Tomografia Serial de Alta Taxa usando um Robô Automatizado de Troca de Amostras

Summary

Os detalhes da implementação e o procedimento de coleta de dados para tomografia de raios X baseada em síncrotron usando o robô automatizado de troca de amostras na linha de feixe Diamond Light Source (DLS) I13-2 Imaging são apresentados e discutidos aqui. Isso melhora drasticamente o throughput e a eficiência da coleta de dados da linha de feixe.

Abstract

Este manuscrito descreve um fluxo de trabalho para coleta automatizada de dados que utiliza um braço robótico para troca de amostras, melhorando significativamente a eficiência da coleta de dados. O setup, implementado para imagem de raios X por síncrotron na Fonte de Luz Diamond (DLS) I13-2, linha de feixe de imagem, utiliza um robô para realizar tomografia serial (3D) ou imagem (2D) de alta produtividade. Atualmente, para muitos experimentos, o tempo necessário para troca e alinhamento manual da amostra é comparável ou até superior à duração da própria tomografia. Para maximizar o uso eficiente do tempo disponível de feixe e aumentar o throughput experimental, a automatização da troca e do alinhamento das amostras é essencial. O uso do robô como trocador de amostras pode aumentar o débito em pelo menos 4 a 10 vezes em comparação com procedimentos manuais, dependendo do tamanho do pixel escolhido. Com a máquina Diamond II e as atualizações I13L beamlines Operando Coherent TOmography e Ptychographic Imaging (OCTOPI), o aumento do fluxo de raios X reduzirá ainda mais os tempos de varredura experimentais, tornando o sistema ainda mais eficiente. Além disso, a automação possibilita a coleta remota de dados, incluindo um serviço opcional de envio por correspondência para os usuários. O centralizamento automatizado de amostras permite uma varredura totalmente desatendida, que pode ser realizada remotamente. Isso representa uma característica única e inovadora do sistema. Este manuscrito descreve todo o procedimento, incluindo preparação da amostra, montagem em suportes especializados, transporte até a linha de feixe e colocação nas bandejas dedicadas para troca robótica de amostras. O procedimento para centralização automatizada da amostra e o subsequente pipeline de reconstrução tomográfica são apresentados.

Introduction

A automação tem sido amplamente utilizada nas indústrias de manufatura pesada há^{décadas 1, 2, 3}. No entanto, o desenvolvimento de hardware e software robótico amadureceu o suficiente para que possa lidar com tarefas muito delicadas, como sequenciamento genômico, realização de cirurgias médicas em hospitais ou assistência na execução de experimentos de química 4,5,6,7. A automação não só elimina erros humanos, mas também melhora o débito e a eficiência⁴.

Uma fonte de raios X sincrotron gera radiação eletromagnética extremamente brilhante e altamente coerente na ampla faixa espectral, do infravermelho aos raios X duros. Essas fontes permitem experimentos de imagem de alta capacidade e alta resolução com tempos de varredura muito curtos e estatísticas elevadas. A coerência parcial pode ser utilizada para alcançar melhor contraste em materiais macios de baixa absorção, como polímeros ou amostras de tecido ^8,9,10, em comparação com fontes de raios X de laboratório. Um conjunto completo de dados de tomografia por raios X – que permite a visualização de um objeto em 3D real – requer a aquisição de projeções da amostra em diferentes ângulos. Avanços no brilho da fonte, hardware experimental e controles permitem tempos de coleta de dados na faixa de dezenas de segundos a^{minutos 8}. Como resultado, o carregamento e o alinhamento da amostra se tornaram mais demorados do que a própria tomografia ^11,12. É importante notar que trocar amostras manualmente em um experimento de tomografia síncrotron pode levar um tempo significativo (em comparação com o tempo de varredura), já que um procedimento de segurança radiológica precisa ser seguido ao entrar e fechar a cabine experimental. Esse procedimento normalmente leva vários minutos. Além disso, o alinhamento da amostra também pode levar alguns minutos.

Se esse processo de troca e alinhamento da amostra for automatizado, uma quantidade significativa de tempo será economizada. Portanto, um robô mutador de amostras foi implementado na linha de feixe I13-2 Imaging da instalação de sincrotrôn DLS. Este manuscrito descreve o protocolo completo de realização de um experimento de microtomografia de raios X por síncrotron com múltiplas amostras usando um robô cambiador de amostras na linha de feixe I13-2 Imaging^11,12. Essa implementação não só melhora a eficiência do tempo experimental, como também permite que experimentos sejam realizados remotamente. A alternativa é operação manual ou semi-automatizada, ambas significativamente mais lentas. Aqui, semi-automatizado significa usar o robô apenas para troca de amostras, sem alinhamento da amostra.

A importância da automação é reforçada por projetos de automação em outras linhas de feixe de imagem síncrotron, com os projetos mais semelhantes na linha de feixe 2BM do APS¹³, na linha de feixe SLS^{TOMCAT 14}, na linha de feixe EMBL P14 na PETRA III¹⁵ e na linha de feixe IMAGE no Instituto de Tecnologia de Karlsruhe (KIT) Light^{Source 16}. No APS 2-BM, as amostras que exigem escaneamento com um robô são montadas em um suporte cinemático padrão, que é colocado em uma bandeja de trocador de amostras com capacidade máxima de 60 amostras por vez. Um braço de pega então pega a amostra e a monta no estágio de rotação. No entanto, o alinhamento da amostra é feito offline usando um estereoscópio. Um sistema semelhante foi instalado na linha de feixe TOMCAT no SLS, exceto que aqui o processo é totalmente automatizado, podendo realizar descarregamento de carga da amostra, alinhamento, varredura de uma região de interesse correta e reconstrução. O número total de amostras que podem ser escaneadas de cada vez é 60. Recentemente, a linha de feixe P14 na PETRA III¹⁵ instalou um sistema de troca de amostras que pode lidar com amostras biológicas macias de tamanho da ordem de 1 mm. O posicionamento e o centralizamento são feitos pelo procedimento de centralização de três cliques. Na linha de feixe IMAGE do KIT, uma estação terminal de imagem/tomografia de alta taxa permite a medição de até 1.500 amostras em dois^{dias 16}. Diferente dos sistemas robóticos mencionados acima, o sistema de linha de feixe I13-2 Imaging atualmente pode lidar com amostras de até 8 mm de diâmetro e medir até 112 amostras em um turno de oito horas, sem intervenção humana, incluindo centralização automática de amostras.

O sistema atual de tomografia no I13-2, Diamond-Manchester Imaging beamline, foi relatado na publicação^{mencionada 17}. Para completude, aspectos-chave dos experimentos de tomografia são resumidos aqui; por favor, consulte também a Figura 1. A pilha do estágio tomográfico consiste em um hexápode (PI miCos) para manipulação da amostra, bem como para alinhamento do eixo de rotação e inclinação. Um estágio de rotação com suporte de ar é montado no topo do hexápode. O estágio de rotação apresenta excelentes movimentos de oscilação (<2,4 μrad) e erro axial (<100 nm). O sistema de detectores de tomografia é equipado com quatro diferentes ampliações (ou campo de visão). Para o estudo atual, foram usados objetivos de 1,25× (tamanho efetivo de pixel de 2,6 μm com campo de visão de 6,7 mm x 5,6 mm) e 4× (tamanho efetivo de pixel de 0,81 μm com campo de visão de 2,1 mm x 1,8 mm). O objetivo de 1,25× tinha um cintilador LuAg:Ce de 500 μm, enquanto o objetivo 4x tinha um cintilador LuAg:Ce (Crytur) de 100 μm. Um detector sCMOS (pco.edge 5.5) registra a imagem da tela de cintilação ampliada por meio de um ocular fotográfico adicional 2x (todas as ópticas de microscópio são da Olympus). Os pixels efetivos variam de 2,6 μm a 0,33 μm, com cerca de 1 μm de resolução na maior ampliação utilizada. O chip detector consiste em 2560 x 2160 com tamanho de pixel de 6,5 μm, e a taxa máxima de leitura do array de pixels é de 100 Hz.

Protocol

NOTA: Este estudo utiliza espécimes de insetos do Museu de História Natural (NHM), Londres, para análise fenotípica comparativa. Os espécimes haviam sido adquiridos pelo Museu de História Natural, seguindo procedimentos padrão de aquisição para garantir que os espécimes tivessem sido coletados e doados legalmente.

1. Planejamento do experimento

1. Verifique a viabilidade de realizar experimentos de tomografia ou imagem com a amostra de interesse na linha de feixe I13-2 entrando em contato com a equipe da linha de feixe usando o seguinte link: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Imaging-and-Microscopy/I13-2/Staff.html .
2. Envie uma proposta para obter um horário para realizar o experimento planejado usando o seguinte link: https://www.diamond.ac.uk/Users.html.
3. Discuta a preparação da amostra e o processo de medição da amostra com a equipe da linha de feixe assim que a proposta for aceita e o experimento agendado. Experimentos realizados com o robô possuem certos requisitos, que são fornecidos na próxima seção (seção 2).
4. Discuta as dimensões e a composição da amostra com a equipe da linha de feixe para verificar se o experimento pode ser realizado com sucesso na linha de feixe.
5. Comece a se preparar para a visita experimental com bastante antecedência, seguindo as instruções do site (https://www.diamond.ac.uk/Users.html).
6. Conclua o treinamento de segurança antes da sessão experimental.

2. Preparação de amostras (para experimentos com robôs)

1. Prepare as Bases de Amostra Compatível com^{SPINE-SINE 18} para montagem da amostra. Monte cada amostra em uma base padrão estilo SPINE, equipada com um código de barras Data Matrix para permitir o rastreamento automatizado da amostra.
2. Fixe a amostra na base usando uma de duas configurações. Montagem de pinos: Fixe a amostra em um pino de amostra no estilo SPINE (veja a Figura 1C, inserido). Montagem direta ou recipiente: Coloque a amostra dentro de um recipiente compatível, como um tubo de microcentrífuga/tubo de poliimida, ou diretamente sobre a base da amostra.
3. Verifique a compatibilidade dimensional com o pinça robótico verificando que a amostra montada se enquadra nos envelopes de tamanho permitidos para garantir o manuseio robótico seguro (veja a Figura 2):
   Opção A: Encaixa dentro de um cilindro de 8 mm de diâmetro x 20 mm de altura.
   Opção B: Cabe dentro de um cilindro de 3,5 mm de diâmetro x 33 mm de altura.
4. Certifique-se de que ambas as configurações estejam centralizadas na base da amostra. Certifique-se de que a altura total (amostra + montagem + base) não exceda 27 mm ou 40 mm, dependendo da configuração escolhida.
5. Ao montar amostras em pinos de amostras SPINE, certifique-se de que a amostra esteja posicionada no topo do pino, sem que nenhuma parte dela fique oculta pelo eixo do pino. A amostra deve ser montada vertical e centralmente na base do pino para evitar contato com o robô gripper. Isso é particularmente importante para a montagem da Opção B descrita na seção 2.3 do protocolo, assim como para amostras alongadas que são montadas sobre os pinos da amostra.
6. Ao montar dentro de recipientes ou tubos, fixe a amostra firmemente dentro do recipiente para que não se mova durante o transporte ou manuseio robótico. Certifique-se de que o recipiente permaneça alinhado verticalmente na base da amostra.
7. Fixe o elemento de montagem escolhido (pino ou recipiente) de forma segura e vertical sobre a base da amostra para garantir a estabilidade posicional durante todo o experimento.
8. Use um adesivo ou método de fixação confiável para evitar descolamento durante o transporte e manipulação automatizada, pois ambos os processos podem introduzir tensões mecânicas.
   NOTA: Adesivos comuns incluem cianoacrilato (supercola), cera de parafina e cola termofusível. Consulte a equipe da linha de feixe se tiver dúvidas sobre a compatibilidade do material.
9. Verifique se todas as amostras estão posicionadas em uma altura consistente a partir da borda superior do recipiente ou no pino da amostra. Para amostras montadas dentro de recipientes, certifique-se de que a distância lateral em relação à parede do recipiente seja a mesma em todas as amostras.
   NOTA: O posicionamento consistente é essencial para um alinhamento automático confiável. Amostras menores em relação ao campo de visão permitem maior tolerância.
10. Documente o código da Data Matrix associado a cada amostra para garantir a identificação correta da amostra durante a análise dos dados.
11. Gerar um arquivo samples.csv para relacionar cada nome de amostra ao seu código matricial de dados base de amostra e para passar os parâmetros relevantes para a execução de tomografias.

3. Embalagem e entrega de amostras

1. No máximo 15 dias úteis antes da sessão experimental, submeta a avaliação de risco experimental (ERA) e declare todas as amostras ali. Esse ERA precisa ser aprovado pelo grupo de saúde e segurança (HSE) do DLS antes que as amostras sejam autorizadas a serem enviadas/trazidas para o local.
2. Use a base universal de amostra com o compartimento combinado de armazenamento e/ou contêiner de transporte montado no pino da amostra, também chamado Uni-puck. Isso é bastante importante se for enviado pelo correio.
3. Se as amostras não caberem nas ranhuras do recipiente de armazenamento mencionado no passo 3.2, por favor, faça arranjos alternativos de montagem, como o uso de tampas magnéticas de proteção que se ajustem à base da amostra e tragam diretamente as amostras para medições.

4. Configuração experimental

1. Ajuste os parâmetros da fonte de raios X para maximizar o contraste na amostra. Para isso, desloque todo o espectro e/ou filtre o espectro de raios X.
2. Otimize a câmera para a distância de amostragem com base no espectro de raios X e no grau de contraste de fase desejado para uma determinada amostra.
3. Selecione a ampliação do microscópio com base no tamanho da amostra e no campo de visão necessário, e selecione o objetivo correspondente do microscópio.
4. Alinhe a posição horizontal da câmera (eixo x no laboratório) em relação ao feixe de raios X.

5. Carregamento e alinhamento da amostra

1. Verifique as amostras e a montagem da amostra cuidadosamente no início de cada sessão experimental para detectar quaisquer amostras que pareçam danificadas ou montadas de forma frouxa. Informe os usuários sobre quaisquer amostras desse tipo.
   NOTA: Atualmente, a linha de feixe está equipada com suportes para até 7 discos, e cada disco pode comportar até 16 amostras. Um total de 112 amostras pode ser medido durante uma única operação robótica. Por favor, consulte a Figura Suplementar 2, que ilustra como identificar as posições do slot (pinos) do disco.
2. Monte amostras nos respectivos slots de puck e puck (pinos) identificados no arquivo samples.csv. Realize um ensaio geral do procedimento de troca de amostras robóticas em algumas amostras para testar o funcionamento do robô, além de garantir que as amostras estejam dentro das especificações exigidas.
3. Use uma base de amostra com um pino de amostra (sem amostra) para alinhar o eixo de rotação do estágio de rotação com o centro do detector na direção horizontal.
4. Mova o topo do pino para o centro da câmera de raio-X (Figura 3A). Alinhe a câmera do telescópio (TC), que está posicionada a 90° em relação ao feixe, como mostrado na imagem (Figura 3), para ficar no centro do campo de visão (FOV). Determine as coordenadas dessa posição em coordenadas de pixel TC.
5. Atualize a posição do alvo da amostra no script que lida com o alinhamento da amostra.
6. Monte uma amostra representativa. Execute o script automático de alinhamento de amostras para colocar a amostra no centro de rotação do TC. O link para o script está fornecido no Arquivo Suplementar 1.
7. Verifique se a região amostral de interesse (ROI) está centrada no campo de visão (FOV) da câmera de raios X.
8. Se o ROI não estiver centralizado no campo de visão, repita os passos 5.5 a 5.7 e refina o alinhamento da amostra mudando as coordenadas para a posição alvo.
   NOTA: As seções 4 e 5 são realizadas pelo contato local, exceto a seção 4.2.

6. Configuração de aquisição de dados

1. Verifique se a estrutura de arquivos/pastas necessária no sistema de arquivos DLS foi criada para armazenar dados brutos, arquivos de metadados e resultados de análise.
2. Copie o arquivo samples.csv para a pasta mencionada no passo 6.1.
3. Atualize o tempo de exposição da câmera e o número de projeções para adquirir no samples.csv, com base na estrutura da amostra e no contraste desejado.
4. Defina dois grupos de posições motoras chamadas Posição de Carga (LP) e Posição de Varredura (SP). LP é o conjunto onde os estágios são otimizados para o carregamento da amostra, e o SP para tomografia da amostra.
   NOTA: A Seção 6 é realizada pelo contato local ou criada automaticamente pelos sistemas DLS.

7. Realização de coleta de dados

1. Monte todas as amostras nas posições corretas do disco e dos pinos, conforme instruído no arquivo samples.csv.
2. Para a coleta de dados, utilize o banco de trabalho Generic Data Acquisition (GDA), um software de código aberto desenvolvido pela DLS (https://alfred.diamond.ac.uk/documentation/manuals/GDA_User_Guide/master/introduction.html). É um sistema baseado em Java usado no DLS para controlar experimentos e coletar dados. Uma captura de tela é fornecida na Figura Suplementar 1.
3. Use um objeto chamado tomomatic no GDA para troca automática de amostras, alinhamento e medição por tomografia.
4. Emita o comando tomomatic.load (/dls/i13/data/year/... samples.csv) no terminal GDA para carregar o arquivo. Então dê o tomomatic. escaneie () para executar o comando.
5. O robô primeiro pega a amostra da bandeja de carregamento e a leva ao leitor de códigos de barras a laser. Uma vez que o código de barras é lido, ele move a amostra para a etapa de tomografia e a monta. Garanta que todo o processo ocorra sem problemas.
   NOTA: Aqui, um robô Yaskawa com o gripper de flexão desenvolvido internamente está sendo utilizado.
6. Uma vez realizada a carga da amostra, os estágios se movem para a posição SP. Em seguida, a função autoCentrePin dentro do script tomomatic é executada, que coloca a amostra no Centro de Rotação (COR). A medição por tomografia de raios X com um trocador robótico de amostras já está pronta para ser realizada.
   NOTA: Por favor, verifique o Arquivo Suplementar 1 para o pseudocódigo do script tomomatic.
7. Realize a função TomoFlyscan para a medição da tomografia. A função primeiro coleta 40 imagens de projeção sem feixe de raios X, chamada de imagem escura (DI), e 40 imagens com feixe de raios X, mas sem amostra no feixe, chamada de imagem de campo plano (FI). Essas imagens serão usadas para normalização durante a reconstrução de dados.
8. Colete imagens de Projeção (PI) com a amostra no feixe em intervalos de ângulo de rotação da amostra, conforme indicado no arquivo samples.csv. No caso presente, possui 3001 imagens PI.
   NOTA: Todos os passos, de 7.5 a 7.8, seguem um após o outro sem qualquer intervenção humana.

8. Acesso aos dados e análise

1. Acesse os dados salvos navegando pelo sistema de arquivos e a pasta apropriados. Os dados escaneados mencionados na seção anterior são salvos em dois arquivos diferentes, um com *.nxs e um arquivo *.hdf, sendo * um número numérico, por exemplo: 123456.nxs e 123456.hdf. O NXS contém os metadados para a varredura, enquanto o HDF contém todos os dados de imagem de projeção (dados vinculados do NXS).
2. Use o pipeline de reconstrução^{Savu 19} para gerar fatias 2D a partir de imagens de projeção.
3. Acesse e visualize as imagens reconstruídas usando softwares de renderização 3D, como AVIZO/ImageJ.
   NOTA: A conclusão das seções 7 e 8 requer ações coordenadas tanto dos usuários quanto dos contatos locais, com subetapas individuais realizadas por cada um.

Results

A Figura 1 mostra o robô mutador de amostras Yaskawa GP7 instalado na linha de feixe Diamond I13-2 Imagem. A Figura 1A mostra o robô (1) e o pinça de flexão projetado internamente (2). Esse gripper pode conter uma amostra com diâmetro de ≤ 8mm. A Figura 1B mostra o robô (1) e o sistema de óptica/câmera de raios X (4) e (6) usados para adquirir dados de tomografia. O robô pinça pega a amostra da bandeja de amostras (3), que pode conter 7 uni-pucks com 16 amostras em cada, conforme mostrado na Figura 1C. As amostras são montadas no cavilho de alumínio (5), e a aquisição dos dados da tomografia é realizada com o sistema detector (6). Os detalhes de (5) e (6) são fornecidos no último parágrafo da seção introdutória. A linha vermelha quebrada na Figura 1B indica a direção do feixe de raios X.

Detalhes do esquema de montagem da amostra e do design do gripper de flexão são ilustrados na Figura 2. A Figura 2A mostra uma amostra plástica cilíndrica, fabricada por impressão 3D, colada na base da amostra. O limite da amostra representa o envelope da altura máxima da amostra e o diâmetro. As setas vermelhas indicam a posição onde o gripper de flexão segura a base da amostra para movê-la da bandeja de amostras para a etapa de tomografia e vice-versa. Um design 3D do gripper de flexão é mostrado na Figura 2B. Os dedos do pinhador são acionados por um tubo de acionamento pneumático (Figura 1B, item 2). O espaço central no gripper tem um diâmetro de 8,9 mm, como mostrado na Figura 2C, permitindo um tamanho máximo de amostra de 8 mm com margem de ~1 mm. A Figura 2D mostra a imagem do topo da etapa de tomografia. Uma cavilha de alumínio é montada sobre os dois estágios ortogonais e um disco magnético, que possui um diâmetro exato de modo que a reentrância na parte inferior da base da amostra se encaixa. Como esse disco é magnético, ele mantém a base da amostra montada firmemente no lugar durante as medições da tomografia.

Para este experimento representativo, 64 amostras de insetos fornecidas pelo Museu de História Natural (NHM) em Londres foram selecionadas. Os espetáculos foram selecionados para representar uma variedade de fenótipos de artrópodes, ajustando-se às limitações de tamanho do gripper. Como os artrópodes, especialmente os insetos, representam a grande maioria da diversidade de espécies conhecidas, com mais de 1 milhão de espécies nomeadas, eles são particularmente desafiadores de amostragem para estudos comparativos de fenótipo. A amostra atual, portanto, demonstra o potencial dessa abordagem ao amostrar três clados de artrópodes em nível de classe: Arachnida, Entognatha e Insecta, além de amostrar mais finamente dentro de insetos para capturar variações em sete ordens, incluindo quatro das ordens mais ricas em espécies vivas atualmente. Os espécimes eram fixados a um cartão com adesivo. As placas então eram montadas nos pinos de amostras. A montagem de amostras (insetos) diretamente nos pinos da amostra é evitada, pois uma estrutura altamente absorvente no feixe com amostras de baixa absorção criará artefatos de riscas durante as reconstruções, além da dificuldade de fixá-las de forma segura nos pinos da amostra. A Tabela 1 mostra o arquivo samples.csv modelo que o usuário preencherá com os parâmetros necessários para a tomografia (colunas A, B, C, E, F, G, H, K). A descrição de cada uma das colunas é fornecida na tabela. As colunas D, I, J e L na input_file são preenchidas após o alinhamento e otimização dos parâmetros da tomografia na linha do feixe. Todas as 64 amostras foram inicialmente medidas com um objetivo de 1,25x (FOV de 6,7 mm x 5,6 mm) em uma distância otimizada de propagação dos raios X (da amostra ao detector), e posteriormente as mesmas amostras foram medidas com um objetivo 4x usando seus próprios parâmetros otimizados. Uma vez que as amostras são carregadas na bandeja e a cabine experimental está fixada, a varredura é iniciada com GDA.

O alinhamento automático da amostra era realizado por um script escrito em Python (Localização do arquivo no GitHub: https://gist.github.com/ndg63276/9b3c5cfe7db26b14930dff3ef889e2bc). No início, o alinhamento da amostra é configurado usando uma base de amostra e uma combinação de pino de amostra, sem a amostra. A Figura 3 mostra o pino da amostra, visto pela câmera do telescópio lateral (câmera posicionada a 90° em relação ao feixe de raios X - Figura 1B, item 4), que é usada como amostra padrão de alinhamento. A imagem da câmera do telescópio é binarizada para que a amostra possa ser detectada a partir do fundo. As bordas da amostra são determinadas e marcadas como um limite branco, como mostrado na Figura 3. A posição de coordenada de referência da amostra é o topo do pino marcado como um círculo branco no inserto da Figura 3A. Observando a imagem de raios X, o ROI da amostra é posicionado no COR, e a posição necessária das coordenadas do alvo, marcada como uma seta azul com duas cabeças cruzadas e um ponto vermelho (Figura 3B), é determinada na câmera lateral. Essa configuração de posição alvo permite posicionar a amostra não apenas no COR, mas também alguns mm acima/abaixo ou um pouco descentrada, se necessário. Após a amostra ser carregada na etapa de tomografia, a função automática de centralização é executada. O script primeiro move a amostra para a posição alvo (Figura 3B) e vai para 0°. Em seguida, ela move a amostra para 90° (Figura 3C) e determina quanto de amostra precisa ser movida para colocar a amostra no centro de rotação (COR). Isso geralmente leva cerca de 15-20 segundos. A amostra agora está no COR (Figura 2D), e o COR já foi alinhado com o centro da câmera. O sistema já está pronto para aquisição de tomografia.

Neste estudo com insetos do NHM, 128 tomografias foram realizadas sem intervenção humana. A medição levou um total de 17 horas. Cada exame durou cerca de 8 minutos. Um experimento assim sem o uso do robô levaria cerca de 20 a 25 minutos por tomografia. Isso implica que tomografias com robôs são 3 a 4 vezes mais rápidas do que a varredura manual no caso atual. A Tabela 2 mostra um arquivo de log típico gerado ao final de uma varredura batch robótica, incluindo os parâmetros necessários para vincular cada número de varredura à sua amostra correspondente. Detalhes adicionais são fornecidos na legenda da Tabela 2 .

A Figura 4 mostra imagens de projeção normalizadas de uma das amostras, um inseto (Classe – Insecta, ordem – Coleoptera), fotografado durante o experimento de tomografia mencionado acima com ampliação 1,25x e 4x. A linha superior, Figura 4A-C, mostra uma amostra imaginada com 1,25x, e então a mesma amostra foi fotografada com 4x, ou seja, Figura 4D-F. A Figura 4 A–F mostra as imagens de projeção adquiridas em 0°, 90° e 180°. O retângulo amarelo mostra o campo de visão das imagens de projeção ampliadas que são adquiridas com um objetivo 4x. É importante notar que, uma vez carregadas as amostras na bandeja mostrada na Figura 1C, todos os processos prosseguiram sem qualquer intervenção humana. Por favor, note que essas duas varreduras foram feitas com ~8,5 horas de diferença. Isso indica a estabilidade e a reprodutibilidade do sistema.

A Figura 5 mostra fatias horizontais ou transversais do conjunto de fatias de reconstrução tomográfica da amostra mencionada na Figura 4. Tanto as fatias 1,25x (Figura 5A) quanto 4x (Figura 5B) são plotadas sem cortar as imagens e têm 2510 x 2510 pixels. Os cortes estão bem centralizados dentro do campo de visão, o que mostra que é possível dar zoom em uma região com maior ampliação sem a necessidade de intervenção física.

Os resultados apresentados aqui demonstram que implementar um sistema robótico para troca de amostras em experimentos de microtomografia sincrotron oferece várias vantagens significativas. Essas incluem maior produtividade, maior eficiência operacional e a capacidade de realizar varreduras em múltiplas ampliações (zoom-in) sem necessidade de intervenção humana. Considerando o número de amostras que precisam ser escaneadas, como no estudo do NHM apresentado aqui, seria impossível obter conclusões estatisticamente robustas e consistentes por meio da varredura manual.

Figura 1: Imagem do robô e do sistema experimental de tomografia instalado na linha de feixe I13-2. (A) O robô (1) com uma garra de flexão projetada internamente (2). (B) A bandeja de carregamento da amostra (3) e a etapa de tomografia (5). A câmera óptica (câmera telescópica), indicada como (4), é usada para alinhar as amostras no COR. O sistema detector (6) usado para medição contém múltiplos objetivos motorizados para alterar automaticamente o campo de visão, além de um detector pco.edge 5.5. A seta tracejada vermelha representa a direção do feixe de raios X. (C) Imagem da bandeja de carregamento de amostras com 7 discos, e cada disco pode comportar até 16 amostras montadas em uma combinação de base e pinos de amostra. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2: Detalhes do esquema de montagem da amostra e do design do gripper de flexão. (A) Imagem de uma amostra de plástico fictícia impressa em 3D montada em uma base de amostra, representando o envelope máximo da amostra que pode ser manuseado pelo gripper de flexão. As setas vermelhas indicam a posição onde o gripper segura a base da amostra. (B) Projeto 3D do gripper de flexão. Os dedos do gripper são acionados para segurar ou liberar a base da amostra. (C) Desenho da seção vertical do gripper com dimensões. A abertura máxima no centro é de 8,9 mm; portanto, o tamanho máximo permitido da amostra é ≤ 8mm. (D) Imagem do topo da etapa de tomografia. Uma vareta de alumínio (indicada pela seta azul) está montada no topo dos dois estágios ortogonais. Um disco magnético é fixado no topo do cavilha, sobre o qual a base da amostra (com a amostra) é posicionada pelo gripper. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 3: Imagens do gráfico de vídeo do procedimento de alinhamento COR usando a câmera do telescópio lateral. (A) Imagem do pino de alinhamento pouco antes do início da rotina de alinhamento. A posição alvo é cruz azul de duas cabeças com ponto vermelho central, coincidindo com a COR da fase de rotação da tomografia. O inserto mostra a imagem ampliada do topo do pino mostrando o centro da amostra detectado, tanto em altura quanto em largura. (B) Pino alinhado à posição alvo em 0°. (C) Pino girado para 90°, e está fora da posição do alvo. (D) Pino alinhado à posição alvo a 90°. Agora o pino está alinhado em ambas as direções ortogonais; portanto, a amostra girará no centro da câmera. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 4: Imagens de projeção normalizadas de um inseto coletadas com objetivos de 1,25x e 4x. O inseto pertencia à classe Insecta, ordem Coleoptera. Isso representa dois dos 128 tomografias. O inseto foi colado em um papel e preso ao alfinete da amostra. Imagens de projeção com objetivo de 1,25x estão em (A) 0°, (B) 90°, (C) 180°, e com 4x em (D) 0°, (E) 90° e (F) 180°. O conjunto de tomografias 1,25x e 4x foi coletado em uma única sessão sem intervenção humana. Um conjunto de imagens com 1,25x oferece uma visão completa da amostra, e um conjunto de imagens 4x mostra capacidade de zoom. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 5. Comparação de uma fatia tomográfica idêntica adquirida usando dois campos de visão diferentes. Uma única fatia reconstruída a partir da tomografia das imagens de projeção exibidas na Figura 4 para (A) 1,25x e (B) ampliações 4x. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Tabela 1: Arquivo típico de samples.csv que o usuário fornece contendo parâmetros de tomografia. Esse arquivo é lido pelo script tomomatic em Python usado para aquisição de dados. As colunas A (descrição da amostra), B (ID do disco), C (slot no puck), E (passo de rotação da tomografia), F (número de FI), G (número de DI), H (ampliação a ser usada) e K (prioridade de slot) são preenchidas pelo usuário. As colunas D (tempo de exposição), I (distância de propagação dos raios X entre a amostra e a câmera), J (movimento da câmera através do feixe para posicionar o COR no centro da câmera) e L (código de barras da base da amostra) são preenchidas após o alinhamento e a otimização preliminar. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Tabela 2: Arquivo de log típico de saída salvo como Output_file.txt após todas as amostras terem sido escaneadas. O arquivo reporta todos os parâmetros de entrada e, além disso, fornece o código de barras da amostra escaneada (coluna M), o caminho para os metadados varridos e arquivos de imagem (coluna N) e a posição do motor usado para coletar FI (coluna O). Basicamente, esse arquivo de saída fornece as informações necessárias para a reconstrução e análise dos dados. Como não havia entrada fornecida na coluna A do arquivo de entrada, essa coluna é preenchida com a contagem atual da varredura, junto com os números do puck e dos pinos. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela.

Arquivo Suplementar 1: Pseudocódigo que descreve o script usado para operar o robô como um trocador de amostras. O arquivo descreve a rotina para montagem automática da amostra, leitura do código da Data Matrix, alinhamento automático da amostra e execução de uma tomografia. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 1: Captura de tela da interface gráfica genérica de aquisição de dados. Essa interface permite o ajuste dos parâmetros básicos da câmera, visualização ao vivo da amostra e início das aquisições de tomografia. As varreduras podem ser iniciadas usando o botão na tela (apenas escaneamento manual) ou pela interface de linha de comando, indicada pelo retângulo amarelo no centro inferior da captura de tela. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Fotografia do disco padrão SPINE (esquerda) e do Puck Cap (direita). As posições dos pinos, mostradas em vermelho, onde as bases das amostras são montadas, são numeradas começando pela posição oposta à ranhura no poste central de sustentação. O número 7267 (marcado em branco) é o número de identificação do disco. A Tampa do Puck pode ser montada no puck para proteger amostras durante o transporte ou armazenamento. Por favor, certifique-se de que os tamanhos das amostras são compatíveis antes de tentar montar a tamponha. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

A preparação e o alinhamento da amostra são dois passos críticos para que o robô automático de troca de amostras funcione corretamente e de forma^{eficaz 11}. O tamanho da amostra e os requisitos de montagem estão fornecidos na Seção 2 (Protocolo). Basicamente, o diâmetro da amostra precisa ser de 8 mm ou menos e estar bem centralizado na base da^{amostra 12}. Essa restrição é definida pelas dimensões do gripper. Além disso, todas as amostras em uma única medição precisam estar na mesma altura para que a posição das amostras no centro de rotação seja consistente em todas as amostras. Se o robô foi alinhado para um experimento, então executar outro experimento com o robô do mutador de amostras é completamente automatizado, exceto para definir a região de interesse da amostra. Isso é explicado na seção de resultados representativos, Figura 3. Também é importante notar que isso faz parte do processo de alinhamento realizado pela equipe da linha de feixe (contato local). Uma vez definida, todas as medições amostrais são realizadas sem intervenção humana. Do ponto de vista do usuário, as medições são completamente automatizadas. Até o momento, apenas bases e pinos de amostra da Molecular Dimensions Ltd são utilizados; no entanto, existem outros fornecedores, como MiTeGen e Hampton Research, que produzem bases de amostras e pinos de amostra no estilo SPINE.

Agarradores maiores para amostras, projetados para conter amostras de até 12 mm de diâmetro, estão atualmente em desenvolvimento e testes. Isso permitirá que o robô manuseie amostras maiores, como aquelas colocadas dentro de tubos de microcentrífuga e montadas em uma base de amostra. Um design aprimorado de pinça poderia envolver um mecanismo que se aproxima da amostra de lado, removendo assim as restrições atuais sobre o tamanho da amostra. Além disso, a atualização da linha de feixe aumentará a taxa de transferência em uma ordem de magnitude, permitindo a varredura de mais de 3.000 amostras por dia. Isso, por sua vez, permitirá a coleta de conjuntos de dados estatisticamente significativos que compreendem aproximadamente 30.000 amostras dentro de 10 dias após o tempo do feixe. Em breve, implementaremos um novo pipeline de reconstrução por tomografia, chamado HTTomo.

Deve-se notar que parâmetros como distância de propagação do feixe (distância da amostra ao detector), tempo de exposição, número de projeções, etc., precisam ser otimizados antecipadamente, como em qualquer outro experimento de tomografia de raios X síncrotron. Outra restrição é que os estágios envolvidos no experimento, como manipulação de amostras em 6 eixos, estágios de tomografia e estágios de manipulação de câmera, precisavam estar em uma posição definida para o carregamento e descarga da amostra. Isso implica que os estágios precisam ser movidos para frente e para trás quando o carregamento e descarga da amostra ocorrem.

Em conclusão, a tomografia de alta capacidade pode ser realizada com a ajuda do robô de troca de amostras, tornando o processo pelo menos 4 a 10 vezes mais rápido e reduzindo ou eliminando o tempo morto em comparação com a operação manual. A automação experimental com robôs também nos permite posicionar pessoal de forma mais eficiente, já que menos pessoas são necessárias para realizar as medições. Medir conjuntos de dados estatisticamente significativos é importante para muitos campos científicos onde é necessário um volume confiável e suficiente de dados para abordar o caso científico. Usar um robô pode ajudar muito nessas tarefas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air-bearing rotation stage	Aerotech, Inc.	https://www.aerotech.com/wp-content/ uploads/2021/01/abrt-data-sheet.pdf	Tomography rotation stage
AVIZO	ThermoFisher scientific		Software comercial de visualização e análise de dados
Cryocap -MiTeGen	MiTeGen LLC	https://www.mitegen.com/product/ reusable-goniometer-base-styles/	Fornecedor alternativo CryoCap
CryoCap-Hampton research	Hampton research	https://hamptonresearch.com/ product-CrystalCap-SPINE-HT-445.html	Fornecedor alternativo CryoCap
Cryocaps( MD7-401) and Cryopins(MD7-410)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions.com/ products/magnetic-cryovials-and-cryocaps	Usado para montagem de amostras
Detector Optics	Olympus/Evident Scientific	https://evidentscientific.com/en/objective-finder? creative=651972731238&keyword =olympus+objectives&matchtype= e&network=g&device=c&campaign id=19865307548&adgroupid=144 087466781&gad_source=1&gad_ campaignid=19865307548&gbraid =0AAAAADMIOOmWDa2WC5VP2 Ngxlqao8dyWe&gclid=Cj0KCQiAhtv MBhDBARIsAL26pjFYUqjLVZ1Miz p2W7eGzD2SEPNTjxiA87Dry6un 1Fx6GplHQjuBR94aAs1xEALw_wcB	Objective e Foto-ocular
GDA	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Users/Experiment -at-Diamond/IT-User-Guide/Software/Data-Acq/GDA.html	Software genérico de Aquisição de Dados
Hexapod	PI miCos GmbH	https://www.physikinstrumente.co.uk/en/pro ducts/6-axis-hexapods-parallel-positioners	Stage de 6 eixos para alinhamento de tomografia e manipulação de amostras
ImageJ	Desenvolvido nos Institutos Nacionais de Saúde, Universidade de Wisconsin	https://imagej.net/ij/	Software de processamento e visualização de imagem de código aberto
pco.edge 5.5 sCMOS camera	PCO (PCO AG / Excelitas Technologies)	https://www.excelitas.com/product-category/ pcoedge-cooled-scmos-cameras	Câmera de raios-X usada para a imagem de tomografia
SAVU	Diamond Light Source Ltd.	https://www.diamond.ac.uk/Home.html ;jsessionid=8977FA8A10694BFA2AA DFD5D0D23B320	Pipeline de reconstrução de tomografia
Scintillators	CRYTUR, spol. S r.o	https://www.crytur.com/materials/luag-ce/	Óptica de cintiladores
Universal V1-puck( Uni-puck)	Calibre Scientific	https://www.moleculardimensions. com/products/uni-pucks-and-accessories	As amostras são montadas no Uni-puck para o robô pegar