o que limita sua aplicabilidade em estudos de condições disruptivas de MMP 6,7. Por outro lado, a coloração de anticorpos fornece avaliação morfológica independente de MMP para examinar a morfologia mitocondrial em células fixas. Embora uma coloração adequada permita a avaliação da morfologia mitocondrial em células fixas, o exame da morfologia mitocondrial em células vivas prejudicadas por alguns indutores continua sendo um desafio. O MitoTracker, uma sonda fluorescente catiônica permeável a células e específica para mitocôndrias, oferece uma solução para esse desafio, permitindo a coloração de células vivas e fixas. Essa sonda tem sido amplamente utilizada para examinar a morfologia mitocondrial em estudos de várias doenças 8,9,10,11. No entanto, alguns estudos relataram problemas como alto sinal de fundo e ligação não específica, mesmo quando a sonda é utilizada em estrita conformidade com as diretrizes fornecidas pelo fabricante. Essas observações destacam a importância de uma compreensão completa da preparação da amostra e aquisição de imagens para a análise bem-sucedida da morfologia mitocondrial.

Para facilitar a análise da morfologia mitocondrial, vários programas e algoritmos de processamento de imagem foram desenvolvidos 12,13,14,15,16. Neste estudo, empregamos a ferramenta macro Análise de Rede Mitocondrial (MiNA) no ImageJ para analisar a morfologia mitocondrial13. Esta ferramenta identifica e caracteriza efetivamente as características morfológicas das redes mitocondriais calculando nove parâmetros descritivos, incluindo o número de indivíduos (estruturas sem ramos), número de redes (número de objetos com pelo menos um pixel de junção), comprimento médio (comprimento médio de todos os bastonetes e ramos), comprimento médio (comprimento médio de todos os bastonetes e ramos), desvio padrão do comprimento (desvio padrão dos comprimentos individuais), tamanho médio da rede (o número médio de ramificações por rede), tamanho médio da rede (o valor médio do número de ramificações por rede), desvio padrão do tamanho da rede (desvio padrão do número de ramificações por rede) e pegada mitocondrial (área total do sinal após a separação do fundo). Neste protocolo, a pegada mitocondrial foi selecionada como parâmetro representativo.

O objetivo deste estudo é fornecer um protocolo passo a passo para análise morfológica mitocondrial, com foco em detalhes importantes. Usamos células SH-SY5Y induzidas por MPP+ para demonstrar este protocolo. O MPP+ inibe o complexo I da cadeia respiratória mitocondrial em neurônios dopaminérgicos, resultando em danos à morfologia e função mitocondrial 8,17. O protocolo de análise morfológica descrito neste estudo permite a aquisição de imagens de alta resolução e a avaliação de parâmetros relevantes para definir características morfológicas de redes mitocondriais.

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Protocolo

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1. Preparação

  1. Dissolva o MPP+ com dimetilsulfóxido (DMSO) para fazer uma solução de estoque de 1 mM e armazene-a a -30 °C no escuro (consulte a Tabela de Materiais).
  2. Dissolva 50 μg de MitoTracker (MitoTracker Red CMXRos) em 94 μL de DMSO para fazer uma solução estoque de 1 mM. Aliquotar a solução de reserva em vários tubos de microcentrífuga e conservá-la protegida da luz a -30 °C até nova utilização.
  3. Incube as células SH-SY5Y em frascos com o meio Eagle Modificado / Mistura de Nutrientes F-12 de Dulbecco suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS) em um ambiente umidificado com 5% de CO2 e 95% de ar a 37 ° C. Para a passagem, retire as células com solução de tripsina a 0,05% por 1 min e centrifugue a 100 × g por 3 min.

2. MPP+ estimulação

  1. Semeie células SH-SY5Y em placas confocais com fundo de vidro e mantenha-as em meio DMEM/F12 suplementado com 1% (v/v) de FBS durante a noite.
  2. Substitua o meio de cultura e incube as células com ou sem MPP+ por 24 h.

3. Coloração MitoTracker

  1. Pré-aqueça o DMEM/F12 e, em seguida, dilua a solução estoque do MitoTracker com DMEM/F12 para obter uma solução de trabalho de 50 nM. Mantenha a solução protegida da luz durante todo o procedimento.
  2. Remova o meio de cultura de células e lave os pratos confocais 2x com DMEM/F12 fresco.
  3. Incube as células em cada placa com 1 mL da solução de trabalho MitoTracker por 15 min a 37 ° C no escuro.
  4. Remova a solução de trabalho MitoTracker e lave 2x com DMEM/F12.
  5. Adicione 1 mL de DMEM/F12 a cada placa e incube na incubadora de células antes de fazer a imagem.

4. Parâmetros de imagem para microscópio confocal

  1. Pré-equilibre o microscópio para operações subsequentes. No painel de aquisição, ajuste os parâmetros relacionados ao caminho da luz definindo os comprimentos de onda de excitação e emissão.
  2. Defina os parâmetros da seguinte forma: tamanho do orifício, 1,2 UA; tamanho da varredura de pixels, 1.024 x 1.024; tempo de permanência de pixels, 2,4 μs (média de 2x)  (mantenha-o consistente para fins de calibração).

5. Otimizando os parâmetros de imagem

CUIDADO: Evite a exposição dos olhos à radiação direta e espalhada de um laser visível e/ou invisível.

  1. Use a luz halógena para focar nas células usando uma lente objetiva apocromática plana de 60x (1,4 NA) para evitar fototoxicidade.
  2. Ajuste a potência do laser e a alta tensão (HV) para um pouco abaixo do nível de saturação, defina o fator de zoom para 3 e capture as imagens.
  3. Mova a região de interesse e concentre-se nas células para capturar imagens sem alterar nenhuma configuração.

6. Análise dos dados

NOTA: Os dados foram analisados usando o ImageJ pré-instalado com o plug-in MiNA13. Para obter medições relevantes e precisas, as imagens devem capturar mitocôndrias resolvidas independentemente com coloração limpa e brilhante.

  1. Para melhorar a qualidade da imagem antes da transformação binária e da esqueletização, abra a imagem e realize o processamento preliminar. Use a ferramenta ROI para selecionar a área de uma única célula. Aplique o processo | Filtros | Função Unsharp Mask para aumentar a nitidez e usar o botão Processo | Recurso Enhance Contrast para reduzir a amplificação excessiva de ruído. Para remover especificamente o ruído de sal e pimenta, use o botão Processo | Filtros | Função mediana (ver Figura Suplementar S1).
  2. Para construir um modelo morfológico simplificado para calcular parâmetros descritivos, converta a imagem em binária por meio de limite (clique em Processo | Binário | Tornar binário) e, em seguida, esqueletizar a imagem binária usando a função Esqueletizar (clique em Processo | Binário | Esqueletizar) (ver Figura Suplementar S2).
  3. Agrupe todos os pixels dentro do esqueleto usando o botão Analisar | Esqueleto | Função Analisar esqueleto (2D/3D). Simplifique a análise usando a ferramenta MiNA para calcular nove parâmetros descritivos na imagem esqueletizada (consulte a Figura S3 suplementar).

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Resultados

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Este protocolo descreve um procedimento detalhado e passo a passo para análise morfológica mitocondrial por meio de três módulos de otimização interdependentes: padronização de protocolos de preparação de amostras, otimização sistemática de parâmetros ópticos para imagens de microscopia confocal e diretrizes de processamento de imagem computacional. O protocolo ideal de preparação de amostras é fundamental para obter dados confiáveis de imagem mitocondrial. A avaliação sistemática das concentrações do MitoTracker Red CMX...

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Discussão

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O presente estudo estabelece uma metodologia sistemática para análise da morfologia mitocondrial em células vivas sob condições de estresse. As etapas cruciais do procedimento na imagem mitocondrial envolvem: uma concentração apropriada de sondas MitoTracker, lavagem completa das placas confocais antes da aquisição da imagem, minimização de distúrbios no estado celular e definição de parâmetros de imagem adequados.

O uso de concentrações mais altas de MitoTrac...

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Divulgações

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Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81974501).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Iodeto de 1-metil-4-fenilpiridínio (MPP+)MacklinM875357Usado para induzir estresse oxidativo
Prato confocalNINHO801001Usado para cultivar as células
Microscópio confocalNikonC2Usado para capturar imagens
Meio Eagle Modificado de Dulbecco/Mistura de Nutrientes F-12ThermoFisher Scientific11320033Usado para fornecer nutrição às células
Dimetilsulfóxido (DMSO)BeyotimeST038Usado para dissolver a sonda mitotracker
Soro fetal bovino (FBS)ThermoFisher ScientificA3161001CUsado para fornecer nutrição às células
ImagemJInstitutos Nacionais de SaúdeImagemJUsado para analisar a morfologia mitocondrial
MitoTracker Vermelho CMXRosThermoFisher ScientificM7512Usado para visualizar mitocôndrias
Tampão fosfato salino (PBS)ThermoFisher ScientificC10010500BTUsado para lavar as células em pratos confocais
Célula SH-SY5YATCCCRL-2266Usado para demonstrar o fluxo de trabalho da análise da morfologia mitocondrial
Adaptador de palco TI-SH-UNikonMEC59110Usado para proteger espécimes

Referências

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