Artigo de método

Identificação de espécies de micobactérias pelo método de chip de microarranjo de DNA

DOI:

10.3791/68234

⸱

24 de junho de 2025

 ,  ,  ,  , 
1Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

Neste artigo

Resumo

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Aqui, apresentamos um método de chip de microarray de DNA para identificar espécies de Mycobacterium , o que melhorará a precisão diagnóstica e a eficiência de doenças relacionadas para uso clínico.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudo apresenta um método de chip de microarray de DNA projetado para a identificação precisa de espécies de Mycobacterium . Aproveitando os princípios de amplificação e hibridização assimétrica de PCR, este método tem como alvo 17 micobactérias comuns, incluindo aquelas do complexo Mycobacterium tuberculosis e várias micobactérias não tuberculosas. É aplicável a uma ampla gama de amostras clínicas, como escarro, pus, fluido de lavagem broncoalveolar, líquido cefalorraquidiano e fluido de punção de pacientes com suspeita de doenças micobacterianas. O ensaio envolve a amplificação de sequências-alvo no genoma do Mycobacterium por meio de PCR assimétrica, seguida de hibridização com as sondas no chip de microarray. O arranjo exclusivo da sonda (repetido 5x em um microarray de 12 linhas x 10 colunas) e o uso de sondas de controle aumentam sua confiabilidade. Ensaios clínicos com 1.724 amostras demonstraram alto desempenho. O método alcançou 100% de especificidade clínica, sensibilidade e concordância geral em comparação com os resultados do sequenciamento, exceto por duas raras amostras de micobactérias não tuberculosas além de seu escopo de detecção. Este método de chip de microarray de DNA oferece uma melhoria significativa em relação às técnicas tradicionais de diagnóstico, encurtando o tempo de diagnóstico e proporcionando uma detecção mais abrangente, tendo assim um grande potencial no diagnóstico e tratamento de doenças micobacterianas.

Introdução

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Mycobacterium, um gênero de bactéria, abrange um grupo diversificado de organismos com implicações significativas para a saúde humana e animal. Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB), tem sido um flagelo de saúde global de longa data. Apesar de décadas de esforços na prevenção e tratamento, a TB continua sendo uma grande ameaça à saúde pública, responsável por um número impressionante de mortes anuais e novas infecções em todo o mundo 1,2. As micobactérias não tuberculosas (MNT) também são cada vez mais reconhecidas como patógenos importantes, especialmente em populações específicas de pacientes e ambientes ambientais.

A identificação precisa das espécies de Mycobacterium é a pedra angular do manejo eficaz da doença 3,4. Os métodos diagnósticos tradicionais têm limitações inerentes. As técnicas baseadas na cultura, que historicamente têm sido utilizadas, são notoriamente demoradas. O processo de isolamento e cultura de micobactérias pode levar de semanas a meses, durante os quais os pacientes podem experimentar progressão da doença e potencial transmissão para outras pessoas. Além disso, algumas espécies de micobactérias são extremamente difíceis de cultivar, levando a resultados falso-negativos e tratamento tardio ou incorreto 5,6.

A coloração álcool-ácido resistente, outro método comumente usado, pode identificar micobactérias com base em suas propriedades únicas da parede celular que resistem à descoloração. No entanto, falta a especificidade para distinguir entre diferentes espécies de Mycobacterium , fornecendo apenas uma indicação ampla da presença de micobactérias7. Métodos moleculares como a reação em cadeia da polimerase (PCR) têm surgido como alternativas para superar algumas dessas desvantagens. A PCR pode detectar DNA micobacteriano mais rapidamente do que os métodos de cultura, permitindo um diagnóstico mais rápido. No entanto, os ensaios convencionais de PCR geralmente visam um número limitado de genes e podem não oferecer uma identificação abrangente das espécies, especialmente quando se trata de espécies de Mycobacterium intimamente relacionadas5.

A tecnologia de microarray de DNA revolucionou os campos da microbiologia e diagnóstico. Ele oferece a capacidade de analisar simultaneamente múltiplos alvos genéticos, fornecendo uma visão mais abrangente e detalhada da população microbiana 8,9. Pesquisas recentes nesta área iluminaram ainda mais o potencial e a importância de técnicas moleculares avançadas para a identificação de Mycobacterium. Por exemplo, um estudo de Wang et al.10 demonstrou a sensibilidade e especificidade aprimoradas de um chip de microarray de DNA modificado na detecção de espécies raras de Mycobacterium em um ambiente clínico. Suas descobertas enfatizaram o valor da otimização contínua da tecnologia de microarray. Outro estudo de Wang e colegas11enfocou a integração de dados de microarranjos de DNA com resultados clínicos em pacientes com TB. Os resultados forneceram informações sobre o valor prognóstico da identificação precisa das espécies de Mycobacterium e o potencial da medicina personalizada.

Princípio de teste
Este kit emprega a tecnologia de chip de microarray de DNA, combinada com a amplificação da reação em cadeia da polimerase assimétrica (PCR) e princípios de hibridização, para a identificação de espécies de Mycobacterium . O kit inclui um chip de identificação de espécies de Mycobacterium e reagentes de amplificação de PCR assimétricos. O chip é fixado com sondas específicas para a detecção e identificação de espécies de Mycobacterium . Os alvos de detecção incluem 17 espécies ou grupos clinicamente comuns, como o complexo Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium avium, Mycobacterium gordonae, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium flavescens, Mycobacterium terrae, Mycobacterium chelonae e Mycobacterium abscessus, Mycobacterium phlei, Mycobacterium nonchromogenicum, Mycobacterium marinum e Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium aurum, Mycobacterium szulgai e Mycobacterium malmoense, Mycobacterium xenopi e Mycobacterium smegmatis.

A detecção dessas 17 espécies de Mycobacterium é fundamental para um diagnóstico clínico preciso e gerenciamento personalizado do paciente. O complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) é priorizado devido ao seu papel na tuberculose, necessitando de isolamento imediato e poliquimioterapia para conter a transmissão e abordar a resistência aos medicamentos. Espécies dentro do complexo Mycobacterium avium-intracellulare (MAC), como M. avium e M. intracellulare, afetam predominantemente indivíduos imunocomprometidos (por exemplo, HIV/AIDS) ou aqueles com doença pulmonar crônica, exigindo regimes prolongados baseados em macrolídeos. Micobactérias de crescimento rápido (RGMs) como M. abscessus e M. fortuitum são notórias por resistência a antibióticos e geralmente causam infecções graves na pele, tecidos moles ou pulmonares, exigindo combinações agressivas de cirurgia e antibióticos direcionados (por exemplo, amicacina, macrolídeos). Espécies ambientais como M. gordonae ou M. smegmatis são contaminantes frequentes, mas podem causar infecções oportunistas em contextos específicos, exigindo correlação clínica cuidadosa para evitar tratamento desnecessário. Patógenos como M. marinum (associado à exposição aquática) e M. ulcerans (causador de úlcera de Buruli) têm nichos epidemiológicos distintos, orientando as avaliações do histórico de exposição. Espécies raras, mas clinicamente relevantes (por exemplo, M. szulgai, M. malmoense) mimetizam a tuberculose e requerem esquemas específicos para cada espécie. A identificação precisa é fundamental, pois a duração do tratamento, a seleção do medicamento (por exemplo, sensibilidade à rifampicina em M. kansasii vs. resistência intrínseca em MNTs) e o prognóstico variam drasticamente. O diagnóstico molecular e o teste de suscetibilidade antimicrobiana são essenciais para otimizar os resultados, particularmente em populações imunocomprometidas ou infecções complexas.

Primeiro, as sequências-alvo no genoma do Mycobacterium são amplificadas por meio de PCR assimétrica. Em seguida, os produtos amplificados são hibridizados com as sondas no chip. Se o Mycobacterium alvo estiver presente na amostra, os produtos amplificados se ligarão especificamente às sondas correspondentes no chip. Finalmente, ao escanear os sinais de hibridização no chip, as espécies de Mycobacterium na amostra podem ser determinadas.

Usando a tecnologia de micro-array de chips genéticos, sondas específicas para detectar os genes mencionados e várias sondas de controle são fixadas no substrato. Cada sonda de detecção e sonda de controle é repetida 5x, formando um microarray de 12 linhas x 10 colunas. O arranjo da sonda é mostrado na Figura 1. Cada chip contém quatro microarrays idênticos e cada microarray pode detectar uma amostra.

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Protocolo

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Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Quanzhou First Hospital Afiliado à Fujian Medical University (Aprovação nº 2024-K035). O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes antes da coleta das amostras clínicas. Os pacientes foram informados sobre o objetivo do estudo, os procedimentos envolvidos e seu direito de desistir a qualquer momento sem afetar seus cuidados médicos.

1. Requisitos de amostra

NOTA: Ao coletar amostras de pacientes com suspeita clínica de tuberculose e doenças de micobactérias não tuberculosas (MNT) para teste com este kit, siga estas etapas:

  1. Colete amostras como escarro, pus ou secreções, fluido de lavagem broncoalveolar, fluido de punção (incluindo líquido cefalorraquidiano, líquido pleural e peritoneal, líquido pericárdico, fluido articular e bile) e urina dos pacientes.
    1. Para amostras de escarro:
      1. Instrua o paciente a enxaguar a boca com água limpa pela manhã e, em seguida, tossir escarro profundo em um recipiente de armazenamento de amostras estéril, fechá-lo e enviá-lo para teste.
      2. Adicione 1-2x o volume de 4% de NaOH, agite e misture uniformemente.
      3. Após 15-20 min, adicione um volume igual de tampão fosfato de pH 6,8 e misture uniformemente.
      4. À temperatura ambiente, centrifugue a 2.000 × g por 15 min e descarte o sobrenadante. Adicione 1 mL de NaCl a 0,9% por meio de uma pipeta e misture bem; use para detecção.
    2. Para amostras de pus ou secreção:
      1. Enxágue a superfície com solução salina normal estéril. Colete o pus ou secreção com um cotonete estéril, sele-o e envie-o para teste.
      2. Adicione 3x o volume de 4% de NaOH e agite bem para misturar bem.
      3. Deixe repousar em temperatura ambiente por 20 min (agite manualmente 2x durante este período), centrifugue a 2.000 × g em temperatura ambiente por 15 min e depois descarte o sobrenadante. Adicione 1 mL de NaCl a 0,9% por meio de uma pipeta e misture uniformemente; use para detecção.
    3. Para o líquido de lavagem broncoalveolar:
      1. Injete 10-20 mL de solução salina normal através de um tubo de lavagem broncoalveolar protegida (PBAL).
      2. Coletar a amostra em um frasco estéril por sucção por pressão negativa e enviá-la para teste.
    4. Para o líquido cefalorraquidiano:
      1. Colete pelo menos 2 mL de amostra usando técnica asséptica.
      2. Centrifugue a 2.000 × g por 15 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Adicione 1 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% por meio de uma pipeta, misture bem e use para teste.
    5. Para amostras de urina:
      NOTA: É aconselhável usar a primeira quantidade total de urina pela manhã ou a urina no meio e tarde da noite. A urina também pode ser coletada por cateterismo.
      1. Colete a amostra em um recipiente estéril e deixe a amostra de urina coletada repousar por 4-5 h.
      2. Centrifugue a 2.000 × g por 15 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante. Adicione 1 mL de solução de cloreto de sódio a 0,9% por meio de uma pipeta, misture bem e use para teste.
  2. Armazenamento de amostras
    NOTA: As amostras em meio sólido não devem ser armazenadas congeladas, pois o congelamento pode afetar as operações subsequentes.
    1. Armazenar as amostras existentes no meio líquido a -70 °C durante um período máximo de 5 anos.
    2. Armazene todas as amostras a 2-8 °C por no máximo 2 meses.
  3. Transporte de amostras
    1. Ao transportar as amostras isoladas de teste, certifique-se de usar um recipiente fechado que atenda aos requisitos de biossegurança nas condições permitidas pelos regulamentos.

2. Preparação do experimento

  1. Preparação de soluções de lavagem de cavacos
    NOTA: Prepare a Solução de Lavagem de Cavacos I e a Solução de Lavagem de Cavacos II de acordo com o número de cavacos. O volume deve ser tal que os cavacos possam ser completamente submersos durante a lavagem. Misture uniformemente e equilibre-os à temperatura ambiente (10-30 °C). A concentração final de SSC é 2x e a concentração final de SDS é de 0,2%.
    1. Para preparar a Solução de Lavagem de Cavacos I, misture 20x SSC, água destilada (ou água purificada) e 10% de SDS na proporção de 10:88:2 em sequência para preparar a Solução de Lavagem de Cavacos I. Por exemplo, ao preparar um volume total de 600 mL, meça primeiro 60 mL de 20x SSC e 528 mL de água destilada (ou água purificada) e coloque-os em um copo de 1 L e misture uniformemente com uma vareta de agitação. Em seguida, adicione 12 mL de SDS a 10% e misture uniformemente novamente.
    2. Para preparar a solução de lavagem de cavacos II: A concentração final de SSC é de 0,2x. Misture 20x SSC e água destilada (ou água purificada) na proporção de 1:99 para obter a Solução de Lavagem de Cavacos II. Tomando como exemplo a preparação de um volume total de 600 mL, meça 6 mL de 20x SSC e 594 mL de água destilada (ou água purificada) e coloque-os em um copo de 1 L e misture uniformemente.
      NOTA: Se a solução de SDS a 10% desenvolver precipitados floculantes brancos, aqueça-a a 50 °C, misture bem e, em seguida, prepare o tampão de lavagem do microarray. Se o tampão de lavagem I desenvolver precipitados floculantes brancos, aqueça-o a 50 ° C, misture bem, equilibre à temperatura ambiente antes de usar.
  2. Prepare 350 mL da mistura de água gelada.
  3. Prepare a água destilada (ou água purificada).

3. Preparação de instrumentos e materiais

  1. Seleção e configuração de instrumentos
    1. Identifique e prepare o scanner de chip de microarray, garantindo que ele esteja calibrado e pronto para uso.
    2. Configure o instrumento de extração de ácido nucleico, verificando suas funções e carregando os reagentes necessários.
    3. Coloque a caixa de hibridização do chip de microarray de gene da caixa de hibridização no local apropriado e confirme sua condição de trabalho adequada.
  2. Preparação de ferramentas de pipetagem
    1. Reúna micropipetas com especificações de 0,1-10 μL, 2-20 μL e 20-200 μL, juntamente com suas pontas de pipeta limpas e estéreis correspondentes. Certifique-se de que as micropipetas estejam calibradas com precisão e que as pontas estejam encaixadas corretamente.
  3. Arranjo de equipamentos auxiliares
    1. Preparar um banho-maria a temperatura constante e regulá-lo para a temperatura desejada (50 °C).
    2. Posicione a microcentrífuga capaz de centrifugar tubos de centrífuga de 1.5 mL e verifique suas configurações de equilíbrio e velocidade.
    3. Organize tubos de centrífuga limpos e estéreis (200 μL e 1,5 mL) e tiras opcionais limpas e estéreis de oito poços (200 μL) nos racks de tubos de centrífuga.
  4. Prontidão do equipamento de manuseio de amostras
    1. Coloque um agitador de temperatura constante em um local conveniente e defina os parâmetros de agitação apropriados.
    2. Reserve dois recipientes para lavar as batatas fritas e certifique-se de que estejam limpos e secos.
    3. Organize racks de slides e uma centrífuga e tenha um recipiente para centrifugar e secar cavacos à mão.
  5. Preparação do amplificador de PCR
    1. Ligue o amplificador de PCR e programe-o de acordo com o protocolo experimental, garantindo que esteja pronto para realizar reações de amplificação.

4. Extração de ácido nucleico

NOTA: Realize a operação na área de preparação da amostra e siga estas etapas:

  1. Preparação
    1. Adicione 80 μL de solução de extração de ácido nucleico no tubo de extração de ácido nucleico e adicione 1 mL de NaCl a 0,9%.
  2. Colheita de amostras isoladas
    1. Para iniciar a coleta de amostras, examine a fonte das amostras, sejam elas de meio sólido ou líquido.
    2. Para coletar amostras de meio sólido, use uma alça de inoculação estéril para escolher uma colônia visível do meio sólido apropriado. Se as bactérias cresceram para cobrir todo o meio, escolha uma quantidade correspondente de gramado bacteriano. Coloque-o cuidadosamente no tubo de extração de ácido nucleico que contém a solução de extração de ácido nucleico, tomando cuidado para evitar ao máximo pegar o meio sólido.
    3. Para amostras de meio líquido, aspirar 10-20 μL da suspensão bacteriana com turbidez igual ou superior a 1 padrão de McFarland. Injete-o no tubo de extração de ácido nucleico que contém a solução de extração de ácido nucleico.
      NOTA: Após a coleta da amostra, seja em meio sólido ou líquido, as amostras estão prontas para a operação subsequente de extração de ácido nucleico.
  3. Extração de ácido nucleico
    1. Depois de adicionar as amostras pré-tratadas ou amostras isoladas da Etapa 1.1 mencionada acima, use o instrumento de extração rápida de ácido nucleico para extrair ácidos nucléicos. Colocar os ácidos nucleicos extraídos a -20 °C para armazenamento temporário.
      NOTA: Como indicador da eficiência da extração, o extrator automático pode extrair amostras com carga de ácido nucleico viral superior a 100 cópias/mL. O tempo de armazenamento temporário não deve exceder 2 meses.

5. Amplificação por PCR

  1. Preparação do sistema de reação PCR
    1. Na área de armazenamento e preparação de reagentes, prepare tubos de centrífuga de 200 μL ou tiras de oito poços de acordo com o número de amostras a serem testadas e marque os números das amostras com antecedência. Retire os reagentes de amplificação de PCR do kit, deixe-os descongelar e derreter naturalmente, agite suavemente e misture uniformemente e, em seguida, centrifugue rapidamente para que os reagentes se acumulem no fundo dos tubos.
    2. De acordo com o número de amostras, alíquota dos reagentes de amplificação por PCR em tubos de centrífuga de 200 μL ou tiras de oito poços a um volume de 18 μL por tubo. Feche bem as tampas dos tubos e transfira-as para a área de preparação e amplificação da mistura de reação de amplificação.
    3. Adicione 2 μL de DNA molde (o DNA da amostra a ser testada (ou seja, o sobrenadante no tubo de extração de ácido nucleico), produtos de controle positivo ou produtos de controle negativo) na área de preparação da amostra. Certifique-se de que o volume total de cada sistema de reação de PCR atinja 20 μL.
      NOTA: Use produtos de controle positivo e produtos de controle negativo todas as vezes durante a amplificação. O produto de controle positivo pode ser usado para controle de qualidade nos processos de amplificação e hibridização de PCR, e o produto de controle negativo pode ser usado para monitorar o ambiente e o processo de operação.
  2. Amplificação
    1. Coloque os tubos de centrífuga ou tiras de oito poços contendo os reagentes no instrumento de amplificação de PCR. Certifique-se de que o instrumento esteja pré-aquecido até a temperatura necessária. Conduza a reação de amplificação por PCR de acordo com o seguinte programa de ciclagem térmica: desnaturação inicial a 94 ° C por 600 s (1 ciclo); 35 ciclos de desnaturação a 94 °C durante 30 s, recozimento a 60 °C durante 30 s e extensão a 72 °C durante 40 s; uma extensão final a 72 ° C por 420 s (1 ciclo); manter a 4 °C indefinidamente (1 ciclo).

6. Hibridização de chips

NOTA: Antes que a reação de amplificação de PCR termine, execute as seguintes operações:

  1. Ajuste a temperatura do banho-maria de temperatura constante para 50 °C e pré-aqueça-o.
  2. Preparação de chips
    1. Adicione 200 μL de água destilada (ou água purificada, como mostrado na Figura 2A) na parte inferior da caixa de hibridização do chip de microarray genético. Coloque o suporte entre as duas colunas de posicionamento dentro da caixa.
    2. Coloque cuidadosamente o chip com a frente voltada para cima no suporte e cubra o chip com a lamínula com suas quatro saliências voltadas para baixo (conforme mostrado na Figura 2B).
      NOTA: Certifique-se da direção correta de colocação da lamínula para que sua extremidade se alinhe com a etiqueta na extremidade do chip.
  3. Preparação, desnaturação e resfriamento da mistura de reação de hibridização
    1. Prepare tubos de centrífuga de 200 μL ou tiras de oito poços de acordo com o número de amostras e rotule-os adequadamente.
    2. Retire o tampão de hibridização do kit e aqueça-o a 50 °C até que esteja completamente derretido. Após uma mistura completa, centrifugue-o rapidamente em uma microcentrífuga. Alíquota de 9 μL do tampão de hibridização em cada tubo de centrífuga de 200 μL preparado ou tira de oito poços. Em seguida, adicione 6 μL do produto de PCR correspondente a cada tubo, resultando em um volume total de 15 μL por mistura de reação de hibridização.
    3. Aquecer a mistura de reação de hibridização (incluindo o tampão de hibridização e o produto de PCR) a 95 °C (num instrumento de PCR ou em banho-maria) e desnaturá-la durante 5 min. Retire a mistura de reação de hibridização que passou pelo tratamento de desnaturação na etapa anterior e mergulhe-a imediatamente em uma mistura de água gelada por 3 min.
  4. Reação de hibridização
    1. Retire a mistura de reação de hibridização do banho de gelo, pipete para cima e para baixo 2x com uma micropipeta para misturá-la uniformemente. Depois que o precipitado floculante branco (se houver) desaparecer, adicione 13,5 μL da mistura de reação de hibridização através do orifício de carregamento da lamínula (conforme mostrado na Figura 2C), cubra rapidamente a caixa de hibridização e feche-a (conforme mostrado na Figura 2D). Registre o número do chip, a posição do microarray e o número da amostra correspondente.
      NOTA: Apenas uma amostra pode ser adicionada a cada microarray.
    2. Coloque imediatamente as caixas de hibridização seladas horizontalmente no banho-maria de temperatura constante que foi pré-aquecido a 50 °C. Inicie o cronômetro por 120 minutos depois que todas as caixas de hibridização forem colocadas.
      NOTA: Evite introduzir bolhas de ar durante o processo de carregamento. Em todas as etapas desde o início do carregamento até que os chips estejam secos, evite que o líquido nos microarrays do chip seja exposto diretamente ao ar por um longo tempo para evitar que o fundo do chip fique muito alto devido à secagem e interfira na interpretação do resultado.
  5. Lavagem e secagem de cavacos
    1. Após a conclusão da reação de hibridização, retire as caixas de hibridização horizontalmente, desmonte-as e retire os cavacos para lavar. Coloque imediatamente os cavacos no suporte deslizante do recipiente (como um copo) cheio de solução de lavagem de cavacos I que foi equilibrada à temperatura ambiente (10-30 °C). Lave-os a uma velocidade de 80-100 rpm em um agitador de temperatura constante por 3 min em temperatura ambiente.
    2. Lave os cavacos com a Solução de Lavagem de Cavacos II equilibrada à temperatura ambiente a uma velocidade de 80-100 rpm em um agitador de temperatura constante por 3 min em temperatura ambiente.
    3. Coloque os cavacos em uma centrífuga e centrifugue a 100 × g em temperatura ambiente por 5 minutos. Digitalize-os após a secagem.
      NOTA: Não permita que os cavacos colidam ou esfreguem uns nos outros.

7. Digitalização de chips e interpretação de resultados

NOTA: Use o scanner de chip de microarray e o software correspondente para ler sinais e interpretar os resultados. Consulte também a Tabela 1 para obter resultados anormais e solução de problemas. Siga estas etapas para operar (consulte os manuais do usuário do scanner e do software).

  1. Ligue o scanner e o software correspondente e clique no botão Controle do laser para deixá-lo pré-aquecer por 10 minutos.
  2. Insira vários tipos de informações relacionadas às amostras, como o Número da Amostra.
  3. Depois que o scanner terminar de pré-aquecer, clique no botão Ejetar e coloque o chip firmemente na pequena peça do suporte. Empurre o chip com cuidado e horizontalmente na abertura do compartimento do scanner e clique no botão Carregar .
  4. Insira o número do chip, clique para selecionar a área de detecção (microarray 1-4) e, em seguida, clique em Selecionar amostra para escolher as amostras correspondentes para cada microarray. Em seguida, clique no botão Iniciar detecção para realizar a varredura do chip. Os resultados da digitalização serão exibidos na tela e salvos automaticamente.
  5. Depois de digitalizar um chip, repita as etapas 7.3 e 7.4 para digitalizar o próximo chip. Siga este procedimento até que todos os chips tenham sido digitalizados.
  6. Use a página Consulta de Dados para realizar operações de consulta e impressão de dados.
  7. Depois de concluir todas as operações, primeiro desligue o laser, saia do software e, finalmente, desligue o scanner.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resultados positivos
Para as sondas do gênero Mycobacterium (controle interno, CI) e Mycobacterium tuberculosis, seus valores de resultados positivos são determinados pelo método Receiver Operating Characteristic (ROC). Para as sondas usadas para detectar as outras 16 NTM, seus valores de resultados positivos são determinados pelo método do percentil.

Controle de qualidade experimental
O resultado da detecção do produto de controlo posi...

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Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O método de chip de microarray de DNA introduzido neste artigo pode detectar diretamente ácidos nucléicos em amostras clínicas (incluindo escarro, pus, fluido de lavagem broncoalveolar, líquido cefalorraquidiano e fluido de punção) de pacientes com suspeita de tuberculose e micobacteriose não tuberculosa e pode reduzir significativamente o tempo para o diagnóstico confirmado. O método de chip de microarranjo de DNA apresentado neste estudo representa um avanço significativo na identifica...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi apoiado pelo Projeto da Fundação de Ciências Naturais da Província de Fujian (2024J011521) e pelo Projeto do Plano de Ciência e Tecnologia de Quanzhou (2024NY006).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Injeção de cloreto de sódio a 0,9% (NaCl)FuZhou HAIWANGFUYAOH35020289
Aparelhos de amplificação da Applied BiosystemsThermo Fisher CientíficoTermociclador Veriti de 96 poços
CapitalBio LuxScan10K/BCapitalBioLuxScan10K/B
CapitalBio SlideWasher 24 CapitalBioSlideWasher 24 
  CentrífugaEppendorf5424RMaX.speed 15000 min-1
Tampão de hibridização
Chip e tampa do microarray do gene HybSet
Kit de identificação de espécies de MycobacteriumCapitalBio301030
Controlos negativos, controlos positivos
Extrator de ácidos nucleicosTIANLONGGeneRotex 96
Reagente de amplificação por PCR
Tampão fosfato pH 6,8Xangai yuanye Bio-TecnologiaR20029-10
Pipetadores e pontasThermo Científico0,1 - 10 μ L, 2 - 20 μ L e 20 - 200 μ L, 100-1000 μ L
qEx-DNA/RNA Kit de extração ou purificação de ácidos nucleicosTIANLONGqEx-DNA/RNA
SDSCapitalBio441060
Hidróxido de sódio (NaOH)XILONGS  CientíficoXK13-011-00027
CCDCapitalBio441050
banho-maria termostáticoSURUÍHH-W600

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Primm, T. P., Lucero, C. A., Falkinham, J. O. III Health impacts of environmental mycobacteria. Trends Genet. 38 (8), 821-830 (2004).
  2. Sawyer, J., et al. Mycobacterium bovis and its impact on human and animal tuberculosis. Trends Genet. 39 (8), 587-592 (2023).
  3. Zhao, Q., et al. The impact of DNA microarray chip technology on the diagnosis and management of non-tuberculous mycobacterial infections in immunocompromised patients. Antimicrob Agents Chemother. 65 (12), e01500-e01500 (2021).
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