Análise Multimodal de Microplásticos em Água Potável usando um Pipeline de Análise de Nanomembrana de Silício

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo que mostra um substrato opticamente transparente e plano para a captura e análise simplificadas de partículas contaminantes na água potável. Aqui é apresentado o Silicon Nanomembrane Analysis Pipeline (SNAP): um pipeline flexível para a captura, quantificação e identificação de partículas em meios líquidos.

Abstract

O impacto biológico da poluição por microplásticos em fontes humanas de alimentos e água é amplamente desconhecido, e as fontes de água potável não estão isentas dessa contaminação por microplásticos. Aqui, demonstramos uma abordagem simplificada para capturar, quantificar e identificar microplásticos na água potável. Apresentamos um fluxo de trabalho analítico denominado Pipeline de Análise de Nanomembranas de Silício (SNAP) que aproveita as novas nanomembranas de nitreto de silício que permitem um "fator de concentração" significativo, que consolida partículas suspensas em uma área de observação planarizada para análise de partículas individualizadas, quantificáveis e multimodais no mesmo substrato. As principais vantagens do SNAP derivam do uso de membranas ultrafinas à base de nitreto de silício alojadas em discos de filtro de tamanho convencional, permitindo a captura e análise direta de MPs poliméricos em um fundo não polimérico. Amostras de água potável provenientes da região de Rochester, NY, foram coletadas de fontes de torneiras residenciais e analisadas usando SNAP. As partículas em cada amostra foram caracterizadas por microscopia óptica e eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia Raman e espectroscopia de raios-X por dispersão de energia (EDX), e vários constituintes identificados foram quantificados proporcionalmente ao total de partículas capturadas.

Introduction

Os microplásticos são definidos como polímeros sintéticos medindo menos de cinco milímetros de tamanho ^1,2. A poluição por microplásticos (MP) é uma preocupação crescente para a saúde humana, ambiental e ecológica. A contaminação por MP foi encontrada em fontes de água de todos os tipos; água doce, oceanos e até fontes de água potável³. Os MPs são gerados a partir da decomposição de fontes primárias de plástico⁴, bem como de têxteis sintéticos ^5,6,7. Os MPs são onipresentes e foram encontrados em tecidos humanos, como placenta humana, fezes e sangue ^8,9,10. Há um interesse crescente na pesquisa de MP, como evidenciado por mais de 4.100 e 4.600 publicações em 2023 e 2024, respectivamente (dados do PubMed; palavra-chave "microplásticos"), bem como uma crescente preocupação pública em relação à exposição humana aos MPs. Respondendo a uma crescente preocupação pública, vários órgãos reguladores governamentais, como o Estado da Califórnia¹¹ e vários países da UE¹², têm vindo (ou estarão) a aplicar regulamentos sobre os níveis de MP na água potável. Considerando tudo isso, a Agência de Proteção Ambiental dos EUA anunciou recentemente os parlamentares como um novo contaminante preocupante. No entanto, a avaliação de risco humano é severamente prejudicada pela falta de métodos para a detecção confiável e reprodutível de MPs.

A caracterização de MPs depende de métodos analíticos, como microscopia óptica e eletrônica¹³ e técnicas espectroscópicas e espectrométricas ^1,14,15 para entender as características visuais de MPs⁷ e sua composição, respectivamente. As amostras contendo MPs devem incluir várias análises para caracterizar, identificar e quantificar MPs e, pelo menos, requerem espectroscopia/espectrometria (ou seja, espectroscopia Raman, espectroscopia de infravermelho ou cromatografia gasosa de pirólise-espectrometria de massa, etc.) de acordo com alguns requisitos mínimos de periódicos para a medição de plásticos em amostras ambientais, como Science of the Total Environment¹⁶. A espectroscopia Raman é mais versátil do que a espectroscopia de infravermelho (IR), especialmente no que diz respeito à identificação de materiais em amostras biológicas. A espectroscopia Raman é uma técnica de espalhamento de luz, permitindo analisar partículas menores com mais facilidade do que o IR, uma técnica de absorção de luz que requer partículas maiores e tem mais restrições na colocação da amostra¹⁷. Foi sugerido anteriormente que substratos para espectroscopia Raman compreendendo silício ou óxido de silício podem produzir resultados confiáveis com ruído de fundo mínimo¹⁸.

Substratos para certas técnicas analíticas que geralmente são compatíveis com um tipo de análise (ou seja, substratos revestidos de ouro necessários para espectroscopia de infravermelho) geralmente não são compatíveis com microscopia de luz de transmissão e/ou refletância. Posteriormente, a subamostragem replicada é popular entre os investigadores para produzir amostras apropriadas para cada análise separada, mas a subamostragem é demorada e pode excluir partículas de baixa abundância ^1,2,6. Normalmente, as transferências manuais de partículas de um substrato para o próximo são necessárias para analisar a mesma partícula para caracterização e identificação por diferentes modalidades analíticas, mas essas transferências manuais lentas aumentam a probabilidade de viés, contaminação e perda, bem como limitam a análise de MPs apenas às partículas de maior tamanho que podem ser manipuladas manualmente¹³. Esses fluxos de trabalho abaixo do ideal introduzem inúmeros desafios e problemas de confiabilidade, contribuindo para a variabilidade significativa na quantificação de MP relatada na literatura ^3,7.

Aqui, apresentamos um fluxo de trabalho analítico que chamamos de Pipeline de Análise de Nanomembrana de Silício (SNAP) para capturar, caracterizar, identificar e quantificar MPs e demonstrar a utilidade do SNAP analisando amostras de água potável provenientes da região de Rochester, NY. O SNAP é habilitado por discos de filtro de 25 mm de diâmetro de tamanho convencional com nanomembranas de silício integradas (consulte a Tabela Suplementar S1 para propriedades da membrana), que oferecem um substrato uniforme para concentrar e analisar MPs de água potável usando várias técnicas^15,19. Depois de concentrar e capturar sequencialmente MPs em nanomembranas com tamanhos de corte decrescentes (nitreto de silício microporoso de 20 μm (MPSN) com poros cilíndricos e nitreto de silício microfenda de 8,0 μm (MSSN) com poros de prisma retangular), o SNAP facilita três etapas analíticas consecutivas: 1) coloração de amostra, microscopia óptica e quantificação de MP, 2) identificação de partículas via espectroscopia Raman, seguida de 3) caracterização de partículas via microscopia eletrônica de varredura (SEM), permitindo múltiplas análises das mesmas partículas capturadas em um substrato de nanomembrana.

Demonstramos vários pipelines SNAP utilizando discos de filtro de nanomembrana de silício (SiN) não revestidos e discos de filtro de nanomembrana de silício revestidos de ouro (Au-SiN): Pipeline A) SNAP realizado em SiN e caracterizando sequencialmente os mesmos MPs por meio de várias técnicas analíticas; Pipeline B) SNAP realizado em Au-SiN com espectroscopia Raman; e Pipeline C) SNAP realizado em Au-SiN com MEV equipado com espectroscopia de raios X por dispersão de energia (EDX) (Figura 1). As variações do SNAP são, portanto, fluxos de trabalho analíticos flexíveis e simplificados que podem ser usados para vários tipos de amostras e técnicas analíticas. Ao contrário dos métodos publicados anteriormente que dependem de membranas poliméricas¹¹, as vantagens do SNAP derivam do uso de nanomembranas de silício, onde MPs de polímeros sintéticos são capturados em uma membrana não polimérica à base de silício, permitindo a identificação composicional de MPs em um fundo não polimérico. Além disso, as nanomembranas de silício oferecem planos focais uniformes, ao contrário das membranas poliméricas, que tendem a enrugar, permitindo várias técnicas automatizadas de microscopia e espectroscopia.

Anteriormente, caracterizamos o uso de nanomembranas de silício para análises de MP por modelagem analítica, desafios de partículas modelo e amostras de água potável e ar^19,20, bem como comparando suas propriedades de filtração e microscopia óptica usando partículas modelo contra quatro membranas amplamente utilizadas¹⁵. Neste protocolo, demonstramos heuristicamente a utilidade do SNAP para a análise de MPs em quatro amostras de água potável. As amostras foram coletadas de quatro fontes de água distintas ao redor da área metropolitana de Rochester, NY. Cada amostra incluída neste estudo originou-se de uma fonte distinta de água superficial, como o Lago Ontário, o Lago Hemlock, uma mistura de Hemlock e Ontário e o Lago Canandaigua (Figura 2). As partículas capturadas dessas fontes de água potável incluíam plásticos generalizados como poliestireno (PS) e polietileno (PE), metais pesados como ferro, sílica e partículas não sintéticas.

Protocol

1. Procedimentos de controle de qualidade e preparações de soluções ultrapuras

1. Limpeza de capa de fluxo laminar e luva
   1. Use EPI (equipamento de proteção individual): jaleco 100% algodão e luvas de nitrilo.
      NOTA: O EPI é contínuo durante todo o protocolo.
   2. Pulverize luvas de nitrilo com álcool isopropílico 99% (IPA). Esfregue as mãos e depois enxágue com ~ 18 MΩ, água filtrada a 0,22 μm. Faça isso 3x para remover o agente desmoldante das luvas.
   3. Dobre um lenço de trabalho delicado de fibra natural em quartos e borrife com 70% de IPA. Limpe a superfície do capô de trás para frente em movimentos longos, dobrando novamente o lenço delicado para uma superfície não utilizada a cada dois movimentos. Continue limpando o exaustor até que todas as superfícies tenham sido limpas, substituindo o lenço por um novo depois de sujo.
   4. Descubra o tapete de silicone e role pela superfície do capô para coletar as partículas restantes. Para limpar o rolo de silicone, borrife com 99% de IPA e esfregue com as mãos enluvadas, depois enxágue com 18 MΩ, água filtrada a 0,22 μm. Repita 3x e deixe secar ao ar no capô.
   5. Enxágue novamente as luvas como na etapa 1.1.2.
2. Água ultrapura e geração de IPA.
   1. Encha um copo de 1 L com 18 MΩ de água e coloque-o no exaustor.
   2. Prepare uma seringa de 60 mL e um filtro de seringa de corte de 0.22 μm conectado, filtrando pelo menos 200 mL de água a 18 MΩ através da seringa e do filtro conectado.
      NOTA: Uma bomba de seringa economizará tempo, mas não é um requisito para realizar o protocolo descrito.
   3. Enxágue um recipiente com tampa de rosca de vidro 3x com 18 MΩ, água filtrada a 0.22 μm. Encha com 0,22 μm de água filtrada a 18 MΩ filtrada por seringa.
   4. Repita as etapas 1.2.1-1.2.3 com a concentração % desejada de IPA em vez de 18 MΩ, água filtrada de 0.22 μm para gerar IPA ultrapuro.

2. Captura de partículas de amostras líquidas por filtração

NOTA: O protocolo abaixo pode ser utilizado com líquido samples que não sejam água. Os métodos de coleta de amostras validados devem ser deixados a critério do investigador com base nas necessidades de seu estudo e da amostra.

1. Use EPI.
   NOTA: Certifique-se de que as luvas e as superfícies do capuz sejam limpas de acordo com as etapas 1.1.2-1.1.5.
2. Pulverize uma junta de silicone com Ultrapure 99% IPA, esfregue com os dedos enluvados e depois enxágue com água Ultrapure. Repita isso 3x para cada junta.
   NOTA: O número de juntas a serem usadas na filtragem é igual ao número de discos de filtro a serem usados, mais 1. Consulte a Figura 1B para obter o gráfico visual do assembly.
3. Utilizando a seringa preparada na etapa 1.1.2, enxágue o interior da seringa de 60 mL com a água Ultrapura absorvendo 30 mL de água Ultrapura e 30 mL de ar na seringa. Enrosque um filtro de seringa, agite vigorosamente e dispense. Repita isso 3x.
   NOTA: Qualquer tamanho de seringa pode ser utilizado conforme necessário com base no volume da amostra.
4. Monte o aparelho de filtragem conforme mostrado no gráfico de montagem visual na Figura 1B.
   NOTA: Use uma pinça limpa para manusear os discos e juntas do filtro durante a montagem e desmontagem.
   1. Para filtrações sequenciais, certifique-se de que haja uma junta entre o disco e a frita de suporte, uma junta entre cada disco e uma junta entre o disco e o funil de filtração.
   2. Certifique-se de que os discos sejam ordenados com o maior filtro de corte na parte superior da pilha e o menor filtro de corte na parte inferior.
5. Ligue o vácuo do aparelho para que haja fluxo negativo através da pilha de discos do filtro.
6. Medindo a contaminação de fundo
   NOTA: O processo a seguir permite uma avaliação da limpeza da seringa e da geração de meios Ultrapure, e uma determinação das partículas de fundo contribuídas pelos componentes do sistema.
   1. Com a seringa enxaguada, dispense 50 mL de água Ultrapure lentamente sobre a nanomembrana no centro do disco superior para garantir que todo o líquido dispensado seja filtrado.
      NOTA: Se estiver filtrando volumes de amostra maiores (ou seja, >50 mL), sugere-se um funil de filtração de vidro. Limpe o funil de filtração de vidro como na etapa 2.3. Material de laboratório adicional pode incorrer em risco adicional de contaminação por partículas. Mantenha a diligência com os procedimentos de limpeza e sempre confirme a limpeza com filtrações em branco antes de usar as amostras de interesse.
   2. Deixe a água ultrapura filtrar. Mantenha o aspirador ligado por mais um minuto após a filtração. Quando a amostra estiver totalmente seca, desligue o aspirador.
   3. Remova cuidadosamente os discos do filtro das juntas usando uma pinça limpa e coloque os discos no recipiente limpo e rotulado apropriado para armazenamento, como uma placa de Petri de vidro ou caixa escura.
   4. Imagem dos discos de filtro sob microscopia para análise óptica, contagem de partículas, etc.
7. Para líquido samples, limpe uma junta adicional como na etapa 2.2. Obtenha uma nova seringa para cada amostra de meio líquido exclusiva e repita a etapa 2.3.
8. Pegue a quantidade desejada de amostra e dispense a amostra lentamente sobre a nanomembrana no centro do disco superior.
9. Quando a filtração da amostra estiver concluída, realize 3 enxágues com 1 mL de água ultrapura para garantir que todas as partículas na amostra tenham sido suficientemente enxaguadas de todas as superfícies na membrana no centro do disco do filtro.
10. Mantenha o aspirador ligado por mais um minuto para secar completamente a amostra enxaguada 3x e, em seguida, desligue o aspirador.
    1. Repita as etapas 2.7-2.10. para cada réplica a ser realizada da amostra de interesse.

3. Preparação e coloração de corante fluorescente

NOTA: A coloração fluorescente com Vermelho do Nilo e/ou Azul de Tripano pode interferir nos lasers de espectroscopia Raman de interesse.

1. Coloração com Vermelho do Nilo (NR)
   1. Use EPI.
   2. Limpe as luvas e o capuz conforme as etapas 1.1.2 a 1.1.5.
   3. Conclua a filtragem da amostra conforme descrito nas etapas 2.7 a 2.10.
   4. Enxágue dois recipientes com tampa de rosca de vidro com água ultrapura 3x.
   5. Prepare uma solução de 0,1 mg / mL de NR em IPA Ultrapure 99% em um recipiente de vidro limpo.
   6. Inverta suavemente 10x para misturar.
   7. Filtrar a solução de NR com um filtro de seringa de 0,22 μm para o segundo recipiente com tampa de rosca de vidro.
      NOTA: O filtro usado para pré-filtrar o NR deve ter um corte menor do que o filtro usado para filtrar as amostras.
   8. Coloque o disco filtrante a ser corado na frita de suporte do balão de coleta a vácuo.
   9. Pipete 20 μL da solução de NR 0,1 mg / mL na nanomembrana no centro do disco filtrante.
      NOTA: A mancha deve cobrir totalmente a superfície porosa da nanomembrana. Se 20 μL não forem suficientes, adicione corante adicional até que todas as áreas porosas da nanomembrana estejam adequadamente cobertas de cor.
   10. Incube a mancha por 5 min.
   11. Filtre a mancha a vácuo assim que a incubação estiver concluída.
   12. Enxágue 3x com 1 mL de Ultrapure 99% IPA para remover qualquer excesso de mancha NR.
       NOTA: Prossiga para a seção de coloração com azul de tripano abaixo após esta etapa se a contracoloração for realizada.
   13. Deixe o disco do filtro assentar na frita de suporte com o aspirador ligado por 2 min para filtrar e secar qualquer líquido residual. Se não secar após 2 min, transfira o disco filtrante usando uma placa de Petri de vidro limpo para um forno a 70 °C por 2-5 min.
   14. Depois de seco, execute a microscopia de fluorescência conforme descrito na etapa 2.6.4 e prossiga para a seção 4.
2. Coloração com Azul de Tripano (TB)
   1. Use EPI.
   2. Limpe as luvas e o capuz conforme descrito nas etapas 1.1.2-1.1.5.
   3. Conclua a filtragem da amostra das etapas 2.7 a 2.10 ou comece com a etapa 3.2.4.
   4. Enxágue dois recipientes com tampa de rosca de vidro com água ultrapura 3x.
   5. Prepare a coloração de 0,4% TB em um recipiente.
      NOTA: O filtro usado para pré-filtrar o TB deve ter um corte menor do que o filtro usado para filtrar as amostras.
   6. Inverta suavemente 10x para misturar.
   7. Filtre a solução de coloração TB com um filtro de seringa de 0,22 μm no segundo recipiente de tampa de rosca de vidro.
      NOTA: O filtro usado para pré-filtrar o TB deve ter um corte menor do que o filtro usado para filtrar as amostras.
   8. Coloque o disco filtrante a ser corado na frita de suporte do balão de coleta a vácuo.
   9. Pipete 20 μL da coloração de 0,4% TB na nanomembrana no centro do disco do filtro.
      NOTA: A mancha deve cobrir totalmente a superfície porosa da nanomembrana. Se 20 μL não forem suficientes, adicione uma mancha adicional gota a gota até que todas as áreas porosas da nanomembrana estejam adequadamente cobertas pela mancha.
   10. Incube a mancha por 5 min.
   11. Filtre a mancha a vácuo após incubar por 5 min.
   12. Enxágüe com volumes de 1 mL de água ultrapura 3x.
   13. Deixe o disco do filtro assentar na frita de suporte com o aspirador ligado por 2 min para filtrar e secar qualquer líquido residual. Se não secar após 2 min, transfira o disco filtrante usando uma placa de Petri de vidro limpo para um forno a 70 °C por 2-5 min.
   14. Depois de seco, execute a microscopia de fluorescência conforme descrito na etapa 2.6.4 e prossiga para a seção 4.

4. Quantificação de partículas via microscopia de fluorescência

1. Captura de imagem por microscopia óptica
   1. Imobilize o disco do filtro em uma lâmina de microscópio usando uma junta de silicone ou utilize uma lâmina de alinhamento específica para uso do disco de filtro com uma platina de microscópio. Mova o disco de filtro a ser visualizado para a platina do microscópio.
   2. Visualize a nanomembrana usando iluminação de campo claro para que as contagens máximas detectadas sejam ~ 90% do alcance máximo da câmera detectora.
      NOTA: Este valor de 90% é ~59.000 para um detector de 16 bits com níveis de branco em 65.535.
   3. Visualize a nanomembrana usando iluminação fluorescente para que as intensidades máximas de pixel sejam de cerca de ~ 25% do alcance máximo da câmera detectora.
   4. Salve a imagem em um formato TIFF composto de 16 bits.
2. Quantificação de partículas por microscopia de fluorescência
   1. Utilizando a plataforma de análise de imagens, separar o(s) canal(is) fluorescente(s) do TIFF composto gerado no ponto 4.1.4 do canal de campo claro utilizando a função Split-Channels .
   2. Limite as intensidades de pixel usando a função Threshold para um valor de 10.000.
      NOTA: Se houver bloom nas partículas, o limite é muito baixo e deve ser aumentado.
   3. Salve uma imagem separada no formato PNG.
   4. Remova as manchas da imagem para remover pixels de ruído usando a função Despeckle .
   5. Bacia hidrográfica da imagem usando a função Bacia hidrográfica .
      NOTA: Esta função separa partículas adjacentes de tamanho semelhante, ao custo de quebrar grandes partículas contíguas em pedaços menores. Como muitas vezes há muito mais partículas pequenas do que partículas grandes presentes, isso pode ser uma boa troca, mas pode ter efeitos não intencionais, como quebrar fibras longas em fios de pequenas partículas. Inspecione os resultados da imagem antes de aceitar os dados.
   6. Defina a escala das imagens fluorescentes limiares medindo a largura de um poro na imagem de campo claro. Use a largura dos poros medida para definir a escala em pixels/μm.
      NOTA: Para poros retangulares, a menor largura corresponderá ao rótulo do produto. Para poros circulares, o diâmetro corresponderá ao rótulo do produto especificando o tamanho dos poros (ou seja, corte) da nanomembrana.
   7. Aplique a função Contagem de partículas da plataforma de análise de imagem à imagem fluorescente limiar, avaliando a área, min e max.
   8. Processe as imagens fluorescentes e de campo claro para criar composições que visualizem os domínios fluorescentes.
   9. Limite a imagem fluorescente usando o mesmo valor da etapa 4.2.2.
   10. Mescle canais usando a plataforma de análise de imagens. Atribua o canal fluorescente ao canal Vermelho e a imagem de campo claro ao canal Cinzas .
   11. Salve o composto como um arquivo PNG.

5. Espectroscopia Raman

1. Ligue o instrumento Raman e seu computador associado, permitindo que cada um seja iniciado.
2. Abra o software no computador conectado ao instrumento Raman.
3. Quando o software for inicializado, certifique-se de que a Atividade atual do sistema e o status do detector na faixa inferior da tela do programa sejam Pronto e estejam na cor verde, respectivamente.
4. Se o botão Autocalibração (AC) na parte inferior da tela estiver vermelho, execute a autocalibração desejada e deixe-a terminar antes de continuar.
5. Se utilizar apenas um laser e uma grade:
   1. Clique em Sair na tela Autocalibração e selecione o laser e a grade desejados em suas respectivas listas suspensas em Configuração do instrumento na guia Aquisição .
   2. Retorne ao botão vermelho AC na parte inferior da tela e clique em Laser / grade atual e permita que a rotina de calibração seja executada.
6. Se estiver utilizando todos os lasers e grades, basta selecionar Todos os lasers e grades e permitir que o sistema funcione.
7. Se estiver utilizando mais de um laser e/ou grade, selecione os lasers/grades personalizados e selecione todas as configurações desejadas. Em seguida, permita que a calibração seja executada.
8. Selecione a objetiva de longa distância de trabalho (LWD) de 20x na torre do instrumento e dentro do software em Configurações do instrumento na guia Aquisição .
9. Se esta objetiva não estiver disponível, use uma objetiva alternativa de baixa ampliação (por exemplo, 5x ou 10x) com uma distância de trabalho que acomode a altura do disco do filtro.
   NOTA: Comece com uma objetiva de ampliação mais baixa para facilitar a navegação inicial pela nanomembrana do disco filtrante.
10. Coloque o disco do filtro na platina do microscópio de forma que fique dentro do caminho óptico.
11. Clique em Aquisição de vídeo na faixa superior para ativar a óptica de visualização.
12. Utilize as rodas de foco grosseiro e fino no instrumento para colocar a nanomembrana do disco do filtro em foco.
13. Aproximadamente eleve os poros ao quadrado com as linhas do cursor de ponto na tela do computador.
14. Gire suavemente o disco do filtro na platina para obter esse alinhamento quadrado ou utilize uma lâmina de alinhamento específica para uso do disco do filtro em uma platina de microscópio.
15. Na guia Aquisição no canto superior direito, certifique-se de que o modo iluminador selecionado seja Campo escuro para obter melhores resultados.
16. Para adquirir uma imagem unida, navegue até a guia Vídeo na faixa de opções Guias de dados.
17. Navegue até o primeiro campo de visão desejado, clique no botão Mosaico no canto superior direito da janela de vídeo e adicione ao mapa. Navegue até o canto externo oposto da área desejada com o joystick do instrumento e adicione ao mapa.
18. Execute a aquisição do mosaico com o ViewSharp para garantir que todas as áreas estejam devidamente focadas na imagem final.
    NOTA: As objetivas de ampliação mais baixa levarão menos tempo para a aquisição do mosaico de imagens, enquanto as objetivas de ampliação mais alta levarão mais tempo.
19. Depois que o mosaico de imagens for criado, clique com o botão direito do mouse na imagem e clique em Enviar para o ParticleFinder.
20. Navegue até a guia ParticleFinder na faixa de opções superior direita para interagir com as configurações de limite.
21. Para garantir que as partículas adequadas sejam selecionadas, clique com o botão esquerdo do mouse em Imagem na guia de dados do ParticleFinder para marcar as caixas Centro, Partícula e Transparência . Defina o controle deslizante de transparência como 50% e o tamanho do pixel de Centro como 2px.
    NOTA: A seleção de centro colocará um ponto no centro de cada partícula e a seleção de partículas colocará uma sobreposição sobre cada área determinada como uma partícula, com 50% de transparência. Essas configurações localizarão cada partícula e definirão as bordas de cada partícula.
22. Se necessário, edite os parâmetros de limite de partículas e seleção de morfologia/tamanho na guia ParticleFinder no lado direito do programa para garantir que todas as partículas e seus parâmetros de tamanho/forma sejam identificados corretamente. Consulte a Tabela Suplementar S2 para obter um exemplo de como os parâmetros morfológicos podem ser aplicados.
    1. Se a detecção automática de partículas não for suficiente, alterne para manual e ajuste incrementalmente os valores de limite até que a maioria dos objetos corretos seja identificada como partículas.
    2. Se a morfologia das partículas detectadas precisar de mais refinamento, marque a caixa ao lado de Aplicar filtros morfológicos. Selecione os parâmetros adequados e suas intensidades nos menus suspensos resultantes.
       NOTA: A ordem em que os parâmetros são selecionados pode afetar a saída.
23. Se o tamanho, a forma ou outras qualidades morfológicas das partículas forem fatores críticos, marque a caixa ao lado de Aplicar partículas pré-filtradas e selecione e edite os parâmetros conforme necessário.
24. Depois que as partículas forem identificadas e suas formas/bordas selecionadas forem aceitáveis, navegue pela lista de visualização rolável de imagens de partículas na seção Resultados . Selecione a(s) partícula(s) de interesse clicando na imagem de partícula associada.
25. Ative a visualização ao vivo com o botão da câmera de vídeo na parte superior da tela.
26. Alterne para a objetiva LWD de 50x clicando no número de ampliação e selecionando a objetiva correspondente no menu suspenso, dentro do aplicativo na faixa de opções inferior.
27. Traga a(s) partícula(s) de volta ao foco com o botão de ajuste fino, se necessário.
28. Capture imagens de partículas individuais para serem analisadas com espectroscopia Raman e salve as imagens como arquivos separados com nomes apropriados.
29. Certifique-se de que a área desejada da partícula a ser analisada com espectroscopia Raman esteja posicionada corretamente sob o local do feixe de laser.
30. Depois que a área adequada da partícula for selecionada para análise, pressione o botão STOP ALL na parte superior da janela para desativar a óptica de visualização.
31. Defina o laser para 532 nm, com 1% de potência para partículas não coradas e com 785 nm ou 830 nm para partículas coradas com fluorescência.
32. Defina o tempo de aquisição para 10 s e as acumulações para 5.
33. Selecione a guia Espectros no menu de guias de dados e pressione o botão play para iniciar o Real Time Display (RTD).
    NOTA: Utilize as informações obtidas durante o RTD para otimizar as configurações.
34. Quando estiver satisfeito com as configurações e os resultados, clique em STOP ALL para interromper o RTD.
35. A aquisição final agora pode ser coletada pressionando o botão circular Spectrum Aquisition ao lado do botão RTD.
36. Salve os espectros coletados como arquivos separados com nomes apropriados.
37. Repita as etapas 5.28-5.36. para cada partícula de interesse.
38. Quando terminar com a amostra, remova o disco de filtro e retorne a objetiva para o 20X LWD manualmente no osciloscópio e no software.
39. Repita as etapas 5.10-5.37 para nova(s) amostra(s).

6. Identificação espectral

1. Se um banco de dados espectral Raman comprado ou autoconstruído não estiver disponível, navegue até a biblioteca de espectroscopia de código aberto em: https://www.openanalysis.org/openspecy/
   NOTA: OpenSpecy é um banco de dados de espectroscopia Raman e IR de código aberto que inclui 636 espectros de três bibliotecas diferentes de 276 polímeros e materiais aplicáveis à identificação de MPs e fibras ambientais²¹. Dados espectrais pré e pós-processados são igualmente viáveis para uso com este recurso.
2. Salve os espectros Raman como arquivos .csv individuais.
   1. Rotule a coluna A como número de onda seguido pelos números de onda dos espectros, e a coluna B deve ser rotulada como Intensidade seguida pelos valores de intensidade de pico por número de onda.
3. Abra os espectros arrastando e soltando o arquivo .csv na barra de navegação no canto superior esquerdo.
4. Ative Pré-processamento e identificação.
5. Em Pré-processamento, ative Threshold Signal Noise, Min-Max Normalize, Smoothing/Derivative, Conform Wavenumbers e Baseline Correction.
   NOTA: As configurações específicas podem ser ajustadas dependendo das características individuais dos espectros que estão sendo analisados.
6. Em Identificação, selecione Raman como o tipo de espectro e Derivada como a Transformação da biblioteca.
   NOTA: Esta biblioteca também pode ser usada para espectroscopia IR. A janela de análise mostrará um espectro branco, o espectro carregado para análise, e um espectro vermelho, a correspondência de identificação suspeita.
7. Com qualquer espectro que não retorne uma correspondência r > 0,70, ou correlações razoáveis de forma de pico, utilize os 5 principais resultados sugeridos como um local para começar a pesquisar possíveis correspondências, conforme preferido.
8. Certifique-se de que os valores de pico medidos estejam dentro de ±10 números de onda de um pico correspondente nos espectros de referência selecionados antes de confirmar uma correspondência para esse pico.
9. Registre as correlações espectrais, seus valores de correlação e o banco de dados do qual a correspondência suspeita se origina.
10. Baixe arquivos de acordo com as necessidades individuais.

7. Microscopia eletrônica de varredura

NOTA: Se não for revestido de metal o disco do filtro antes da análise de SEM, pule para a seção 7.2.

1. Revestimento metálico de amostras para SEM
   1. Monte o disco do filtro em um stub SEM de aço usando fita de carbono.
   2. Insira em um pulverizador e bombeie a câmara para 50 mTorr.
   3. Abra a válvula de isolamento Ar (argônio) de pulverização catódica.
   4. Purgue o sistema introduzindo Ar na câmara por meio de válvula de agulha a uma pressão de 300 mTorr e, em seguida, evacue a câmara até 50 mTorr. Repita 3x.
   5. Ajuste a pressão final para 100 mTorr via válvula de agulha.
   6. Usando um alvo de Au, deposite Au no disco do filtro por meio de pulverização catódica.
      NOTA: Outras fontes alvo (por exemplo, Pt, Ir, Si, etc.) podem ser usadas alternativamente em vez de Au; A corrente de 20 mA produz 0,1 Angstroms/s de deposição a 100 mTorr.
   7. Ventile o sistema e remova o disco do filtro. Mantenha o disco do filtro aderido ao topo de aço inoxidável.
2. Captura de imagem SEM
   1. Fixe o stub ao suporte Zeiss Auriga de vários estágios com um parafuso de fixação.
   2. Ligue o SEM e os computadores que o executam e permita que cada um seja iniciado.
   3. Abra o software conectado ao SEM.
   4. Verifique se o sistema está sob vácuo (5e-6 Torr).
   5. Ventile a trava de carga pressionando Ventilar no corpo principal da câmara de trava de carga e abra a trava de carga.
   6. Monte o suporte de vários estágios no gabarito de inserção revestido de teflon e aperte o braço de transferência usando a placa de parafuso anexada.
   7. Feche a trava de carga e bombeie a trava de carga pressionando Armazenar no corpo principal da câmara de trava de carga.
      NOTA: A conclusão ocorre quando as luzes verdes param de piscar no botão Armazenar .
   8. Carregue o suporte multistage no palco da câmara de observação principal abrindo a porta de transferência.
   9. Pressione Transferir no corpo principal da trava de carga. O portão cairá e exporá a câmara interna.
   10. Insira o braço de bloqueio de carga (aparafusado no suporte multiestágio) e fixe o suporte multiestágio ao palco.
   11. Desaperte o braço de transferência de bloqueio de carga e retraia o braço totalmente para que ele resida no bloqueio de carga.
   12. Feche o portão de transferência pressionando Transferir.
   13. Abra a válvula de isolamento pressionando EHT no canto inferior direito do software.
   14. Ajuste a distância de trabalho para 5 mm na zona de dados do software e a tensão de aceleração para 20 kV.
   15. Localize a membrana do disco do filtro usando os joysticks XY e Z.
   16. Levante o palco usando o joystick Z até que a imagem entre em foco.
   17. Corrija o astigmatismo ajustando os botões do estigmatizador XY e a roda de foco no console central.
   18. Partículas de amostra de imagem na ampliação desejada ajustando a roda de ampliação no console central, capturando imagens com resolução de 2.048 x 1.536 no formato tiff de 8 ou 16 bits.
3. Análise de partículas EDX
   1. Desligue o ChamberScope CCD na área de trabalho do computador SEM.
      NOTA: Se esta etapa não for concluída, o detector EDX ficará sobrecarregado com o sinal e nenhum dado será registrado.
   2. Resfrie o detector EDX abrindo o software APEX EDX no computador EDX, ligando o detector no menu do canto superior direito.
   3. Capture uma imagem SEM de baixa resolução que possa ser usada para mapeamento, clicando em Capturar imagem.
   4. Abra o menu da guia Mapeamento na parte superior da tela do software.
   5. Em Configurações, ajuste a resolução (256 x 256) e o tempo de permanência do pixel (0,16 μs) e o número do quadro (32-64) para fornecer um tempo estimado de captura que deve ser de ~ 5 minutos de duração.
   6. Clique em Criar mapa no canto superior esquerdo do menu.
   7. Selecione Confirmar visualização do elemento para ajustar manualmente a pesquisa do elemento ou confie nos picos identificados automaticamente do software.
   8. Gere um relatório usando a função AutoReport na seção superior direita do software de mapeamento após a conclusão.

Results

Blanks de processo e contaminação de fundo
Um resultado em branco aceitável é aquele que não contém partículas ou contém tão poucas partículas que a contaminação de fundo (ou seja, processo) (se houver) não tem uma alta probabilidade de confundir ou interromper os resultados do experimento. Um resultado em branco abaixo do ideal é aquele que contém muitas partículas que as partículas de interesse serão difíceis de distinguir da contaminação de fundo.

O nível aceitável de contaminação do processo deve ser igual ou o mais próximo possível de zero, mas se zero não puder ser alcançado, a consistência no número de partículas de fundo observadas é fundamental. Execute várias amostras em branco para determinar a consistência dos resultados. Diligência nos protocolos de controle de qualidade (consulte a Seção 1), mitigação de contaminação e condições ambientais adequadas durante o processamento são fundamentais para manter baixos níveis de contaminação de fundo. Os resultados da contaminação de fundo e a aceitabilidade também podem depender muito do corte das nanomembranas que estão sendo usadas e da limpeza geral das condições de laboratório. Leve em consideração que, ao analisar partículas menores com membranas de corte mais baixas (por exemplo, < 8 μm), a abundância relativa das partículas de interesse e contaminantes de fundo de tamanho semelhante aumentarão exponencialmente, necessitando de níveis mais altos de rigor no controle de qualidade²². Embora qualquer nível de contaminação não seja aceitável, desde que as condições sejam rigidamente controladas e um alto grau de consistência seja alcançado, boas análises de microplásticos ambientais ou análises de interesse ainda podem ser realizadas.

Filtragem de amostras
Uma filtragem de amostra ideal é necessária para gerar uma análise multimodal fiel, conforme mostrado com a cascata de dados de exemplo na Figura 3. Essa filtração da amostra resultará em partículas bem dispersas na superfície da nanomembrana (por exemplo, com aproximadamente um terço da cobertura da área da superfície da membrana). Partículas mal dispersas, como o caso da agregação de partículas (grandes aglomerados de partículas sobrepostas), confundirão os métodos de contagem de partículas manuais e automatizados, pois as partículas sobrepostas não são facilmente diferenciadas com confiança. Esses dados geralmente são excluídos da análise, o que pode levar à perda de informações valiosas de interesse. Partículas bem dispersas, como mostrado na Figura 4A, B, garantem que quaisquer análises espectroscópicas ou de quantificação não sejam complicadas por partículas empilhadas ou sobrepostas de composições variadas, o que pode retornar resultados mais difíceis de interpretar, identificar e quantificar com precisão.

Coloração de Vermelho Nilo e Azul de Tripano
Imagens representativas de instâncias ideais de coloração de partículas fluorescentes são mostradas na Figura 3B em um disco de filtro SiN de corte de 20 μm. O enxágue insuficiente da coloração NR ou TB da superfície da nanomembrana pode criar resultados falsos positivos. As partículas residuais compostas por manchas retidas na superfície da membrana devido ao enxágue insuficiente podem ser falsamente interpretadas como partículas coradas. Um sinal de que ocorreu enxágue insuficiente é se áreas da nanomembrana sem partículas ou filmes/resíduos residuais detectáveis da amostra filtrada estiverem fluorescentes durante a observação, conforme mostrado na Figura 5A. Após a imagem, desde que o disco do filtro tenha sido mantido em condições limpas, um novo enxágue pode ser realizado colocando o disco de filtro de nanomembrana individual de volta no aparelho de filtração a vácuo (sem as juntas), ligando o vácuo e filtrando outro volume de IPA 99% ultrapuro (para NR) ou água ultrapura (para TB) na nanomembrana do disco do filtro. Registre o volume total de meios de enxágue adicionais usados. Para obter melhores resultados, tire imagens de microscopia de toda a superfície da nanomembrana antes de realizar um novo enxágue para levar em conta qualquer contaminação potencialmente incorrida pela etapa de reenxágue.

Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman realizada em SiN não revestido pode produzir um pico proeminente dependendo do comprimento de onda do laser, e esse pico pode mascarar sinais de baixa abundância aproximadamente dentro da região do número de onda de 520 ^{cm-1 23}. Se os espectros Raman de interesse estiverem suficientemente separados do pico de fundo de silício ou nitreto de silício, o uso de discos de filtro de SiN não revestidos deve produzir resultados adequados de espectroscopia Raman. Neste relatório, os pipelines B e C usaram discos de filtro Au-SiN. O revestimento de ouro de Au-SiN mascara o pico de Si inerente, permitindo que espectros de baixa abundância sejam coletados de forma mais confiável perto ou em números de onda de 520 ^cm-1 . Além disso, o Au-SiN pode ser usado com espectroscopia de infravermelho se Raman não estiver disponível. Sempre comece com as configurações de potência mais baixas (ou seja, intensidade do laser) no instrumento e aumente gradualmente, pois algumas partículas de interesse podem ser frágeis, como partículas oxidadas, e podem ser danificadas ou destruídas pelo laser.

Ao analisar partículas escolhidas com espectroscopia Raman, determinar a confiabilidade de um espectro retornado é crucial. Algumas partículas podem fluorescer automaticamente, e essa fluorescência adicionará ruído à medição espectral que pode mascarar ou complicar a interpretação do sinal de partículas. Esse ruído assumirá a forma de uma banda de alta intensidade que abrange uma ampla gama de números de onda, confundindo os dados subjacentes. Os espectros adequados, demonstrados na Figura 3C e na Figura 4C, D, mesmo antes da correção da linha de base, terão picos claramente definidos em intervalos mais curtos de números de onda. Se não surgirem picos que sejam pelo menos três vezes maiores do que qualquer um dos sinais circundantes, é provável que os espectros coletados sejam ruído de fundo ou que diferentes configurações do instrumento sejam necessárias para analisar a partícula em questão. Certifique-se de que o comprimento de onda do laser adequado seja selecionado para cada amostra. Lasers de comprimento de onda mais baixo, como um laser de 532 nm, não conseguem lidar suficientemente com o sinal gerado pela fluorescência. Um laser de comprimento de onda mais alto, como um laser de 782 nm ou 830 nm, pode ignorar suficientemente a fluorescência suficiente para retornar um espectro. Dependendo do tipo de amostra, diferentes lasers serão adequados para diferentes tipos de partículas e, se possível, podem ser trocados durante a coleta de dados em um único disco de filtro.

Para determinar a composição das partículas, seus espectros coletados são comparados aos de um banco de dados de espectros de referência. A identificação confiável de um determinado espectro de partículas produzirá um coeficiente de Pearson (r) maior que 70% (r > 0,70). Os dados Raman abaixo do ideal são mostrados na Figura 5B, onde estão < 0,70. Os resultados da identificação de MP são úteis para determinar fontes potenciais de poluição por MP. Para exibir os resultados da identificação de partículas, uma imagem e espectros da partícula analisada podem ser mostrados como na Figura 3C e na Figura 4C.

Microscopia eletrônica de varredura
Os discos filtrantes SiN e Au-SiN são compatíveis com SEM imediatamente após a captura de partículas por filtração. Se os discos de filtro de SiN não forem revestidos com Au ou Pt antes do MEV e após a captura de partículas, algumas partículas podem ser mais facilmente "carregadas" pelo feixe de ionização do MEV, o que pode fazer com que a partícula brilhe ou pareça muito brilhante nas imagens. Esse brilho/brilho pode causar problemas de visualização devido ao contraste ruim, como mascarar a morfologia da partícula. Para mitigar, realize microscopia óptica / fluorescência e espectroscopia Raman antes do SEM para marcar quaisquer partículas pequenas ou difíceis de analisar de interesse para análise posterior de SEM/EDX, depois revestir a nanomembrana com Au ou Pt conforme descrito na seção 7 do protocolo e realizar SEM/EDX.

O revestimento de SiN ou Au-SiN com Au ou Pt após a captura de partículas e antes da análise de MEV ajuda na prevenção desse efeito de carga durante a geração de imagens, pois as partículas agora não são mais suscetíveis à ionização sob a camada de metal descartada. Este revestimento melhora o contraste e a resolução, de modo que uma maior compreensão morfológica de uma determinada partícula pode ser obtida, como visto na Figura 3D (fibra vs fragmento) ou morfologias de superfície, como poços e fissuras em partículas oxidadas. As partículas de revestimento metálico antes da análise de SEM impedirão permanentemente que sejam analisadas com espectroscopia ou imagem de fluorescência, tornando apenas as análises de SEM/EDX ainda possíveis. O revestimento das partículas e a execução do SEM/EDX, portanto, devem ser as etapas finais em qualquer processo, se pretendido.

As medições EDX podem ser realizadas em partículas capturadas antes e depois do revestimento de metal. O EDX pode revelar a composição elementar específica de uma determinada partícula ou área, que combina bem com quaisquer partículas menores que o limite de tamanho de detecção para análise Raman, ou composições elementares que podem ser difíceis de analisar com certos comprimentos de onda de laser Raman, como metal, ligas, partículas saturadas de água e partículas que fluorescem fortemente quando expostas ao(s) feixe(s) de laser Raman disponível(is) para uso. Neste estudo, as partículas foram revestidas com uma camada de 6 nm de espessura de Au. A imagem SEM foi feita entre 200x-3.000x de ampliação com uma potência de feixe de 20 kV e distância focal de 5 mm. As respectivas imagens SEM das partículas selecionadas são mostradas na Figura 3D.

Os resultados representativos do EDX são mostrados na Figura 3F. Elementos detectados com um peso percentual inferior a 1% podem ser considerados traços ou não confiáveis, dependendo da sensibilidade do instrumento; portanto, definimos um limite de 1%. Se as partículas selecionadas para análise EDX foram revestidas, uma quantidade detectável do revestimento estará presente no relatório de dados elementares. Se estiver usando discos de filtro de SiN não revestidos, sinais de Si e N serão observados, conforme mostrado na Figura 3F. A maioria das partículas de polímero sintético também contém os elementos C, H e O, infelizmente, já que a maioria das partículas não sintéticas de fontes biológicas também são feitas dos mesmos elementos, mas as partículas não sintéticas também podem incluir elementos como S, como no caso das proteínas. Essa semelhança na composição é o motivo pelo qual o método de contracoloração com Vermelho do Nilo e Azul de Tripano é útil para diferenciar entre partículas sintéticas e não sintéticas, mas não é uma ferramenta de identificação exaustiva, pois o Vermelho do Nilo também é capaz de corar partículas não sintéticas em certos casos. Parâmetros de análise adicionais, como os sugeridos acima, devem ser utilizados em conjunto com quaisquer procedimentos de coloração para confirmar os resultados. Além disso, o EDX pode ser uma ferramenta útil para identificar potencialmente partículas que estão fora do limite de tamanho de detecção para espectroscopia Raman (ou seja, nanoplásticos medindo < 1 μm).

Figura 1: Tubulações SNAP. (A) Esquemas de tubulações SNAP, caracterizando as mesmas partículas na mesma nanomembrana por meio de uma série de diferentes técnicas analíticas. Oleoduto A) demonstra 1) As partículas de interesse capturadas de amostras de água potável por meio de filtração a vácuo são 2) coradas com Vermelho do Nilo e Azul de Tripano para diferenciação de partículas poliméricas sintéticas versus não sintéticas, respectivamente, seguidas por 3) identificação de partículas via espectroscopia Raman e 4) SEM/EDX para caracterizar a morfologia das partículas e identificação elementar. Oleoduto B) demonstra 1) Captura de partículas em Au-SiN seguida de 2) Espectroscopia Raman. Oleoduto C) demonstra 1) Captura de partículas em Au-SiN seguida de MEV / EDX. (B) Esquema do disco do filtro e da junta de silicone na configuração de filtração no aparelho de vácuo, representando a filtração sequencial através de uma nanomembrana MPSN de 20 μm e, em seguida, MSSN de 8,0 μm, separada por juntas de silicone. Abreviaturas: SNAP = Pipeline de Análise de Nanomembranas de Silício; MEV = microscopia eletrônica de varredura; EDX = espectroscopia de raios X por dispersão de energia; MPSN = nitreto de silício microporoso. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fontes de coleta de amostras de água potável. Um mapa regional publicado pela Autoridade de Água do Condado de Monroe descrevendo os locais de onde cada uma das quatro amostras de água potável foi coletada na região da Grande Rochester, NY. As amostras se originaram de diferentes fontes de água superficial: Lago Ontário (azul), Lago Hemlock (verde), Lago Hemlock e Lago Ontário (amarelo) e Lago Canandaigua (roxo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Resumo das análises do SNAP Pipeline A realizadas em partículas capturadas de amostras de água potável. (A) Imagem em escala de cinza de partículas capturadas de uma amostra representativa de água potável em um corte de 20 μm SiN. (B) Imagem de sobreposição de cor falsa de partículas contracoradas para representar Nile Red (partículas vermelhas de cor falsa) e Trypan Blue (partículas azuis de cor falsa). (C) Espectros Raman de referência (vermelho) e coletados (branco) identificando uma partícula corada com vermelho do Nilo como polietileno com valor r de Pearson de 0,97, com imagem representativa da partícula analisada. (D) Micrografia eletrônica de dois tipos diferentes de partículas demonstrando análise da morfologia de partículas de uma fibra (painel superior) e fragmento (painel inferior), ambos assumindo a coloração de Azul de Tripano. (E) Quantificação de partículas coradas com vermelho do Nilo capturadas sequencialmente em nanomembranas de corte de 20 μm e 8 μm. (F) Análise elementar EDX resumida de um fragmento selecionado aleatoriamente e detalhes analíticos dos resultados com imagem SEM representativa da partícula analisada. Abreviaturas: SNAP = Pipeline de Análise de Nanomembranas de Silício; MEV = microscopia eletrônica de varredura; EDX = espectroscopia de raios X por dispersão de energia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Resumo das análises do SNAP Pipeline B realizadas em partículas capturadas de amostras de água potável. Análise espectral Raman de três partículas aleatórias de quatro amostras de água potável doméstica capturadas em discos de filtro de Au-SiN MPSN de 20 μm e MSSN de 8,0 μm. Imagens representativas de campo escuro da área total da membrana ativa para os 20 μm e 8 μm Au-SiN são mostradas respectivamente em A e B. As partículas aparecem amarelas neste modo de imagem enquanto o fundo permanece escuro, facilitando a contagem automatizada de partículas. Espectros Raman representativos de partículas sintéticas e não sintéticas em (C) 20 μm e (D) 8,0 μm Au-SiN. As contagens totais de partículas para (E) 20 μm e (F) 8,0 μm Au-SiN são agrupadas por faixas de tamanho determinadas pelo software automatizado de localização de partículas. Abreviaturas: SNAP = Pipeline de Análise de Nanomembranas de Silício; MEV = microscopia eletrônica de varredura; EDX = espectroscopia de raios X por dispersão de energia; MPSN = nitreto de silício microporoso; MSSN = microfenda Nitreto de silício. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Resultados de imagem de fluorescência abaixo do ideal e espectroscopia Raman. (A) Uma imagem de fluorescência abaixo do ideal de partículas coradas (painel esquerdo), onde a membrana reteve a coloração de Vermelho do Nilo, provavelmente por falta de enxágue. Duas partículas, uma fibra corada com azul de tripano e um fragmento corado com vermelho do Nilo (painel direito), foram selecionadas para espectroscopia Raman. (B) Resultados de espectroscopia Raman abaixo do ideal em que o coeficiente de Pearson (r) é inferior a 70% (r < 0,70). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela Suplementar S1: Propriedades das nanomembranas de silício dentro dos discos filtrantes. Nesta tabela estão representadas as propriedades das membranas dentro dos discos filtrantes de SiN, incluindo o tamanho mínimo dos poros, a porcentagem de porosidade, a espessura das membranas com e sem revestimento de Au, a área ativa da membrana e a permeabilidade do gás através da membrana com pressão positiva aplicada a uma pressão constante definida. Corte (ou seja, tamanho dos poros), porosidade, espessura e área da membrana determinados pela medição de recursos em imagens SEM. Os dados de permeabilidade ao gás são relatados como média ± desvio padrão (n = 10) para pressão positiva de N 2 aplicada a 103,42 kPa. Abreviaturas: Au = Ouro; Si_x N_y = Nitreto de silício não estequiométrico. Clique aqui para baixar este arquivo.

Tabela Suplementar S2: Contagens e parâmetros de partículas do ParticleFinder. Mosaicos de imagens de toda a área da membrana foram retirados de cada amostra, e cada mosaico de imagens foi analisado para coletar contagens totais de partículas. Nesta tabela estão representados os parâmetros usados e em que ordem determinar a contagem total de partículas para cada imagem de amostra e a contagem de partículas em determinadas frações de tamanho. Os parâmetros variam de amostra para amostra, dado o tipo, quantidade e forma das partículas, bem como a refletividade específica de cada membrana durante a imagem. Os dados desta tabela são visualizados na Figura 4. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

A mitigação da poluição por microplásticos é um assunto crescente de preocupação; e o primeiro passo da mitigação é identificar a presença de contaminação. Um método simplificado de captura e análise imediata é crucial para economizar tempo dos investigadores e preservar métricas de amostras confidenciais. Este relatório descreve fluxos de trabalho flexíveis com base em variações de nossos métodos SNAP desenvolvidos para a análise de tais MPs em amostras líquidas, utilizando um único substrato para todas as análises realizadas. A amostra deve ser filtrada a vácuo de modo que as partículas sejam capturadas e isoladas em uma nanomembrana de silício alojada dentro de um disco de filtro. A mitigação suficiente da contaminação de fundo é fundamental para resultados significativos. Quaisquer partículas contaminantes na seringa dispensadora ou no funil de vácuo de vidro durante a filtração podem contaminar a amostra e ser capturadas simultaneamente, portanto, seguir diligentemente os protocolos de controle de qualidade da Seção 1 é crucial para resultados precisos. Recomenda-se a realização de controlos exclusivamente com meios de comunicação para informar os investigadores sobre a contaminação de fundo específica de processos individuais e condições laboratoriais. O protocolo aqui descrito baseia-se na filtração a vácuo de uma amostra líquida, bem como na captura e isolamento de partículas da amostra em dois discos de filtro de SiN de corte diferentes. Para todos os pipelines, a captura e o isolamento de partículas devem preceder outros métodos, mas todos os outros métodos de identificação podem ser feitos na ordem mais adequada para o investigador.

Dois microscópios fluorescentes foram utilizados para este estudo para demonstrar a repetibilidade dos resultados entre os instrumentos. As etapas instrucionais detalham especificamente o uso de uma Olympus BX61 para microscopia fluorescente devido à predominância de seu uso e foi operada de acordo com as instruções do instrumento utilizando campo claro para imagens em escala de cinza, canal TRITC (Ex. ~ 543 nm; Eme. ~ 593 nm) para imagens de partículas coradas com NR e canal Cy5 (Ex. ~ 649 nm; Eme. ~ 667 nm) para imagens de partículas coradas com TB, conforme aplicável. Para exibir os resultados da coloração, recomendamos a construção de uma sobreposição das imagens do canal (usamos FIJI/ImageJ para processamento de imagem, posteriormente chamada de plataforma de análise de imagem), com resolução de 2.048 x 2.040 pixels e profundidade de 16 bits. Imagens inteiras de nanomembranas podem ser exibidas como na Figura 4A, B ou como regiões selecionadas de interesse, como mostrado na Figura 3A, B.

O vermelho do Nilo é comumente usado para corar MPs de polímeros sintéticos, mas pode corar polímeros não sintéticos de fontes biológicas devido à sua natureza lipofílica e hidrofóbica, potencialmente introduzindo falsos positivos que distorcem os resultados da quantificação de MP 24,25,26. Uma etapa de contracoloração com azul de tripano, conforme descrito na seção 3 do protocolo, é recomendada para auxiliar na diferenciação de eventos falso-positivos, mas não é uma solução exaustiva e deve ser combinada com métricas de análise adicionais para confirmar os resultados. A fluorescência de partículas em vermelho do Nilo é uma preocupação com a análise de espectroscopia Raman, pois pode aumentar significativamente o sinal de fundo. Neste estudo, no entanto, contracoloramos polímeros com Vermelho do Nilo e Azul de Tripano antes da espectroscopia Raman com um laser de 830 nm, e pouco ruído foi observado, conforme mostrado na Figura 3.

Alguns comprimentos de onda de lasers adequados para espectroscopia Raman não são capazes de ignorar a fluorescência de partículas coradas, como um laser de 532 nm e, portanto, podem introduzir dificuldade significativa em estimar corretamente a composição da partícula de interesse. O revestimento metálico das partículas após a captura é útil para aumentar o contraste durante a imagem SEM, mas é incompatível com qualquer análise espectroscópica ou fluorescente subsequente. Anote todas as medições desejadas antes da configuração experimental para garantir que o fluxo do processo e os tipos de revestimento sejam levados em consideração adequadamente. Os discos de filtro Au-SiN podem ser utilizados para todas as análises mencionadas onde a microscopia de transmissão não é crucial para o fluxo de trabalho, ou quando a espectroscopia Raman ou IR é usada.

Os métodos mostrados aqui, bem como as nanomembranas usadas para capturar e isolar partículas de interesse, podem ser modificados para atender às necessidades individuais dos investigadores. As nanomembranas são adequadas para uma série de análises espectroscópicas, e o investigador pode trocar o meio filtrado por outro meio de amostra de interesse, incluindo, mas não se limitando a tecidos animais digeridos²⁷, produtos farmacêuticos injetáveis e amostras de óleo. Dois instrumentos de espectroscopia Raman foram utilizados para este estudo, e as etapas instrucionais detalham especificamente o uso de um instrumento Horiba XploRA Plus Raman, que coletou e processou todos os dados mostrados na Figura 4. Também é importante reconhecer o limite de tamanho de detecção para cada microscópio Raman, para garantir que as partículas de interesse possam ser analisadas adequadamente com o tamanho do ponto dos lasers do instrumento. Para exibir os resultados da identificação de partículas com Raman, os espectros de referência e amostra, além de uma imagem da partícula analisada, podem ser mostrados como na Figura 3C e na Figura 4C.

A seção 6 do protocolo detalha as instruções para identificação de partículas usando uma biblioteca espectral de código aberto. A captura planarizada de partículas em uma membrana uniformemente plana, bem como a matriz regular de poros da membrana, permite imagens previsíveis e automatizadas. Tanto as espessuras de 400 nm ou 1.000 nm do SiN quanto sua composição de nitreto de silício conferem-lhes excelente transparência óptica, mas também podem retornar um pico intenso de silício em alguns parâmetros de instrumentos espectroscópicos. Deve-se ter cuidado ao utilizar SiN nu e não revestido de metal com análise Raman. O pico de Si pode funcionar como um sinal de calibração, mas a intensidade do pico também pode mascarar os sinais de espectros de baixa intensidade na mesma região do número de onda que o sinal do Si. Tais picos de Si não foram observados quando se utilizou o laser de 830 nm neste estudo.

A natureza ultrafina do SiN (400 nm ou 1.000 nm de espessura) e Au-SiN (520 nm ou 1.120 nm de espessura) usados aqui os dotou de suas excelentes propriedades de filtragem, ópticas e espectroscópicas. No entanto, essas membranas devem ser protegidas contra danos físicos, como pressão diferencial excessiva (ou seja, ≥-206 kPa), toque direto por pinças ou dedos ou por colocação inadequada da junta. O disco do filtro que abriga as membranas as protege e facilita o manuseio em condições normais de uso. Ao manipular os discos de filtro, toque apenas no anel externo preto e nunca na área da membrana ativa. Embora não seja relatada quantitativamente aqui, a coleta de partículas capturadas em uma pequena quantidade de área de superfície da membrana (3 x 3 mm para membranas de corte de 20 μm e 3 x 0,7 x 3 mm para membranas de corte de 8,0 μm, respectivamente) reduz potencialmente o tempo total de análise da amostra, reduzindo o tempo necessário para encontrar e analisar partículas de interesse. Este "fator de concentração" é digno de exploração futura e pode oferecer um benefício exclusivo dos discos de filtro de SiN para os investigadores. Em combinação com suas taxas de fluxo normalizadas por área de superfície mais altas em comparação com outras membranas amplamente utilizadas para caracterização de MP¹⁵, as rotinas automatizadas de imagem de partículas que precisam apenas de imagens de uma área relativamente menor de SiN uniformemente plano e em foco podem reduzir ainda mais os tempos totais de análise. No entanto, quaisquer benefícios relacionados ao fator de concentração hipotético ainda precisam ser demonstrados empiricamente comparando os tempos totais de processamento (da filtração à análise de imagem) em discos de filtro convencionais e de SiN.

Demonstramos heuristicamente a utilidade das variações do SNAP em amostras locais de água da torneira. O protocolo descrito aqui se concentra na captura de MP de fontes de água potável em Rochester, NY. A coleta de amostras ocorreu da seguinte forma: para cada coleta de amostra, pelo menos um litro de água foi passado pela torneira antes do início da coleta. Garrafas de polipropileno novas e lacradas foram levadas para a torneira aberta e abertas diretamente antes da coleta. As garrafas não foram enxaguadas com água potável antes da coleta. Cada amostra foi composta por dois frascos de 500 mL coletados, um após o outro. Cada amostra de água veio do sistema de tubulação de uma família distinta, e o material da tubulação não foi consistente durante toda a amostragem. Variáveis como a quantidade de uso recente de água, tempo de coleta, idade dos canos e idade da casa de onde veio a amostra não puderam ser controladas neste estudo. Este não foi um protocolo de coleta de amostras validado. Cada investigador deve desenvolver e validar seus próprios procedimentos de coleta. No entanto, para uma questão de divulgação completa dos métodos, a descrição acima é incluída. Os discos de filtro permitem análises repetidas no mesmo substrato para vários métodos analíticos. Nenhuma subamostragem ou várias amostras são necessárias fora das réplicas padrão do estudo. Eliminar a necessidade de subamostragem e múltiplas amostras aumenta a confiança na captura de informações sobre alvos de baixa abundância. Além da habilitação de métodos de análise multimodal, os discos de filtro de SiN fornecem uma vantagem distinta sobre outros meios de filtragem análogos devido à qualidade de economia de tempo de uma taxa de filtração mais rápida por unidade^{de área 15}.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L Copo de vidro	Pyrex	1000-1L
1 L Frasco de coleta a vácuo de vidro	Millipore Sigma	Z290459-1EA
100% algodão jaleco	Landau	LA-3172
Funil de filtração de vidro de 100 mL	Advantec	311000	https://www.sterlitech.com/glass-filter-holder-311000.html
álcool isopropílico 99%	Fisher Scientific	A416-20
APEX EDS	EDAX EDX		software usado para realizar análise EDX em partículas capturadas.
Sistema de Pulverização Denton Prep	Denton Vacuum	DESK II: 293618089	Sistema de revestimento Gold
FIJI, plataforma de análise de imagem	ImageJ	V 1.54F	FIJI (FIJI é apenas ImageJ) - uma distribuição de ImageJ
Garrafa de vidro com tampa de rosca	Corning	1395-250
Kimwipes	Kimtech	06-666-11C
LabSpec6	Horiba Scientific		Software Horiba Raman contendo ParticleFinder e ViewSharp
Capa de fluxo laminar	Air Science	VLF-72A
Microscópio	Olympus  / Nikon	BX61 / Ti2e	Qualquer microscópio com fluorescência adequada pode ser utilizado para microscopia óptica.
Filtros MPSN SiN	SiMPore Inc.	FD25-8.0-Au; FD25-8.0-NC FD25-20.0-Au, FD25-20.0-NC
Seringas de 60 mL	Coviden	8881560265
Pó vermelho do Nilo	TCI	N0659
Luvas de nitrilo	Ansell Microflex	19-167-17
OpenSpecy	openanalysis.org		Biblioteca espectral de código aberto
Forno	VWR	1310	Gravity Forno Utilitário de Convecção
P20 Pipeta	Brandtech	705872
Ponta de pipeta	Frascos Premium	GS 151140R
Frita de suporte de ouro	Advantec	311000	Parte do pacote
Instrumento Raman	Horiba	Xplora PLUS
Rolha de borracha	Advantec	311000	Parte do pacote
Instrumento SEM	Ziess	Auriga Auriga	Series, estação de trabalho de viga transversal modular
Juntas de silicone	SiMPore	GASKET-25-R	Juntas PDMS de fundição clara, 0,8 mm de espessura
Rolo de silicone	Sanyue	( ASIN: B07XDTNPS3)	Rolo de silicone -  8 x 5 x 2 polegadas
SmartSEM	Zeiss	V8	SEM software usado para operar o frasco de spray Zeiss Auriga
	Uline	S-7273
Filtros de seringa	Thermo Scientific	CH2225-PES	0.22 µ Filtros de Seringa M Luer Lock, 25 mm
Bomba de seringa	New Era Pump Systems, Inc.	NE-1000	Opcional, mas recomendado
Trypan Blue - 0,4%	Millipore Sigma	T8154-20ML
Pinças	SiMPore	K6TWZR
Bomba de vácuo	Welch	847-676-8800
Tubulação de vácuo	Grainger	ZUSA-HT-4037