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Artigo de método

Detecção rápida de antígeno fecal da infecção por Helicobacter pylori com base na tecnologia de detecção de sanduíche de anticorpo duplo

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DOI:

10.3791/68219

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23 de maio de 2025

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1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste estudo, uma técnica de detecção em sanduíche baseada em anticorpos duplos foi desenvolvida para detecção rápida de antígenos fecais infectados com Helicobacter pylori.

Resumo

O Helicobacter pylori pode ser parasitário na mucosa gástrica, o que pode causar uma série de doenças gastrointestinais após a infecção e está intimamente relacionado à gastrite, úlcera gástrica e câncer gástrico. A alta prevalência da infecção por H. pylori em regiões com infraestrutura médica precária e áreas de saneamento inadequadas continua sendo uma preocupação significativa de saúde pública. Consequentemente, o desenvolvimento de métodos de triagem rápidos, simples e econômicos para a detecção de H. pylori em ambientes com recursos limitados é de suma importância.

Neste estudo, realizamos uma triagem comunitária na vila de Shitan, província de Guangdong, uma área remota e subdesenvolvida caracterizada por uma população permanente de aproximadamente 300 residentes com baixo nível educacional. Empregamos um ensaio sanduíche de anticorpos duplos para a detecção do antígeno fecal de H. pylori , um método escolhido por sua potencial aplicabilidade em ambientes de poucos recursos. Um total de 261 participantes da aldeia foram inscritos e suas amostras fecais foram analisadas usando esta técnica. Para validação comparativa, as mesmas amostras foram submetidas à análise quantitativa de reação em cadeia da polimerase (qPCR). Em comparação com os resultados da qPCR, a sensibilidade e a especificidade da detecção do antígeno H . pylori nas fezes foram de 60,24% e 80,08%. Os resultados demonstraram uma forte concordância entre o método de detecção de antígeno fecal e qPCR (Kappa = 0,630). Este estudo elucidou sistematicamente os princípios, procedimentos, metodologias e aplicações clínicas da detecção de antígenos fecais para infecção por H. pylori , com o objetivo de explorar a tecnologia de sanduíche de anticorpos duplos à base de látex e estabelecer novas estratégias e diretrizes práticas para seu diagnóstico auxiliar.

Introdução

Helicobacter pylori (H. pylori, Hp) é uma bactéria gram-negativa microaerofílica, em forma de espiral,1. Devido à sua capacidade de colonizar e infectar cronicamente o estômago humano2, esse patógeno tem sido identificado como um importante fator etiológico no desenvolvimento do adenocarcinoma gástrico 3,4. Em 2015, ~ 4,4 bilhões de pessoas no mundo sofreram de infecção por H. pylori 5. A prevalência da infecção por H. pylori exibe considerável variação geográfica, com os países em desenvolvimento experimentando taxas significativamente mais altas em comparação com as nações desenvolvidas. Notavelmente, em países de baixa renda e entre certas populações vulneráveis, a taxa de infecção pode chegar a 75%6.

Embora os métodos tradicionais de detecção, como a gastroscopia, sejam precisos, sua aplicação na triagem em larga escala e no acompanhamento de rotina é limitada devido à sua invasividade, alto custo e baixa aceitação do paciente7. Portanto, a busca por métodos diagnósticos não invasivos, simples e rápidos tornou-se uma direção importante da pesquisa em medicina clínica moderna. O principal objetivo de um diagnóstico não invasivo de H. pylori é detectar com precisão, segurança e conveniência se o paciente está infectado com H. pylori sem exame endoscópico. O teste respiratório da uréia (UBT), o teste do antígeno fecal (FAT) de H. pylori8 e o teste sorológico9 são técnicas não invasivas populares.

Dentre estes, o UBT é o procedimento menos intrusivo e mais preciso disponível10. A sensibilidade e a especificidade do UBT são superiores a 95%11. Dentre os métodos diagnósticos não invasivos disponíveis, o UBT tem se mostrado o mais preciso e confiável, como visto em um estudo de validação realizado no Iraque, o UBT pode ser recomendado como primeira escolha devido ao seu maior desempenho em comparação com outros métodos12. No entanto, a UBT também tem suas desvantagens, como seu alto custo e necessidade de análise espectrométrica de massa, o que limita a aplicação em ambientes remotos ou com recursos limitados13.

O desenvolvimento de um método de diagnóstico rápido, não invasivo e econômico para detectar a infecção por H. pylori é extremamente necessário, particularmente em regiões com recursos limitados. Neste estudo, desenvolvemos uma tecnologia de detecção rápida para antígeno fecal de H. pylori baseada na tecnologia de detecção de sanduíche de anticorpo duplo, que pode detectar o antígeno de H. pylori em amostras fecais de forma rápida, eficaz e de baixo custo. Essa tecnologia oferece vantagens significativas, incluindo acessibilidade, não invasividade, facilidade de uso e adaptabilidade a áreas remotas. Nossa hipótese é que o método sanduíche de anticorpos duplos para detectar o antígeno fecal de H. pylori demonstrará sensibilidade e especificidade comparáveis à qPCR, posicionando-o como uma ferramenta viável para o diagnóstico clínico não invasivo.

Detalhamos de forma abrangente os princípios, procedimentos, pontos fortes metodológicos e aplicabilidade clínica da detecção de antígeno fecal para infecção por H. pylori . Para validar sua praticidade, realizamos uma investigação epidemiológica e triagem na vila de Shitan, cidade de Qingyuan, província de Guangdong, China, que é uma área remota e subdesenvolvida com uma população permanente de aproximadamente 400 e escolaridade limitada. Nossos resultados demonstram que a tecnologia de detecção rápida do antígeno de H. pylori em fezes projetada aqui pode ser concluída em 20 minutos. Destaca-se que a detecção rápida do antígeno H . pylori nas fezes é uma ferramenta potencial e promissora para o diagnóstico rápido e confiável da infecção por H. pylori em áreas remotas e atrasadas.

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Protocolo

Este estudo transversal foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Popular da Província de Guangdong (Número de aprovação: KY2024-445-01), e os dados pessoais de todos os sujeitos do estudo foram estritamente confidenciais durante o estudo. Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes dos experimentos. Os residentes da vila de Shitan na cidade de Qingyuan, província de Guangdong, em 2024, foram selecionados como sujeitos da pesquisa, e não houve restrições de idade e sexo. O ensaio sanduíche de anticorpos duplos (um experimento qualitativo) descrito abaixo foi realizado por pessoal médico e técnico profissional de acordo com as instruções. Toda a população permanente da aldeia foi selecionada para este estudo, independentemente de ser saudável ou apresentar sintomas ou quaisquer doenças existentes relacionadas a doenças gastrointestinais.

1. Seleção de pacientes

  1. Exclua pacientes se eles usaram inibidores da bomba de prótons ou bismuto, bloqueadores do receptor H2 ou antibióticos no 1 mês anterior.
  2. Peça a todos os participantes que preencham o questionário anonimamente. O conteúdo do questionário inclui cinco perguntas: Você faz três refeições regularmente? Você bebe álcool? Você conhece o H. pylori? Você acha que é necessário realizar a inspeção do H. pylori ? Você entende as consequências adversas da infecção por H. pylori ?

2. Procedimento para detecção do antígeno de infecção fecal por H. pylori

NOTA: O algoritmo para teste de antígeno fecal de H. pylori foi projetado para garantir a precisão e confiabilidade dos resultados, levando em consideração a simplicidade e a higiene. Todo o processo é dividido em cinco etapas: coleta de amostras, processamento de amostras, armazenamento de amostras, detecção e interpretação de resultados. O fluxograma de trabalho e o diagrama esquemático de detecção de amostras são mostrados na Figura 1 e na Figura 2.

  1. Coleta de amostras
    NOTA: Recipientes específicos para antígenos de H. pylori devem ser usados para coleta de amostras. As amostras não devem ser misturadas com água, urina, desinfetantes e esgoto.
    1. Após a conclusão da defecação, remova a tampa superior do recipiente especial para retirar a haste de amostragem.
    2. Insira a haste de amostragem continuamente em cinco posições diferentes do banquinho para amostragem, certificando-se de que a extremidade rosqueada do bastão de amostragem esteja completamente inserida no banquinho.
    3. Insira a haste de amostragem de volta no tubo reagente após a conclusão da amostragem; O volume da amostra é de ~ 5-50 mg no total.
  2. Processamento de amostras
    1. Agite o tubo reagente de um lado para o outro por ~ 10 s para misturar completamente a amostra de fezes no diluente (ingredientes principais: ácido etilenodiaminotetracético tetrassódico hidratado 0,018 g / mL e cloreto de sódio 0,01 g / mL).
  3. Armazenamento de amostras
    1. Testar as amostras o mais rapidamente possível após a amostragem; armazene-os à temperatura ambiente por no máximo 6 h e em condições refrigeradas (não mais de 72 h a 2-8 °C e não mais de 6 meses congelados a -25 °C a -15 °C), se necessário, para retardar a degradação do antígeno e a atividade microbiana.
      NOTA: As amostras podem ser repetidamente congeladas e descongeladas até 3x, e as amostras refrigeradas e congeladas devem ser devolvidas à temperatura ambiente antes do teste.
  4. Detecção de amostra
    1. Abra a tampa branca na tampa do tubo reagente e mantenha o tubo reagente ereto.
    2. Pressione a tampa até o ponto mais baixo para que a amostra flua no cartão de teste, passando pela área de detecção (T) e área de controle de qualidade (C) revestida com o anticorpo anti-Hp de camundongo.
  5. Interpretação dos resultados
    1. Aguarde 10-20 minutos para que qualquer antígeno de H. pylori na amostra, se ligado ao anticorpo, forme uma reação cromogênica macroscópica na área de detecção. Isso geralmente aparece como uma linha vermelha ou roxa que contrasta com a linha na área de controle de qualidade.
    2. A presença ou ausência da reação de cor e a profundidade da cor estão relacionadas à concentração do antígeno de H. pylori na amostra. Compare as placas de cores para interpretar os resultados com rapidez e precisão (consulte a Figura 3).

3. Extração de DNA

  1. Coloque uma quantidade adequada de fezes em um tubo de ensaio, adicione a solução de PBS e misture bem agitando. Centrifugue a mistura a 12.000 × g por 5-10 min e, em seguida, colete cuidadosamente 200 μL do sobrenadante para extração posterior.
  2. Com base no número de amostras, prepare um número igual de tubos de centrífuga de 1,5 mL. A cada tubo, adicione sequencialmente 20 μL de proteinase K (20 mg / mL), 10 μL de esferas magnéticas, 200 μL do sobrenadante da amostra e 200 μL de tampão de lise A. Misture bem invertendo os tubos e, em seguida, incube em um banho de metal a 55 ° C por 10 min.
  3. Após a conclusão da pirólise, coloque o tubo da centrífuga na estrutura magnética, deixe-o repousar e deixe a adsorção ocorrer por 1 min nos grânulos. Depois que o líquido no tubo estiver completamente clarificado, descarte o sobrenadante e tente evitar perturbar as esferas magnéticas.
  4. Remova os tubos do rack magnético e coloque-os em um rack de tubo de centrífuga de 1.5 mL. Usando uma pipeta, adicione 500 μL de tampão de lavagem E a cada tubo, misture bem por 1 min e, em seguida, retorne os tubos ao rack magnético. Deixe os tubos repousarem por 1 min, descarte o sobrenadante após a clarificação e evite aspirar as esferas magnéticas.
  5. Repita o processo de lavagem adicionando 500 μL de tampão de lavagem W2 a cada tubo. Misture bem por 1 min, coloque os tubos no rack magnético e deixe-os repousar por 1 min. Descarte o sobrenadante cuidadosamente após a clarificação da solução, garantindo que as esferas magnéticas permaneçam intactas.
  6. Adicione 100 μL de eluente, misture e incube a 55 °C por 5 min.
  7. Coloque os tubos no rack magnético e deixe-os repousar por 2 min. Assim que a solução clarear, transfira cuidadosamente o ácido nucléico eluído para um novo tubo de centrífuga, evitando a aspiração dos grânulos magnéticos.
  8. Avaliar a pureza do ADN extraído medindo a absorvância a 260 nm (A260) e a 280 nm (A280). Calcule a proporção A260 / A280 , que idealmente deve ser maior que 1,8 para DNA de alta pureza.

4. qPCR para detecção de H. pylori e resistência a antibióticos

NOTA: Realizamos qPCR para a detecção da infecção por H. pylori por meio da amplificação do gene ureA . Todos os produtos de controle de qualidade negativa são água purificada e estéril. O produto de controle de qualidade positivo no kit de detecção de ácido nucleico de H. pylori são os grânulos padrão de H. pylori inativados (ATCC 43504). Um CT ≤ 30 com uma curva típica em forma de S é considerado positivo.

  1. De acordo com o número de amostras a serem testadas, retire a preparação liofilizada de H. pylori do kit e gire-a rapidamente para manter o pó liofilizado no fundo do tubo.
  2. Abra cuidadosamente a tampa da preparação liofilizada; Colher o ácido nucleico da amostra a ensaiar; adicionar 25 μL do ácido nucleico da amostra à preparação liofilizada; e cubra bem o tubo.
  3. Agite e misture o reagente de PCR uniformemente por 8-10 s e, em seguida, gire-o rapidamente por 3-5 s.
  4. Para cada amostra em uma placa de 32 poços, prepare 25 μL da mistura de reação de PCR (pó liofilizado [contendo a enzima Taq (5 U / μL), trifosfato de desoxirribonucleosídeo (2,5 mmol / L), enzima UNG (2 U / μL), ureA direto (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') e reverso (5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') primers (40 μmol / L)]) e 25 μL (2,5 μg) do DNA extraído.
  5. Execute a placa qPCR de 32 poços na máquina qPCR. Programe o termociclador: 42 °C e 95 °C (ambos para um ciclo) por 2 min cada; 95 °C por 10 s e 65 °C por 45 s (duas etapas são um ciclo) por 10x; 95 °C por 10 s e a 58 °C por 45 s (duas etapas são um ciclo) por 35 ciclos.
  6. Analise os dados usando um software específico para qPCR e deixe o instrumento selecionar automaticamente os limites da linha de base.

5. Análise estatística

  1. Use o teste qui-quadrado para analisar os dados experimentais para avaliar a consistência entre este método e os resultados de qPCR e compare a taxa positiva dessa triagem de tecnologia com os dados de taxa positiva de infecção por H. pylori em uma escala mais ampla (por exemplo, em todo o país). Considere as diferenças estatisticamente significativas em P < 0,05.

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Resultados

Pesquisa por questionário
Um total de 261 participantes foram incluídos no estudo, sendo 144 do sexo feminino e 117 do sexo masculino, com idades variando de 4 a 99 anos. A média de idade dos sujeitos foi de 48,30 ± 17,61 anos. Havia 17 menores (0-17 anos), 202 adultos (18-64 anos) e 42 idosos (>64 anos). Os resultados do questionário são apresentados na Tabela 1. A maioria (90,8%) dos sujeitos achou necessário realizar a triagem de H. pylori .

...

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Discussão

O H. pylori representa uma das infecções bacterianas mais difundidas em todo omundo15. Os resultados do questionário revelaram que 55,2% da população não tinha conhecimento do H. pylori, enquanto 90,8% acreditavam que o rastreamento do H. pylori é necessário. Esses achados ressaltam a importância da implementação de programas de rastreamento de H. pylori em áreas economicamente desfavorecidas e remotas16....

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de extração de DNAJiangsu toupeira biotecnologia co., ltd20230223Nenhum
H. pylori kit de detecção de antígeno fecalHangzhou nuohui tecnologia saudável co., ltd20213401126Nenhum
H. pylori kit de detecção de ácido nucleicoJiangsu toupeira biotecnologia co., ltd20230226Nenhum
PCR quantitativo de fluorescência em tempo realXangai Hongshi tratamento médico technology co., ltd20183221659Nenhum
Soluções de produtos e serviços estatísticosEmpresa IBMNenhumNenhum

Referências

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