Identificação de espécies de micobactérias pelo método de chip de microarranjo de DNA

Resumo

Aqui, apresentamos um método de chip de microarray de DNA para identificar espécies de Mycobacterium , o que melhorará a precisão diagnóstica e a eficiência de doenças relacionadas para uso clínico.

Resumo

Este estudo apresenta um método de chip de microarray de DNA projetado para a identificação precisa de espécies de Mycobacterium . Aproveitando os princípios de amplificação e hibridização assimétrica de PCR, este método tem como alvo 17 micobactérias comuns, incluindo aquelas do complexo Mycobacterium tuberculosis e várias micobactérias não tuberculosas. É aplicável a uma ampla gama de amostras clínicas, como escarro, pus, fluido de lavagem broncoalveolar, líquido cefalorraquidiano e fluido de punção de pacientes com suspeita de doenças micobacterianas. O ensaio envolve a amplificação de sequências-alvo no genoma do Mycobacterium por meio de PCR assimétrica, seguida de hibridização com as sondas no chip de microarray. O arranjo exclusivo da sonda (repetido 5x em um microarray de 12 linhas x 10 colunas) e o uso de sondas de controle aumentam sua confiabilidade. Ensaios clínicos com 1.724 amostras demonstraram alto desempenho. O método alcançou 100% de especificidade clínica, sensibilidade e concordância geral em comparação com os resultados do sequenciamento, exceto por duas raras amostras de micobactérias não tuberculosas além de seu escopo de detecção. Este método de chip de microarray de DNA oferece uma melhoria significativa em relação às técnicas tradicionais de diagnóstico, encurtando o tempo de diagnóstico e proporcionando uma detecção mais abrangente, tendo assim um grande potencial no diagnóstico e tratamento de doenças micobacterianas.

Introdução

Mycobacterium, um gênero de bactéria, abrange um grupo diversificado de organismos com implicações significativas para a saúde humana e animal. Mycobacterium tuberculosis, o agente causador da tuberculose (TB), tem sido um flagelo de saúde global de longa data. Apesar de décadas de esforços na prevenção e tratamento, a TB continua sendo uma grande ameaça à saúde pública, responsável por um número impressionante de mortes anuais e novas infecções em todo o mundo ^1,2. As micobactérias não tuberculosas (MNT) também são cada vez ....

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Quanzhou First Hospital Afiliado à Fujian Medical University (Aprovação nº 2024-K035). O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes antes da coleta das amostras clínicas. Os pacientes foram informados sobre o objetivo do estudo, os procedimentos envolvidos e seu direito de desistir a qualquer momento sem afetar seus cuidados médicos.

1. Requisitos de amostra

NOTA: Ao coletar amostras de pacientes com suspeita clínica de tuberculose e doenças de micobactérias não tuberculosas (MNT) para teste com este ki....

Resultados

Resultados positivos
Para as sondas do gênero Mycobacterium (controle interno, CI) e Mycobacterium tuberculosis, seus valores de resultados positivos são determinados pelo método Receiver Operating Characteristic (ROC). Para as sondas usadas para detectar as outras 16 NTM, seus valores de resultados positivos são determinados pelo método do percentil.

Controle de qualidade experimental
O resultado da detecção do produto de controlo posi.......

Discussão

O método de chip de microarray de DNA introduzido neste artigo pode detectar diretamente ácidos nucléicos em amostras clínicas (incluindo escarro, pus, fluido de lavagem broncoalveolar, líquido cefalorraquidiano e fluido de punção) de pacientes com suspeita de tuberculose e micobacteriose não tuberculosa e pode reduzir significativamente o tempo para o diagnóstico confirmado. O método de chip de microarranjo de DNA apresentado neste estudo representa um avanço significativo na identifica.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Injeção de cloreto de sódio a 0,9% (NaCl)	FuZhou HAIWANGFUYAO	H35020289
Aparelhos de amplificação da Applied Biosystems	Thermo Fisher Científico	Termociclador Veriti de 96 poços
CapitalBio LuxScan10K/B	CapitalBio	LuxScan10K/B
CapitalBio SlideWasher 24	CapitalBio	SlideWasher 24
Centrífuga	Eppendorf	5424R	MaX.speed 15000 min-1
Tampão de hibridização
Chip e tampa do microarray do gene HybSet
Kit de identificação de espécies de Mycobacterium	CapitalBio	301030
Controlos negativos, controlos positivos
Extrator de ácidos nucleicos	TIANLONG	GeneRotex 96
Reagente de amplificação por PCR
Tampão fosfato pH 6,8	Xangai yuanye Bio-Tecnologia	R20029-10
Pipetadores e pontas	Thermo Científico	0,1 - 10 μ L, 2 - 20 μ L e 20 - 200 μ L, 100-1000 μ L
qEx-DNA/RNA Kit de extração ou purificação de ácidos nucleicos	TIANLONG	qEx-DNA/RNA
SDS	CapitalBio	441060
Hidróxido de sódio (NaOH)	XILONGS  Científico	XK13-011-00027
CCD	CapitalBio	441050
banho-maria termostático	SURUÍ	HH-W600