Artigo de método

Preparação mitocondrial de microglia para análise de glicanos

DOI:

10.3791/68179

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30 de maio de 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Health Professions, University of Alabama at Birmingham, 2Department of Chemistry, North Carolina State University, 3Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, University of Alabama at Birmingham, 4Department of Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo foi desenvolvido para a preparação de mitocôndrias purificadas a partir de células microgliais, isolamento de proteínas mitocondriais para liberação de N-glicanos e detecção rápida de glicanos mitocondriais subcelulares usando ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha acoplada a espectrometria de massa de analisador de massa precisa de alta resolução.

Resumo

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Compreender os padrões de glicosilação das proteínas mitocondriais na microglia é fundamental para determinar seu papel em doenças neurodegenerativas. Aqui, apresentamos uma metodologia nova e de alto rendimento para análise glicômica de proteínas mitocondriais isoladas de microglia cultivada. Este método envolve o isolamento de mitocôndrias de culturas microgliais, avaliação da qualidade de amostras mitocondriais, seguida por uma extração de proteína otimizada para maximizar a detecção de glicanos e espectrometria de massa precisa de alta resolução (HRAM) de ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha (IR-MALDESI) para fornecer perfis detalhados de glicosilação mitocondrial.

Este protocolo enfatiza a importância de manter a integridade mitocondrial durante o isolamento e emprega um rigoroso controle de qualidade para garantir a reprodutibilidade, incluindo a medição da pureza mitocondrial após a extração. Essa abordagem permite o perfil abrangente das alterações de glicosilação nas mitocôndrias microgliais sob várias condições experimentais in vitro, o que oferece informações sobre as alterações mitocondriais associadas a doenças neurodegenerativas. Essa abordagem pode ser adaptada a outros tratamentos in vitro , outros tipos de células cultivadas ou células primárias. Por meio dessa abordagem padronizada, pretendemos avançar na compreensão dos glicanos mitocondriais microgliais, contribuindo para o campo mais amplo da pesquisa neurodegenerativa.

Introdução

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A microglia é a célula imune inata residente dominante no cérebro e representa 10-15% das células do cérebro adulto 1,2. Eles usam seu repertório de receptores para monitorar dinamicamente o microambiente cerebral e regular a função cerebral normal para manter a homeostase cerebral3. As microglias são muito sensíveis às mudanças em seu microambiente e sofrem alterações na morfologia celular, imunofenótipo e função com condições patológicas ou vários estímulos. Os estados de ativação microglial são influenciados pelas demandas de energia celular necessárias para sua função, como fagocitose, produção de citocinas ou reparo tecidual. Portanto, o metabolismo energético celular desempenha um papel crucial na regulação das mudanças na função microglial4. A desregulação microglial leva à liberação excessiva de citocinas pró-inflamatórias (por exemplo, IL-1β, TNF-α) e espécies reativas de oxigênio (ROS), predispondo o cérebro à neuroinflamação 5,6. A desregulação microglial crônica e o ambiente neuroinflamatório resultante estabelecem uma base para a neurodegeneração7.

O cérebro é responsável por apenas 2% do peso corporal, mas 20% do consumo total de energia do corpo. As mitocôndrias são a principal fonte de energia nas células cerebrais e atuam como atores-chave na patogênese de distúrbios cerebrais agudos e crônicos8. Estudos anteriores estabeleceram uma forte correlação entre a ativação microglial e a disfunção metabólica noenvelhecimento9 e distúrbios relacionados à idade, como a doença de Alzheimer10,11, destacando o papel fundamental das mitocôndrias na senescência celular e neurodegeneração. A função mitocondrial prejudicada leva à diminuição da produção de energia, estresse oxidativo elevado e aumento da neuroinflamação durante o envelhecimento e doenças relacionadas à idade.

Embora uma extensa pesquisa tenha elucidado o papel das mitocôndrias no metabolismo energético, envelhecimento e distúrbios cerebrais, o papel das modificações pós-traducionais comuns, como a glicosilação, na biologia e função mitocondrial permanece insuficientemente explorado. A glicosilação, a adição enzimática de porções de açúcar chamadas glicanos às proteínas por enzimas de glicosilação, é a modificação pós-traducional mais comum na maioria das células cerebrais, incluindo a microglia. A microglia ativada modula sua função imunológica sob estímulos inflamatórios, regulando a expressão intracelular ou de glicanos na superfície celular12. As respostas pró e anti-inflamatórias exibidas pela microglia pós-estimulação também são reguladas pelos glicanos13. As proteínas mitocondriais também possuem essas modificações de glicano, que regulam sua função e localização. No entanto, falta uma análise detalhada dos padrões de glicosilação mitocondrial específicos da célula na microglia devido aos desafios técnicos na investigação da glicosilação subcelular. Apesar dos papéis bem caracterizados da glicosilação na modulação do fenótipo microglial, o papel dos glicanos na modulação da função mitocondrial e, subsequentemente, do imunofenótipo celular na microglia permanece pouco compreendido.

Estudos limitados que investigam a glicosilação de proteínas mitocondriais se concentraram principalmente na identificação baseada em lectina de padrões de glicosilação. As lectinas são proteínas de ligação ao glicano que se ligam a porções biomoleculares de glicanos14,15, que carecem de especificidade e capacidade de fornecer informações detalhadas sobre a composição do glicano. As modalidades de espectrometria de massa oferecem uma identificação detalhada das composições de glicanos para superar os desafios analíticos apresentados pela análise de lectinas. Uma dessas modalidades, a ionização por eletrospray de dessorção a laser assistida por matriz infravermelha (IR-MALDESI), emprega uma estratégia de ionização híbrida, usando um laser de infravermelho médio para excitar ressonantemente a água encontrada em espécimes biológicos16 para dessorver as espécies neutras e submetê-las a uma pluma de eletrospray ortogonal, seguida de análise usando um espectrômetro de massa Orbitrap de massa preciso de alta resolução. O IR-MALDESI foi demonstrado anteriormente para a análise direta de metabólitos teciduais17, com vantagens distintas de análise rápida18, método de ionização suave e previsibilidade do conteúdo de ácido siálico de glicanos ligados a N com base nos padrões de distribuição isotópica de adutos de glicanos clorados19. No entanto, a adaptação desta plataforma para a análise direta de glicanos subcelulares não foi demonstrada.

Aqui, relatamos um protocolo de alto rendimento para isolamento mitocondrial de células microgliais, isolamento de N-glicanos mitocondriais e detecção e análise de N-glicanos mitocondriais usando espectrometria de massa IR-MALDESI. Este protocolo será fundamental para descobrir novos insights sobre o papel da glicosilação na função mitocondrial, potencialmente identificando novos alvos terapêuticos para distúrbios neuroinflamatórios e neurodegenerativos.

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Protocolo

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1. Cultura de linha celular microglial BV2

  1. Manter as células BV-2 (células microgliais derivadas de camundongos C57BL/6) em meio DMEM com baixo teor de glicose suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 1% de Penicillium-estreptomicina (PenStrep) e 1% de aminoácidos não essenciais (NEAA).
  2. Cultive as células em frascos T-175 e permita que atinjam 70-80% de confluência.
  3. Divida as células incubando com as enzimas de dissociação celular por 5 min a 37 ° C em 5% de CO2, seguido de inativação das enzimas com um volume igual de meio celular e centrifugação das células por 5 min a 500 × g à temperatura ambiente (RT).
    NOTA: As enzimas de dissociação celular usadas aqui são mais suaves para as células BV2 do que a tripsina e podem ser usadas para proteger a expressão do antígeno da superfície celular.
  4. Aspire o meio, ressuspenda o pellet celular em 1 mL de meio de crescimento e conte as células usando azul de tripano (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: Usamos um contador de células automatizado para esta etapa para contar células.
  5. Para realizar o isolamento mitocondrial, proceda se o pellet celular contiver 2 × 107 (20 milhões de células/pellet).

2. Isolamento de mitocôndrias de células microgliais

NOTA: Trabalhe rapidamente, mantendo tudo no gelo durante todo o procedimento. O kit de isolamento mitocondrial usado para isolamento mitocondrial tem três componentes: Reagentes A (tampão de lise celular), Reagente B (tampão estabilizador) e Reagente C (tampão de lavagem mitocondrial). Adicione inibidores de protease ao reagente A e ao reagente C imediatamente antes de usar.

  1. Pellet 2 × 107 células centrifugando as células colhidas em um tubo de microcentrífuga de 2,0 mL a 500 × g por 5 min. Aspire e descarte cuidadosamente o sobrenadante.
  2. Adicione 800 μL de reagente de isolamento mitocondrial A (tampão de lise celular), vórtice em velocidade média por 5 s e incube o tubo no gelo por exatamente 2 min.
    NOTA: Não exceda a incubação de 2 min.
  3. Adicione 10 μL de reagente de isolamento mitocondrial B (tampão estabilizador), vórtice na velocidade máxima por 5 s e incube o tubo no gelo por 5 min, vórtice na velocidade máxima a cada minuto.
  4. Adicione 800 μL de reagente de isolamento de mitocôndrias C (tampão de lavagem mitocondrial), inverta o tubo várias vezes para misturar e centrifugue o tubo a 700 × g por 10 min a 4 ° C.
    NOTA: Não vórtice.
  5. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de 2,0 ml e centrifugue a 3.000 × g durante 15 min a 4 °C.
  6. Transfira o sobrenadante (porções citosólicas) para um novo tubo. O pellet contém as mitocôndrias isoladas.
  7. Adicione 500 μL de reagente de isolamento de mitocôndrias C ao pellet e centrifugue a 12.000 × g por 5 min.
  8. Utilizar o pellet para quantificação e processamento de proteínas ou conservá-lo a -80 °C até nova utilização.

3. Estimação de proteínas usando o ensaio microBCA

NOTA: A estimativa de proteínas para este protocolo pode ser realizada usando diferentes reagentes e ensaios. A quantificação de proteínas citosólicas ou mitocondriais pode ser realizada normalizando em relação à concentração total de proteínas usada no ensaio.

  1. Preparar padrões de albumina de soro bovino (BSA) entre 0 μg/mL e 200 μg/mL (0 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2,5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 200 μg/mL) e brancos apenas com tampão de lise.
  2. Adicione 150 μL de cada padrão na placa de fundo plano de 96 poços contendo as amostras.
  3. Misture 25 partes de Micro BCA Reagent MA (solução de ácido bicinconínico (BCA)) e 24 partes de Reagente MB (solução de sulfato de cobre) com 1 parte de Reagente MC (tampão estabilizador) (25:24:1, Reagentes MA:MB:MC) para criar um reagente funcional. Adicione 150 μL do reagente BCA misto a cada amostra e padrão.
  4. Incubar a 37 °C durante 2 h.
  5. Utilizar um leitor de placas para medir a absorvância a 562 nm e quantificar a concentração de proteínas com a curva-padrão. Subtraia a absorbância padrão em branco da medição de absorbância de todos os outros padrões individuais e réplicas de amostras desconhecidas para obter as concentrações de proteínas da amostra.

4. Controle de qualidade da preparação mitocondrial (western blot)

  1. Ressuspenda o pellet mitocondrial no tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) para realizar a quantificação de proteínas. Determine a concentração de proteína para cada amostra usando o ensaio micro BCA.
  2. Desnaturar as amostras em tampão de amostra a 94 oC por 5 min.
  3. Carregue quantidades iguais (20 μg) de proteína mitocondrial em géis pré-moldados (consulte a Tabela de Materiais), juntamente com o marcador de peso molecular.
  4. Execute o gel por 50 min a 100 V.
    NOTA: O tempo de execução pode variar, portanto, certifique-se de parar o gel quando as proteínas atingirem o final do gel indicado pelo corante no tampão de amostra.
  5. Transfira as proteínas do gel para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) usando o protocolo de transferência a seco em um sistema de transferência de western blot por 7 min a 20 V.
  6. Retirar a membrana e bloquear com a solução de bloqueio (Tabela 1) durante 1 h à temperatura ambiente.
  7. Adicione diluições apropriadas de anticorpo primário à membrana no tampão de bloqueio durante a noite a 4 oC (COXIV = 1: 3.000, GAPDH = 1: 3.000).
    NOTA: A ausência de contaminação nuclear do retículo endoplasmático (ER) na preparação mitocondrial pode ser testada usando marcadores adicionais como lamina (marcador nuclear) e ERp57 (marcador ER) em western blots.
  8. Lave a membrana por 3 x 15 min com o tampão de lavagem (Tabela 1).
  9. Incubar a membrana com a diluição apropriada de anticorpo secundário conjugado com HRP em tampão de bloqueio à temperatura ambiente por 1 h
  10. Lave a membrana por 3 x 15 min com o tampão de lavagem.
  11. Para o desenvolvimento, use um kit de substrato quimioluminescente.
  12. Escaneie a membrana usando um gel e um gerador de imagens de membrana.

5. Isolamento de proteína mitocondrial para extração de N-glicano da microglia

  1. Ressuspenda as mitocôndrias isoladas em 50 μL de tampão de isolamento de proteína (Tabela 1) e deixe no gelo por 20 min.
  2. Aspirar e dispensar três vezes e deixar 20 min no gelo (vórtice antes de usar). Se o pellet mitocondrial não estiver totalmente solubilizado, adicione mais 50 μL do tampão de isolamento e agrupe no mesmo tubo.
  3. Centrifugue a 13.000 × g por 10 min.
  4. Recuperar o sobrenadante, congelar a -80 °C durante um mínimo de 1 h e secar o máximo possível num concentrador de vácuo.
  5. Ressuspenda antes do isolamento do glicano usando o tampão de digestão PNGase (Tabela 1) para IR-MALDESI.

6. Preparação mitocondrial de N-glicano para IR-MALDESI

  1. Carregue 25-250 μg de proteína (em volume máximo de 250 μL) de proteínas mitocondriais isoladas em um filtro de corte de peso molecular (MWCO) de 10 kDa.
  2. Reduza as amostras de proteína para expor as porções de glicano adicionando 2 μL de ditiotreitol 1 M (DTT) a cada amostra no filtro.
  3. Diluir a amostra com 200 μL de tampão de digestão PNGase e vórtice levemente para evitar perturbar o filtro.
  4. Desnaturar as proteínas mitocondriais incubando a amostra a 56 °C durante 30 min.
  5. Use 50 μL de iodoacetamida 1 M para alquilar as mitocôndrias para obter uma concentração final de ~ 200 mM e incube a 37 ° C por 60 min.
  6. Para concentrar ainda mais os métodos mitocondriais desnaturados, centrifugue as amostras a 14.000 × g por 40 min. Descarte o fluxo.
  7. Lave a amostra com 100 μL de tampão de digestão PNGase.
  8. Concentrar a glicoproteína no filtro a 14.000 × g durante 20 min e rejeitar o fluxo. Repita a etapa de lavagem e concentração 2x, para um total de 3x, produzindo um concentrado no volume morto do filtro (~ 5 μL). Descarte todo o fluxo.
  9. Descarte o frasco de coleta assim que as lavagens estiverem concluídas. Use um novo frasco de coleta para todos os eluentes e lavagens futuras.
  10. Para clivar os glicanos de glicopadrões mitocondriais desnaturados, transfira para um frasco de coleta fresco e adicione 2 μL de PNGase livre de glicerol (75.000 unidades / mL) ao filtro. Adicione 98 μL de tampão de digestão PNGase, elevando o volume total para 100 μL e misture pipetando suavemente para cima e para baixo no filtro.
  11. Incubar amostras a 37 °C durante 18 h para clivar enzimaticamente todos os N-glicanos das proteínas mitocondriais.
  12. Eluir os N-glicanos mitocondriais libertados centrifugando a amostra a 14.000 × g durante 20 min a 20 °C.
  13. Lave os glicanos mitocondriais adicionando 100 μL de tampão de digestão PNGase ao filtro e centrifugue a 14.000 × g por 20 min a 20 ° C. Recolher a lavagem que contém os N-glicanos restantes no mesmo frasco para injetáveis de recolha que o eluente. Repita 2x e remova o filtro do frasco de coleta.
  14. Incubar as amostras de glicano mitocondrial no freezer a -80 ° C até congelar (30-60 min) e secar até a conclusão à temperatura ambiente em um concentrador a vácuo (4-6 h para 400 μL).
    NOTA: Os N-glicanos podem ser armazenados a -20 °C até 6 meses antes da análise.
  15. Ressuspenda os glicanos ligados a N secos em 50 μL de água de grau LC/MS diretamente antes da análise IR-MALDESI.

7. Detecção de glicanos liberados por espectrometria de massa IR-MALDESI

  1. Realize a calibração de massa a cada dia do experimento. Carregue a solução de calibração em uma bomba de seringa e empurre-a a uma taxa de 1.2 μL/min. Aplique uma tensão de 3,5 kV para obter uma pluma de eletrospray estável para calibração de massa nos modos positivo e negativo.
  2. Pipete 5 μL de glicanos mitocondriais ressuspensos em um ponto de amostra em uma lâmina de micropoço de Teflon.
  3. Use um laser de infravermelho médio operando em um comprimento de onda de 2,97 μm para ablação com uma energia de 1,8 mJ por rajada.
  4. Ionize e detecte N-glicanos no modo de ionização negativa. Use solvente de eletrospray consistindo de 60% de acetonitrila e ácido acético 1 mM para criar uma pluma de eletrospray estável com uma taxa de fluxo de 2 μL / min a uma tensão de 3.2 kV.
  5. Para realizar a análise, acople o IR-MALDESI a um espectrômetro de massa HRAM ajustado para um poder de resolução de massa de 240.000FWHM a m / z 200, analisando entre 500 e 2.000 m / z no modo de ionização negativa.
  6. Desligue o controle automático de ganho (AGC) e defina um tempo de injeção fixo de 90 ms. Use a fonte EasyIC para calibração interna em tempo real de cada espectro para obter alta precisão de medição de massa (MMA).

8. Análise de dados de N-glicano mitocondrial

  1. Identifique manualmente os glicanos ligados a N pesquisando massas monoisotópicas e confirmando distribuições isotópicas usando o espaçamento m/z para determinar íons duplamente e triplamente carregados que têm um limite mínimo de fluxo de íons de 1.000 íons/s.
  2. Converta os espectros de massa bruta de razões m / z em massas monoisotópicas neutras.
  3. Carregue as massas monoisotópicas em uma ferramenta de previsão de estrutura de oligossacarídeos on-line para determinar possíveis composições de glicanos. Confirme as anotações usando um banco de dados glicômico com curadoria experimental20; certifique-se de que cada identificação esteja dentro da margem de 2,5 ppm de MMA, contenha a estrutura central de glicanos ligados a N (Hex3HexNAc2) e exclua monossacarídeos de pentose, KDN ou HexA.
  4. Desenhe as estruturas de glicano confirmadas usando a nomenclatura SNFG21.
  5. Obtenha a abundância relativa de glicanos dos espectros de massa bruta e normalize contra a quantidade de proteína mitocondrial em μg para obter íons / s / μg.
  6. Use a análise qui-quadrado para testar a qualidade do ajuste entre as distribuições teóricas e experimentais dos glicanos ligados a N para determinar o número de adutos de cloro. Isso permite a determinação direta do número de ácidos siálicos19.

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Resultados

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A Figura 1 representa um esboço esquemático das etapas envolvidas no isolamento das mitocôndrias da linha celular microglial BV2 para análise de glicano por espectrometria de massa. A reprodutibilidade do isolamento da proteína mitocondrial entre diferentes preparações mitocondriais a partir da mesma densidade inicial das células microgliais está representada na Figura 2, que não mostra diferença significativa entre a concentração de proteína mitocondrial estima...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A microglia são as células imunes residentes do cérebro, e as modificações do glicano modulam o imunofenótipo e a função da microglia. Essas funções imunológicas demandam energia celular substancial, que é predominantemente fornecida pelas mitocôndrias. Notavelmente, as proteínas mitocondriais também apresentam modificações de glicanos, que permaneceram significativamente pouco estudadas devido aos desafios tecnológicos na investigação da glicosilação subcelular. A maioria dos estudos qu...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de agradecer a Seth Eisenberg, estudante de pós-graduação no Muddiman Lab da NCSU, por sua ajuda na gravação em vídeo do protocolo de espectrometria de massa. Esta pesquisa foi apoiada em parte pelo Programa de Bolsas de Inovação da Escola de Engenharia da Universidade do Alabama em Birmingham, AG068309 para DJT e R01GM087964-12 para DCM. Os esquemas deste manuscrito foram desenhados usando BioRender.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Equipment
Amersham 600 imagerCytvia 29194217Imager de gel e membrana
Contador de células automatizado Countess 3de Banho Seco X003SZ1LY9Fisher Scientific
4 blck 100-120VThermofisher scientific 
i-Blot2 Dispositivo de transferência de gelInvitrogenIB21001Sistema de transferência de Western blot
Microscópio invertidoCell Treat04355223EA
Leitor82050-760
Mini tanque de gelInvitrogenA25977
Open Air RockerFisher Marca88861025
Menino Pipet BioTek229310
Misturador de vórticeIntegra- VWR
Reagentes de isolamento de mitocôndrias  Kit de
isolamento mitocondrialThermofisher scientific 89874
Inibidor de FosfataseThermofisher scientific 
Inibidor de ProteaseThermofisher scientific 1861281
N-glicano e reagentes IR-MALDESI
Ácido acético Fisher ScientificA1135050% em ESI solvente
Acetonitrila Sigma Aldrich34851-4L1 mM em solvente ESI
Bicarbonato de amônio de Calibração A643500100 mMda Fisher
Scientific Thermofisher ScientificA39239Pierce FlexMix
Dithiothreitol Sigma AldrichAC4263801001 M
IodoacetamidaSigma AldrichA322-10VL
LC/MS grau águaThermofisher Scientific047146.M6
PNGase FBulldog BioNZPP01075000 U/mL, enzima para liberação de N-glicano 
Isolamento de N-glicano e consumíveis IR-MALDESI
Amicon filtros centrífugosFisher Scientific UFC501024MWCO de 10 kDa
Orbitrap Exploris 240
Mid-IR LaserJGM Associates, Burlington, MA, EUA
Lâmina de micropoço de teflonProsolia, Indianápolis, IN, EUA
strong>N-glycan analysis softwares
GlycoMod Expasy https://web.expasy.org/glycomod/
GlyConnectExpasy https://glyconnect.expasy.org/
Isolamento de proteínas e consumíveis de western blot 
Basix pontas de carregamento de gel (10 µ L) Basix13-611-102
Pontas de carregamento de gel Basix (200 µ L) Basix13-611-116
Raspador de célulasVWR labs14-388-100
i-Blot NC pilhas regularesInvitrogenIB23001
Blot2 PVDF Regular StacksInvitrogenIB24001
10  µ L micropipetaFisher ScientificFBE00010
20 µ L micropipetaInvitrogenFBE00020
200  µ L micropipeta Marca FisherFBE00200
1000 µ L micropipetaMarca FisherFBE01000
10  µ Pontas de pipeta em LVWR labs76322-528
20  µ Pontas de pipeta LVWR labs76322-134
200  µ Pontas de pipeta em LVWR labs76322-150
1000  µ Pontas de pipeta LVWR labs76322-154
Placa de poço Marca Fisher14-388-100
Isolamento de proteínas e reagentes western blot 
Actin antibody ( Host : Rabbit )Cell Signaling Technologies8457T
Anti-Rabbit IgG HRP Linked Cell Signaling Technologies7074S
Bolt 4-12% Bis-Tris PlusInvitrogenNW04120BOX
Albumina de soro bovinoFisher biorreagentesBP9700-100
anticorpo COXIV (Hospedeiro: Coelho)Cell Signaling Technologies4844S
Anticorpo GAPDH (Hospedeiro: Coelho)Cell Signaling Technologies2118S
Kit de ensaio de proteína MicroBCAThermofisher scientific 23235
Nupage MOPS SDS Runing Buffer [20x]Thermofisher scientific NP0001
PÁGINA Régua de proteína pré-fabricadaThermofisher scientific 815-968-0747Diluição= Use 7  µ L para carregar no primeiro poço
Solução salina tamponada com fosfato Aniara DiagnosticsA12-9423-5Prepare 1x PBS de 10x pó 
Substrato de Blotting Western Pierce ECLThermofisher scientific 32106Kit de substrato quimioluminescente
RIPA BufferThermofisher scientific 89901
Tampão de AmostraNovexB0007O tampão de amostra LDS de parafuso é preparado na proporção de 3:1 de amostra para tampão de amostra
Tween-20MP BiomedicalsTWEEN201
Consumíveis de cultura de tecidos 
Countess SlidesAvantor229411
Eppendorf tubesCell Treat414004-265612-5884
2 mL pipeta de aspiraçãoVista lab5090-0010E
5 mL pipeta sorológica Fisher Scientific13-678-11D
10 mLBasix13-678-11E
25 mL pipeta sorológicaVista labFB012937
50 mL pipeta sorológicaVista lab14955233
15 mL Tubo cônicoAvantor229225A
50 mL tubo cônicoTratamento celular4190-0050
T-75 cm2 Frasco de cultura de tecidosFisher Scientific
T-180 cm2 Frasco para cultura de tecidosFisher ScientificFB012939
Reagentes para cultura de tecidos 
BV2 linha de células microgliais Bioarray Criativo CSC-I2227ZMicroglia de camundongo imortalizada (BV2) derivada da microglia neonatal C57/BL6 
Enzimas de dissociação celular Thermofisher scientific 12563029TrypLE 
Meio de Baixo Glicose Modificado Eagle Medium (DMEM) da Dulbecco Gibco10567014
Fetal Soro BovinoCytivaSH30071.03HI
Mínimo Essencial Meio (MEM) Aminoácidos Não EssenciaisGibco11140050
Penicillium StreptomycinCytiviaSV30010
Tampão de fosfato salinaCorning21-040-CV
Trypan Blue mancha 0,4%InvitrogenT10282
Padrão 88870003 de microplacas 1861274Solução Espectrômetro de massa <Pipeta sorológica FB012937

Referências

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