Artigo de método

Novo modelo de ilhéu para estudo 3D das interações endoteliais e β celulares: relevância para a triagem de agentes citoprotetores

DOI:

10.3791/68220

⸱

17 de abril de 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Regenerative Nanomedicine (RNM), UMR 1260, INSERM (French National Institute of Health and Medical Research), University of Strasbourg, 2Department of Emergency, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Research Center, CHU de Québec -Laval University, 4Department of Microbiology-Infectiology and Immunology, Faculty of Medicine, Laval University, 5Department of Diabetes and Nutrition Endocrinology, University Hospital of Strasbourg, 6Faculty of Medicine, University of Strasbourg, 7Faculty of Pharmacy, University of Strasbourg

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo fornece um procedimento detalhado para gerar esferoides estáveis de ilhotas pancreáticas murinas, e métodos detalhados para coloração, limpeza e montagem 3D, adaptados ao seu pequeno tamanho.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esse protocolo detalha um método otimizado para a produção de pequenos esferoides estáveis, sua cultura e imagem 3D, para o estudo das interações endotelial e das células β produtoras de insulina em um modelo 3D de ilhotas pancreáticas. Os esferoides de 150-200 μm, espelhando a faixa mais baixa de tamanhos de ilhéus, foram preparados a partir de uma razão selecionada que combina 1 célula endoteliais intra-ilhota (células MS-1) para 20 células secretoras de insulina (β-TC-6). Os desafios de coloração, limpeza e montagem de pequenos esferoides e sua fixação empregando agarose de baixo ponto de fusão e a técnica de limpeza CUBIC são detalhados, assim como pontos-chave para uma análise eficiente da estrutura 3D com diferentes sondas. Os dados indicam que a NTPDASE-ectonucleotidase 3 não colocaliza com a insulina no modelo esferoide, sugerindo níveis variados de maturidade e funcionamento da β-TC6, e que o procedimento completo também pode ser aplicado a ilhéus pancreáticos isolados, com sondagem clara dos vasos intra-ilhéus. Esses achados ressaltam a eficácia do protocolo de imagem 3D em revelar a organização complexa das células pancreáticas e as interações dentro do modelo das ilhotas.

Introdução

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O transplante de ilhotas pancreáticas é frequentemente complicado por reação inflamatória instantânea mediada pelo sangue (IBMIR), que danifica significativamente as células endoteliais intra-ilhotas (IEC), impactando a perfusão e a função do enxerto. A longo prazo, uma massa reduzida de ilhéus funcionais e a perda de independência da insulina são descritas em pacientes, 4 anos após otransplante 1. Embora modelos de transplante de ilhotas em muros ou ratos tenham sido desenvolvidos, modelos padronizados para investigar alvos farmacológicos para o pré-condicionamento de ilhéus, de particular relevância no contexto de danos ao enxerto induzidos por citocinas pelo IBMIR, sãoinsuficientes 2. De fato, um construto esferoide é particularmente adequado para a identificação de novos alvos farmacológicos e para a avaliação de moléculas citoprotetoras contra disfunção celular induzida por citocinas. Além disso, oferece uma abordagem alternativa para limitar o uso de modelos animais de diabetes tipo 1 e transplante de ilhéus.

Encontrar a coloração adequada, a limpeza óptica e as condições de montagem para pequenos esferoides de uma faixa de tamanho de ilhota continua sendo um desafio. Na literatura, pouquíssimos estudos descrevem o manuseio de pequenos esferoides e suas principais características estruturais. A dificuldade também surge da necessidade de equilibrar a penetração dos tecidos, preservação do sinal e integridade estrutural, mantendo a natureza delicada dessas estruturas celulares 3D em miniatura. Além disso, os métodos convencionais de coloração frequentemente têm dificuldade em alcançar uma rotulagem uniforme dos esferoides. Esse problema é agravado pela organização celular densa, que pode dificultar a difusão dos reagentes devido à penetração limitada de anticorpos ecorantes 3,4. Por fim, o processo de limpeza óptica, crucial para reduzir o fundo de dispersão da luz e melhorar a profundidade de imagem, deve ser cuidadosamente otimizado para evitar perturbar a estrutura do esferoide ou alterar propriedadesbiológicas 5.

Montar pequenos esferoides para microscopia 3D apresenta outro desafio. Meios de montagem tradicionais podem não fornecer suporte adequado para essas estruturas delicadas, podendo levar à sua deformação ou colapso durante a imagem. Além disso, a correspondência do índice de refração necessária para uma qualidade de imagem ideal deve ser controlada com precisão para garantir uma visualização exata em toda a profundidade doesferoide 6,7. O desenvolvimento de protocolos adaptados a pequenos esferoides é ainda mais complicado pela diversidade de tipos celulares e condições experimentais usadas em culturasesferoides 3. Por fim, a necessidade de abordagens especializadas para manter a integridade de múltiplas populações celulares durante os processos de coloração e eliminação é fundamental para a avaliação das respostas celulares.

Para enfrentar os desafios específicos do estudo do estresse mediado por ilhotas por IBMIR, foi projetado um modelo esferoide de 2000 células, combinando IEC murino e células β secretantes de insulina, com uma proporção de 1:20 de IEC para β células semelhante à observada em ilhotas pancreáticas. Além disso, experimentos anteriores estabeleceram que a estrutura mantém a viabilidade por 96 horas, fornecendo assim um modelo 3D fisiologicamente relevante para a observação de respostas celulares induzidas por estresse curtas (em intervalo de horas) ou mais longas (dias) e sua modulação farmacológica. O modelo esferoide é constituído por células endoteliais intra-ilhotas murinas MS-1, características da microvasculatura da ilhota e células constitutivas secretoras de insulina β, β-TC-68. Foi projetado para imitar de perto a menor faixa dimensional das ilhotas pancreáticas (50-200 μm de diâmetro) e seu número médio de célula9.

Uma nova metodologia de colheita e coloração especificamente otimizada para manuseio de pequenos esferoides (150-200 μm de diâmetro) é relatada, permitindo a penetração ótima de corantes fluorescentes e anticorpos em toda a estrutura esferoide e um fundo mínimo. O protocolo incorpora um procedimento de montagem utilizando agarose de baixo ponto de fusão (LMPA) para fornecer suporte estrutural suave a esferoides delicados, permitindo ao mesmo tempo o ajuste ótimo do índice de refração. LMPA é uma forma modificada de agarose com gelificação reduzida (cerca de 27 °C) e temperatura de fusão (cerca de 65 °C) que preserva a integridade da amostra durante a incorporação e cria uma matriz opticamente clara com autofluorescênciamínima 4,6. Por fim, o método de imagem clara, sem obstruções, cérebro/corpo e análise computacional (CUBIC)10 é empregado para limpeza óptica, permitindo a visualização máxima das estruturas internas e a preservação da integridade das delicadas interaçõescélula-célula 5,6,10.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O uso do tecido pancreático humano e todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Ministério do Ensino Superior e Pesquisa do governo francês (Direção-Geral de Pesquisa e Inovação, Unidade de Bioética) e registrados sob o número DC-2019-3439. O consentimento informado era obtido dos tutores legais de todos os sujeitos.

1. Preparação dos esferoides

NOTA: A linha IEC murina MS-1 e a linha celular β-pancreática murina β-TC6 foram cultivadas simultaneamente para obter uma quantidade celular suficiente para a cultura esferoide. As MS-1 foram cultivadas em frascos de células aderentes T75 em meio de alta glicose DMEM contendo 4,5 g/L de glicose, com 5% de soro bovino fetal e 1% de penicilina/estreptomicina em uma atmosfera úmida a 37 °C. As passagens foram realizadas em confluência (2 dias de cultura) após o descolamento usando Tripsina EDTA 1x e três lavagens em solução Hank Balanceada (HBSS). β-TC6 foram cultivados em T75 para células aderentes difíceis em meio DMEM de alta glicose contendo 4,5 g/L de glicose, com 15% de soro fetal bovino e 1% de penicilina/estreptomicina em uma atmosfera úmida a 37 °C. As passagens foram realizadas na confluência β-TC6 (cultura de 10 dias) após o destacamento por Tripsina EDTA 1x e 3 lavagens em solução Hank Balanceada (HBSS).

  1. Prepare a placa de cultura esferoide
  2. Lave a placa com 500 μL de solução antiaderente fornecida pelo fabricante para evitar a adesão celular e promover a formação de esferoides.
  3. Centrifuge a placa a 1.300 x g por 5 minutos em um rotor de balde oscilante equipado com suportes para placas em temperatura ambiente.
  4. Observe a placa sob um microscópio óptico para garantir que não haja bolhas nos micropoços. Se sim, centrifuge uma segunda vez a 1.300 x g por 5 minutos.
  5. Descarte o enxágue antiaderente e lave o poço 3 vezes com 1 mL de HBSS morno.
  6. Descarte o HBSS e substitua por 500 μL de meio esferoide quente: DMEM Glicose Alta contendo 4,5 g/L de glicose, 10% de soro bovino fetal e 1% de penicilina/estreptomicina.
  7. Mantenha a placa a 37 °C em uma atmosfera úmida enquanto prepara a suspensão esferoide.
  8. Incubar MS-1 e β-TC6 simultaneamente com solução de tripsina e contar as células vivas de cada linhagem.
    NOTA: Na sementeira, os esferoides são formados usando a proporção de 1 IEC para 20 células β típica dos ilhéus pancreáticos. Use uma placa de cultura esferoide de 24 poços, com cada poço contendo 300 micropoços que poderiam abrigar um esferoide composto por 2000 células, totalizando 600.000 células por poço. Na presente investigação, as medições revelaram volumes esferoides idênticos ocupados pelas linhas celulares selecionadas β-TC6 e MS1 após a cultura esferoide de 48h.
  9. Misture as duas linhas celulares para corresponder à razão 1 a 20 para 24 poços e então suspenda-as em 24 mL de meio esferoide.
    NOTA: Use uma pipeta de 10 mL ou 25 mL em movimento de sucção e fluxo para homogeneizar a suspensão.
  10. Pipete 1 mL para cada poço e proceda em um movimento de sucção-fluxo para distribuir a suspensão da célula uniformemente no poço.
  11. Centrifuge a placa a 130 x g por 5 minutos em um rotor de balde giratório equipado com suportes para placas em temperatura ambiente.
  12. Observe a placa ao microscópio para garantir que as células estejam distribuídas igualmente entre os micropoços.
    NOTA: Durante essa etapa de centrifugação, use altas taxas de aceleração e desaceleração (70%-90% das escalas de aceleração e desaceleração), ou os aglomerados celulares se deslocarão para o lado do micropoço.
  13. Incube a placa a 37 °C, 5% deCO2.
  14. Monitore a formação e crescimento dos esferoides usando um microscópio óptico.
    NOTA: Os esferoides β-TC6 / MS-1 devem começar a se formar após 24 horas de cultura, alcançando formato esférico após 48 horas. A viabilidade pode ser monitorada por tripano azul após a ruptura esferoide causada por tripsina em amostras duplicadas e foi mantida por 96 horas (80%-90%).

2. Colheita e coloração de esferoides

  1. Resuspenda os esferoides suavemente com uma pipeta P1000 em seu meio.
  2. Ejetar os esferoides em pequenos volumes em um Falcon de 15 mL e centrifugar a 130 x g por 5 minutos em temperatura ambiente
  3. Aspire suavemente o meio evitando o pellet que contém os esferoides.
  4. Lave o pellet duas vezes com 2 mL de HBSS, suavemente, para evitar dissociação dos esferoides, e centrifuge a 130 x g por 5 minutos.
  5. Sob um capuz químico, descarte o HBSS e ressuspenda os esferoides em 1 mL de solução de PFA a 4% durante a noite a 4 °C para fixar.
  6. Centrifuge o tubo a 130 x g por 5 minutos, descarte a solução de PFA a 4% e lave 3 vezes com 2 mL de 1x PBS (preparado em água ultrapura de grau laboratorial).
  7. Resuspenda 2,5 mL de HBSS.
  8. Distribua a suspensão esferoide em uma placa de 6 poços.
  9. Sob uma lupa binócula, selecione manualmente de 20 a 30 esferoides com uma pipeta P200 e coloque-os em um tubo de 1,5 mL.
    NOTA: Cada tubo de 1,5 mL é uma condição de coloração contendo de 20 a 30 esferoides. Abaixo de 20 esferoides colhidos, torna-se difícil vê-los quando são subsequentemente suspensos novamente.
  10. Equilibre os volumes dos tubos de 1,5 mL e centrifuge a 800 x g por 5 min.
    NOTA: A partir desse momento, todas as etapas de aspiração da solução são realizadas com a ajuda de uma lupa. É muito difícil ver esferoides sob luz artificial. Sempre execute os seguintes passos durante o dia, com os tubos mantidos contra a luz do dia. Todas as soluções são aspiradas com uma ponta P1000 encimada por uma ponta P10 em sua extremidade.
  11. Remova o máximo possível de HBSS sem resuspender os esferoides.
  12. Ressuspenda os esferoides em 400 μL de solução de têmpera (0,5 M glicina em 1x PBS (pH 7-7,4)) para evitar qualquer ruído de fundo futuro causado pelos aldeídos restantes da fixação de PFA. Incube a 37 °C por 2 horas.
  13. Centrifuge a 800 x g por 5 minutos e pipete com a solução de têmpera.
  14. Resuspenda em 400 μL de tampão de penetração (0,2% Triton X-100, 0,3 M glicina, 20% DMSO em 1x PBS). Isso ajudará a melhorar a penetração de anticorpos e sondas nucleares. Incube a 37 °C por 2 horas.
    NOTA: A partir deste estágio, os esferoides se acomodam sozinhos e não se agarram mais à parede do tubo. A centrifugação não é mais necessária se os volumes forem suavemente aspirados sem perturbar o pellet esferoide. Se necessário, centrifuge a 800 x g por 5 minutos.
  15. Descarte o tampão de penetração e incube em 400 μL de tampão bloqueante (0,2% Triton X-100, 1% BSA, 10% DMSO, 5% soro de cabra em 1x PBS) durante a noite a 37 °C.
  16. Descarte o tampão bloqueador e incube durante a noite a 37 °C em 300 μL de solução primária de anticorpos (0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% soro de cabra em 1x PBS).
    NOTA: Os anticorpos primários utilizados são: anti-CD31 (concentração final de 2,2 μg/mL), anti-Integrina β1 (1,43 μg/mL), anti-insulina (0,66 μg/mL) e anti-camundongoNTPDase3 11 (diluição 1:1000) (veja Tabela de Materiais). IgGs de controle de respectivos isotipos idênticos devem ser validados na mesma estrutura para determinar a marcação positiva por microscopia fluorescente.
  17. Descarte a solução primária de anticorpos e lave 3 vezes com 400 μL de tampão de lavagem (0,2% Tween 20, 1% BSA em 1x PBS). Agite por 5 minutos entre as lavagens.
  18. Incubar 300 μL da solução secundária de anticorpos (DAPI (2 μg/mL), 0,2% Tween 20, 1% BSA, 5% DMSO, 5% Soro de Cabra em 1x PBS) durante a noite a 37 °C. Proteja os tubos com papel alumínio.
    NOTA: DAPI deve sempre ser adicionado às condições de coloração, pois isso facilita a identificação de esferoides durante a microscopia e ajuda a não branquear os diferentes fluoróforos/corantes. Todos os anticorpos secundários têm uma concentração final de 2 μg/mL (veja a Tabela de Materiais).
  19. Descarte a solução secundária de anticorpos e lave 3 vezes com 400 μL de um segundo tampão de lavagem: 0,2% Tween 20, 1% BSA em 1x PBS. Mantenha a última lavagem e guarde os tubos a 37 °C até a montagem no mesmo dia.

3. Preparação da solução

  1. Preparação da solução de limpeza óptica
    NOTA: A solução de limpeza óptica segue o procedimento CUBIC10 e foi preparada conforme proposto por Gunasingh etal. 4. As proporções dos componentes são dadas em porcentagens do peso final da solução (w/w), porque a etilendiamina Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropila) é muito viscosa para ser pipetada e precisa ser pesada.
    1. Em uma garrafa de vidro, pesar 9% (peso a tempo) de etilendediamina N,N,N,N′,N′-Tetrakis (2-Hidroxipropila), 22% (peso a obras) de ureia, 44% (peso à flor e obra) de sacarose, 0,1% (peso à flor e obra) de Triton X-100 e 24,9% (peso à manga) de água ultrapura de grau laboratorial.
      NOTA: Cerca de 60 g de solução são necessários para limpar uma placa de 24 poços.
    2. Adicione uma barra magnética adaptada ao diâmetro da garrafa.
    3. Aqueça e mexa a solução até 56 °C. Mantenha uma garrafa de vidro de controle cheia de água na mesma placa para monitorar o aumento da temperatura.
    4. Controle a velocidade de agitação para manter um vórtice líquido suave e mexa a solução até que todos os compostos estejam completamente dissolvidos. A solução deve ser completamente líquida e transparente. Isso pode levar até 1 hora.
    5. Mantenha-se em temperatura ambiente, protegida da luz.
      NOTA: A solução de limpeza deve ser preparada pelo menos 24 horas antes da limpeza óptica, para permitir que a solução desgasifice e elimine quaisquer bolhas que possa conter. Para evitar a introdução de bolhas, nunca mais agite a solução. Nunca armazene em armazenamento a frio.
  2. Preparação da solução LMPA a 2%
    1. Pese 0,5 g de LMPA em uma balança de precisão e coloque em um frasco Erlenmeyer de 100 mL.
      CUIDADO: Não leve um Erlenmeyer de menor volume, pois há risco de queimaduras se transbordar.
    2. Dissolva em 25 mL de 1x PBS em temperatura ambiente.
    3. Incorpore cuidadosamente o pó no PBS 1x mexendo suavemente o frasco Erlenmeyer.
      CUIDADO: Para o próximo passo, é essencial usar equipamentos de proteção: luvas e uma máscara para os olhos e o rosto, para proteger contra respingos e queimaduras.
    4. Aqueça o frasco Erlenmeyer no micro-ondas.
    5. Observe quando a solução começa a ferver (presença de bolhas no líquido) e remova imediatamente antes que ela transborde.
    6. Mexa suavemente o Erlenmeyer para incorporar o pó.
      ATENÇÃO: Não mexa com muita força, pois o líquido pode transbordar/ferver demais e respingar.
    7. Coloque o Erlenmeyer de volta no micro-ondas e repita até que o LMPA esteja completamente dissolvido.
    8. Remova o Erlenmeyer e, antes que o LMPA solidifique, rapidamente aliquota 1 mL de solução LMPA a 2% em tubos de 1,5 mL. Armazene em temperatura ambiente.
      NOTA: O processo é demorado. Prepare a solução com antecedência e armazene-a para uso posterior.

4. Montagem e liberação óptica

  1. Pré-aqueça a centrífuga da placa a 40 °C, executando um longo ciclo para preparar a placa da amostra.
    NOTA: LMPA faz gel a 30 °C. Não deixe a centrífuga abaixo de 40 °C. Se a centrífuga permitir, aumente para 50 °C.
  2. Liquefaça alíquotas de LMPA a 2% em banho-maria ou aquecedor tubular a 70 °C por 5 a 10 minutos.
  3. Reduza e mantenha a temperatura do LMPA 2% em 55 °C.
  4. Coloque a placa de imagem suavemente sobre o aquecedor de placas pré-aquecido a 50 °C.
    NOTA: Tenha cuidado para não quebrar ou arranhar o polímero frágil usado como base para os poços.
  5. Tenha cuidado para que a placa esteja quente antes de adicionar o LMPA de 2%. Não deve se encaixar nessa fase.
  6. Pipete 200 μL de LMPA 2% em cada poço. Cubra toda a parte inferior do suporte para obter uma primeira base líquida, o que permite uma distribuição mais fluida dos esferoides.
  7. Descarte o buffer de lavagem dos tubos, ressuspenda os esferoides em 300 μL de LMPA 2% e pipetee-os diretamente no poço. Sempre faça uma resuspensão suave para evitar bolhas.
  8. Cubra a placa com papel alumínio para proteger os fluoróforos.
  9. Pese rapidamente a placa sem papel alumínio e devolve-a ao aquecedor de placas.
  10. Prepare uma placa de 24 poços, adicionando água para equilíbrio.
  11. Remova rapidamente a placa com papel alumínio do aquecedor de placa para proteger os fluoróforos acoplados aos anticorpos secundários. Mantenha a mão em uma superfície fria.
  12. Remova o papel alumínio e coloque-o na centrífuga de placa.
  13. Centrifuge a 1000 x g por 15 minutos a 40 °C. Verifique a temperatura do rotor, que deve estar em temperatura ambiente.
  14. Durante a centrifugação, prepare uma bandeja de gelo: achate o gelo para que a placa possa ser colocada sobre uma superfície plana.
  15. Retire o prato e coloque-o sobre o gelo, cobrindo a bandeja ou prato com papel alumínio. Deixe o prato no gelo por 10 minutos.
  16. Retire a placa do gelo e deixe-a no alumínio para estabilizar em temperatura ambiente por 20 minutos.
  17. Pipete de 1 a 1,5 mL da solução de limpeza por poço, cubra com papel alumínio e deixe limpar opticamente em temperatura ambiente, protegida da luz, por pelo menos 48 horas.
    NOTA: Nunca armazene a placa a 4 °C. A LMPA pode se contrair, se desprender do fundo do poço e flutuar na solução de limpeza. Imagem dentro de uma semana após a liberação.

5. Imagem

  1. Use um microscópio de disco giratório confocal, escolha (no mínimo) o objetivo 30x.
  2. Mantenha as soluções de limpeza, pois elas servem para homogeneizar os índices de refração e facilitar a imagem 3D.
  3. Encontre os esferoides selecionando o canal DAPI para evitar branquear os outros fluoróforos.
  4. Adquira imagens usando a função Z-stack. Selecione a parte superior e inferior do esferoide e espaça as fatias ópticas a 10 μm de distância.
    NOTA: A aquisição e análise de imagem foram realizadas na Plataforma de Imagem do CRBS, PIC-STRA UMS 38, Inserm, Unistra.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para avaliar a eficácia da marcagem e da limpeza óptica, vários modelos foram submetidos ao mesmo protocolo e posteriormente fixados (Figura 1). Esferoides com razões de 1 IEC para 20 células β e 1 IEC para 50 células β foram cultivados de acordo com o método descrito acima. Vale notar que a proporção de 1 IEC para 20 células β aproxima-se da de uma ilhéu pancreático humano. O uso do azul de tripano para corar esferoides perturbados confirmou que eles mantêm...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Foi desenvolvido um modelo esferoide incorporando a IEC murina MS-1 e células β murinas β-TC6, imitando a estrutura tridimensional dos ilhotas pancreáticos. Este modelo é adequado para a análise da disfunção IEC induzida por estresse ao longo de 72 horas e seu impacto na viabilidade e função das células β, com relevância para pesquisas em transplante de ilhéus. Importante destacar que o esferoide constituído por células murinas era homogêneo por natureza e possuía uma linhagem endotelial...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores declaram não ter conflito de interesses

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores devem muito a Pascal Kessler, da plataforma de imagem PICSTRA, pela assistência especializada na microscopia de disco giratório e extração dos dados brutos de rotulagem da pilha Z. Os autores desejam reconhecer o generoso presente dos ilhotas humanas purificadas do Dr. W. Bietiger, Dr. A. Langlois e Dr. K. Bouzakri, do Centro Europeu para o Estudo do Diabetes (CEED, Estrasburgo, França)

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
µ-placa 24 poços Preto ID 14 mm IBIDI82426
Poço AggreWell 800 (24 poços)StemCell34815
Solução de enxágue antiaderência & nbsp;StemCell7010
Anticorpo anti-CD31 [P2B1]Abcamab24590Concentração final 2.2µ g/mL
Anti-Integrin & beta; 1 Anticorpo, clone MB1.2MerckMAB1997 Concentração final 1,43 & micro; g/mL
Frasco de cultura celular, T-75, superfície, superfície  : Célula+, tampa filtranteSarstedt83.3911.302β-TC6 cultura
Frasco de cultura celular, T-75, superfície: Padrão, tampa de rosca de 2 posiçõesSarstedt83.3911.02Cultura MS-1
Dicidrocloreto DAPIThermofisher,D1306Concentração final 2 & micro; g/mL
Dimetil Sulfóxido  SigmaD8418-250ML
DMEM, glicose alta, GlutaMax e comércio; Suplemento, piruvatoThermofischer scientific31966047
Dulaglutida
DulaglutidaLillyCaneta Trulicity 1,5 mg
Soro Fetal BovinoBiowestS1810-500
GlicinaSigmaG7126-1KG
Anti-Porquinho da Cabra IgG (H+L) Anticorpo Secundário Altamente Adsorbido Cruzado, Alexa Fluor & Trade; 555TermofischerA21435Concentração final 2 & micro; g/mL
Anti-IgG anti-camundongo (H+L) Anticorpo Secundário altamente adsorvido cruzadamente, Alexa Fluor & trade; 488Termofischer  A-11029Concentração final 2 & micro; g/mL
Anticorpo secundário altamente adsorvido cruzado contra IgG de Cabra (H+L), Alexa Fluor & Trade; 633TermofischerA-21071Concentração final 2 & micro; g/mL
Anticorpo Secundário Cross-Adsorbed Anti-Rat IgG (H+L) de Cabra, Alexa Fluor & Trade; 555TermofischerA21434Concentração final 2 & micro; g/mL
Soro de cabraSigmaS26-100ML
HBSS sem cálcio e cálcio magnésio & nbsp; & Vermelho de fenolCorning21-022-CV
Insulina (C27C9) MAb de coelhoSinalização celular3014SConcentração final 0,66 e micro; g/mL
Ilhéu pancreático humano isolado Centro Europé En d'Etude du Diabete (CeeD)Presente gentil do Dr. Karim Bouzakri. Grau clínico, isolado conforme as diretrizes.
Agarose com baixa temperatura de gelificaçãoMerckA9414-10G
Células MS-1ATCCCRL-2279
Solução de Paraformaldeído, 4% em PBS 1xFischer Scientific15670799
PBS 10xEuromedexET330-ADiluído 1x em água ultrapura de grau laboratorial
Penicilina-EstreptomicinaPAN BiotechP06-07100
Anticorpos anti-camundongos anti-camundongos policlonal porquinho-da-índia mN3-1CI4; mN3-2C(I4,I5); mN3-3C(I4,I5) https://ectonucleotidases-ab.com/Antibodies.phpDiluição 1:1000
Quadrol/N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hidroxipropil) etilenodiamina Sigma122262-1L
Disco giratório Olympus IXplore SPIN Olympus Scientific Solutions
Sacarose para biologia molecularSigmaS0389-1KG 
Triton X-100 Grau Laboratório de BioqualidadeEuromedex2000-A
Tripsina/EDTA (10x)PAN BiotechP10-025100
Pré-adolescente-20Euromedex//
UreiaSigmaU-5128
Células β-TC6ATCCCRL-11506

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Langlois, A., Pinget, M., Kessler, L., Bouzakri, K. Islet transplantation: Current limitations and challenges for successful outcomes. Cells. 13 (21), 1783(2024).
  2. Li, X., Meng, Q., Zhang, L. The fate of allogeneic pancreatic islets following intraportal transplantation: Challenges and solutions. J Immunol Res. 2018, 1-13 (2018).
  3. Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Front Mol Biosci. 7, 20(2020).
  4. Gunasingh, G., Browning, A. P., Haass, N. K. Rapid optical clearing for semi-high-throughput analysis of tumor spheroids. J Vis Exp. 2022 (186), e64103(2022).
  5. Paysan, J. The art of tissue clearing. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex. (2021).
  6. Costa, E. C., Silva, D. N., Moreira, A. F., Correia, I. J. Optical clearing methods: An overview of the techniques used for the imaging of 3D spheroids. Biotechnol Bioeng. 116 (10), 2742-2763 (2019).
  7. Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369(2021).
  8. Poitout, V., et al. Morphological and functional characterization of βTC-6 cells: An insulin-secreting cell line derived from transgenic mice. Diabetes. 44 (3), 306-313 (1995).
  9. Ionescu-Tirgoviste, C., et al. A 3D map of the islet routes throughout the healthy human pancreas. Sci Rep. 5 (1), 14634(2015).
  10. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  11. Munkonda, M. N., et al. Characterization of a monoclonal antibody as the first specific inhibitor of human NTP diphosphohydrolase-3: partial characterization of the inhibitory epitope and potential applications. FEBS J. 276 (2), 479-496 (2009).
  12. Sbat, N. Study of the endothelial-to-mesenchymal transition of intra-islet endothelial cells in mice and its pharmacological modulation: Relevance for pancreatic islet transplantation. , Université Paris Cité. https://theses.hal.science/tel-03873595 (2021).
  13. Barillaro, M., Schuurman, M., Wang, R. β1-integrin: A key player in controlling pancreatic beta-cell insulin secretion via interplay with SNARE proteins. Endocrinology. 164 (1), bqac179(2023).
  14. Lavoie, E. G., et al. Identification of the ectonucleotidases expressed in mouse, rat, and human Langerhans islets: potential role of NTPDase3 in insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 299 (4), E647-E656 (2010).
  15. Giuliani, A. L., Sarti, A. C., Di Virgilio, F. Ectonucleotidases in acute and chronic inflammation. Front Pharmacol. 11, 619458(2021).
  16. Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-3 antibody targets adult human pancreatic β cells for in vitro and in vivo analysis. Cell Metab. 29 (3), 745-754.e4 (2019).
  17. Syed, S. K., et al. Ectonucleotidase NTPDase3 is abundant in pancreatic β-cells and regulates glucose-induced insulin secretion. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (10), E1319-E1326 (2013).
  18. Cheng, K., et al. High passage MIN6 cells have impaired insulin secretion with impaired glucose and lipid oxidation. PLoS One. 7 (7), e40868(2012).
  19. Rane, T. D., Armani, A. M. Two-photon microscopy analysis of gold nanoparticle uptake in 3D cell spheroids. PLoS One. 11 (12), e0167548(2016).
  20. Alzeeb, G., et al. Gastric cancer multicellular spheroid analysis by two-photon microscopy. Biomed Opt Express. 13 (5), 3120(2022).
  21. Diosdi, A., et al. Single-cell light-sheet fluorescence 3D images of tumour-stroma spheroid multicultures. Sci Data. 12 (1), 492(2025).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Modelo de Esferoides de IlhotasIntera o de C lulas EndoteliaisIntera o de C lulas BetaImagem 3DIlhotas Pancre ticasTriagem CitoprotetoraCultura de EsferoidesClarifica o CUBICC lulas Secretoras de InsulinaAgarose de Baixo Ponto de Fus o

Artigos relacionados