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Artigo de método

Síntese de Vesículas Unilamelares Gigantes Compostas: Um Modelo Biomimético de Células Nucleadas

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DOI:

10.3791/68274

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3 de julho de 2025

 ,  , 
1Centre for Research in Nanotechnology & Science, Indian Institute of Technology Bombay, 2Department of Chemistry, Indian Institute of Technology Bombay, 3Department of Chemical Engineering, Indian Institute of Technology Bombay

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um método para a preparação de vesículas unilamelares gigantes compostas (cGUVs) com uma estrutura vesícula em vesícula, com condutividade elétrica personalizada nas regiões interna, anular e externa. A eletroformação sintetiza GUVs simples, que são transformados em estomatócios e cGUVs por meio de choque osmótico, fornecendo um modelo valioso para estudar a biofísica de células nucleadas.

Resumo

Uma vesícula unilamelar gigante simples (sGUV) é uma vesícula esférica de tamanho mícron, composta por uma bicamada lipídica que envolve uma solução aquosa em seu interior e é suspensa em outro meio aquoso. Como modelos biomiméticos de células biológicas, os sGUVs são sistemas bem estabelecidos para estudos biofísicos. No entanto, os sGUVs imitam principalmente células anucleadas, limitando sua aplicação como modelos para células não nucleadas. Propomos vesículas unilamelares gigantes compostas (cGUVs) como um modelo biomimético mais apropriado para células nucleadas. cGUVs são estruturas vesículas em vesículas, onde as bicamadas de vesículas externas e internas podem ser assumidas como representando a célula e a membrana nuclear de uma célula, respectivamente.

Neste estudo, descrevemos um método simples para a síntese de cGUVs. Resumidamente, os sGUVs foram gerados usando a composição lipídica de DMPC e colesterol na faixa de 37-43 mol% em meio de sacarose por meio do método de eletroformação. Esses sGUVs foram então submetidos a choque osmótico pela introdução de uma solução hipertônica de glicose, desencadeando uma transição imediata para uma forma somatocítica. Esse processo levou à formação de um estado intermediário em que as vesículas externa e interna permaneceram conectadas por meio de um pescoço, resultando no desenvolvimento de uma estrutura vesícula em vesícula, conhecida como cGUVs.

Além disso, sabe-se que GUVs preparados com níveis mais elevados de colesterol na bicamada exibem permeabilidade iônica reduzida. Essa característica permite o ajuste da condutividade na solução anular de um cGUV ajustando as condutividades do meio hidratante, da solução interna por meio da glicose hipertônica e da solução externa pelo ajuste da diluição ou adição de meio condutor, fazendo com que os cGUVs resultantes tenham condutividades controladas nas regiões externa, anular e interna, relevantes para estudos de campo elétrico. Propomos esta abordagem eficiente e direta para sintetizar vesículas compostas que podem ser usadas como modelo biomimético para células nucleadas eucarióticas, avançando sua aplicação em pesquisas biofísicas.

Introdução

Modelos biomiméticos têm sido extensivamente empregados para estudar os complexos fenômenos biofísicos das membranas celulares. Esses modelos biomiméticos mais simples fornecem informações valiosas, minimizando a interferência da miríade de variáveis presentes nas células biológicas. As vesículas unilamelares gigantes (GUVs) são um sistema biomimético fundamental usado para estudar a biofísica da membrana 1,2. Os GUVs estão bem estabelecidos como um modelo representativo da membrana celular. Eles compreendem uma única bicamada lipídica esférica de tamanho 10-30 μm de diâmetro e são encapsulados e suspensos em uma solução aquosa. Neste artigo, chamamos esses sGUVs. Esses sistemas são construídos usando uma abordagem de baixo para cima, onde componentes celulares essenciais - lipídios, proteínas e catalisadores - são montados para imitar a estrutura e a função das membranas biológicas 3,4.

Embora sGUVs simples, com apenas o núcleo aquoso dentro, sejam comumente usados, modelos mais avançados foram desenvolvidos para replicar características específicas de células biológicas. Por exemplo, GUVs com estruturas suportadas por actina emulam o citoesqueleto 5,6,7, enquanto ambientes com alto teor de sal são usados para imitar condições fisiológicas. Os ambientes com maior teor de sal imitam as condições fisiológicas, mas é difícil obtê-los em GUVs, uma vez que os métodos tradicionais, como a eletroformação 8,9, são frequentemente inadequados para sintetizar GUVs de tamanho mícron sob tais condições. Métodos mais recentes, como o método assistido por gel, que usa géis poliméricos ou de amido para auxiliar no inchaço da bicamada durante a hidratação, abordam essas limitações10,11. Da mesma forma, as mudanças morfológicas dos sGUVs foram estudadas12. A adição de filamentos fechados e abertos, como actina encapsulada, microtúbulos e outros componentes do citoesqueleto, de rigidez variável, e a condição de estresse osmótico dentro deles influenciam a transição morfológica dessas vesículas osmoticamente esvaziadas, mas inicialmente quase esféricas. A análise teórica revela diversas transformações morfológicas, incluindo estruturas tubulares, esféricas, semelhantes a raquetes, cerejas e gotículas, alinhando-se bem com observações experimentais12. Essas descobertas têm implicações significativas para a compreensão da organização de filamentos, microtúbulos e nanoanéis dentro de células e vesículas. Outros estudos revisam métodos para encapsulamento de proteínas e exploram como a actina encapsulada, os microtúbulos e os componentes do citoesqueleto regulam a forma das vesículas osmóticas desinfladas12,13.

Além disso, inspirados na arquitetura celular eucariótica, modelos complexos baseados em GUV são desenvolvidos para o desenvolvimento de modelos artificiais semelhantes à fissão e divisão celular, reprodução e características multicompartimentais de células eucarióticas, células auto-reprodutoras 14,15,16,17 e células multicompartimentais. Além da aplicação estrutural, os GUVs também são os modelos escolhidos para entender a eletroporação celular - um processo em que um campo elétrico aplicado induz a formação de poros na membrana lipídica devido ao estresse de Maxwell. GUVs, com dimensões comparáveis às células biológicas, exibem eletrodeformação e eletroporação sob campos elétricos. Tais estudos sobre GUVs fornecem informações sobre propriedades eletromecânicas, como capacitância da membrana e rigidez à flexão18 e sobre mecanismos de eletroporação2 , 19 , 20 . No entanto, na prática, esses estudos são mais representativos de células anucleadas, como os glóbulos vermelhos (hemácias).

Para preencher essa lacuna, propomos o composto de vesículas unilamelares gigantes (cGUVs) como um novo modelo biomimético para células eucarióticas nucleadas21,22. Essas vesículas possuem uma estrutura vesícula em vesícula, onde a bicamada interna imita a membrana nuclear e a bicamada externa representa a membrana plasmática. Além disso, demonstramos como a condutividade elétrica das regiões interna, anular e externa pode ser modulada sem a necessidade de instrumentação avançada, como micromanipuladores ou microsseringas. Essa abordagem simplificada para sintetizar cGUVs oferece uma plataforma promissora para o avanço da pesquisa biofísica em células nucleadas.

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Protocolo

1. Preparação de soluções de misturas lipídicas

  1. Prepare 1 mL de solução de DMPC e colesterol em uma proporção molar de 63:37 a uma concentração final de 5 mg / mL. Para isso, adicione 149 μL de DMPC (estoque de 25 mg / mL conforme recebido dissolvido em clorofórmio), 252 μL de colesterol (5 mg / mL de colesterol dissolvido em clorofórmio) e 599 μL de clorofórmio.
  2. Prepare outra solução de 1 mL de DMPC: Colesterol em uma proporção molar de 57:43 a 5 mg / mL, misture 139,8 μL de DMPC (estoque de 25 mg / mL conforme recebido dissolvido em clorofórmio), 301 μL de colesterol (5 mg / mL, preparado a partir de pó dissolvido em clorofórmio) e 559,2 μL de clorofórmio.
  3. Para corar a bicamada lipídica, adicione 100 μL de Vermelho do Nilo (de uma solução estoque de 5 mM) a 1 mL da mistura lipídica contendo DMPC e colesterol em uma proporção molar de 63:37 (descrita nas etapas 1.1 e 1.2). Em alternativa, adicione 30 μL de Liss Rhod-PE (1 mg/ml de stock de Liss Rhod-PE) a 1 ml de mistura lipídica preparada (descrita nos passos 1.1 e 1.2).
    NOTA: Como o solvente (clorofórmio) é altamente volátil, após a abertura repetida do frasco para uso da solução estoque (25 mg / mL de DMPC), ele pode se concentrar, o que pode alterar a composição.

2. Protocolo de eletroformação para síntese de vesículas unilamelares gigantes simples (sGUVs)

  1. Limpe completamente as lâminas revestidas com óxido de índio e estanho (ITO) com uma solução de detergente e enxágue com água deionizada (0.055 μS/cm). Limpe as lâminas com solução de etanol 100%, enxágue com água deionizada e seque em estufa a 85 °C.
  2. Identifique o lado condutor das lâminas revestidas com ITO usando um alicânito. Prenda a corrediça revestida com ITO limpa no estágio do revestidor giratório usando um aspirador com o lado condutor voltado para cima.
  3. Aplique 25 μL das soluções lipídicas (preparadas na etapa 1.1) lançando quatro gotículas da solução no lado condutor da lâmina ITO. Em seguida, pegue outra lâmina ITO e aplique 25 μL das soluções lipídicas (preparadas na etapa 1.2) lançando quatro gotas da solução no lado condutor da lâmina ITO.
  4. Seque a vácuo ambas as lâminas revestidas de lipídios em um dessecador que é mantido no escuro por pelo menos 2 h.
    NOTA: A proteção contra a luz protege os lipídios de possíveis alterações químicas.
  5. Disponha uma lâmina ITO revestida com lipídios (revestida com lipídios preparados na etapa 1.1) em paralelo com outras lâminas ITO limpas, com o lado condutor voltado um para o outro, com um espaçador de borracha de silicone de 3 mm de espessura entre elas. Sele o conjunto com uma braçadeira para criar uma câmara de eletroformação segura.
  6. Siga o mesmo procedimento descrito na etapa 2.5 para a lâmina revestida com ITO com solução lipídica preparada na etapa 1.2 para formar uma câmara de eletroformação.
  7. Coloque ambas as câmaras em uma incubadora mantida a 38-40 ° C e encha a câmara com 100 mM de solução de sacarose com a ajuda de uma seringa de 2 mL. Aplique um campo elétrico CA de 5 Vpp na frequência de 10 Hz usando um gerador de função de canal duplo por 4 h.
    NOTA: Certifique-se de que o lado condutor da corrediça ITO esteja corretamente clamped aos clipes de crocodilo que se conectam ao gerador de funções.
  8. Desconecte a câmara de eletroformação do gerador de funções. Remova a câmara da incubadora e deixe-a esfriar até a temperatura ambiente. Colher os sGUVs sintetizados de ambas as câmaras usando uma seringa e transferi-los para um tubo de microcentrífuga de 2 mL e incubar em temperatura ambiente (25-27 °C) por 1 h antes de submetê-los ao choque osmótico.

3. Transição de forma em choque osmótico (sGUV-para-estomatócito-para-cGUV)

  1. Transferir 200 μL de sGUVs suspensos em meio hidratante contendo solução de sacarose 100 mM para uma câmara de observação.
  2. Introduzir 125 μL de solução de glicose (300 mM) nesta suspensão de sGUV contendo 200 μL de sacarose 100 mM dentro da câmara de observação para induzir choque osmótico que inicia a transição de forma dos sGUVs.
    NOTA: Siga o mesmo procedimento (dado na etapa 3) para a síntese de sGUV a partir da composição lipídica fornecida nas etapas 1.1 e 1.2 para a transição de forma acionada por choque osmótico.
  3. Deixar os sGUVs induzidos por choque osmótico repousarem durante 1 h na câmara de observação colocada na fase de microscopia.
  4. Para conduzir e observar a transição de forma do sGUVS, coloque a câmara de observação (câmara de eletrofusão, placa de Petri, lâmina de concavidade ou qualquer outra câmara que possa ser usada para observação microscópica) no palco de um microscópio invertido e permita que as vesículas se assentem.
  5. Monitore as transições de forma que ocorrem dentro da câmara. Use contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia de epifluorescência com objetivas Plan fluor, ELWD 20x/0,45 e Plan fluor, ELWD 40x/0,60 para observar as transições de forma dos sGUVs.
  6. Observe a formação de vesículas estomatocíticas durante a transição. Monitore a câmara ao longo do tempo à medida que vesículas maiores se depositam na parte inferior, seguidas por um número maior de vesículas menores.

4. Modificando a condutividade nas regiões interna, anular e externa de cGUVs

  1. Ajuste a condutividade das soluções em diferentes regiões de cGUVs (interna, anular e externa) adicionando quantidades apropriadas (μL) de uma solução salina estoque de 7,5 mM antes de dar um choque osmótico aos sGUVs.
    1. Por exemplo, para criar maior condutividade nas regiões externa e interna em comparação com a região anular, transfira 200 μL de solução de sacarose para a câmara de eletrofusão. Adicione 20 μL de solução salina a 7,5 mM à câmara. Induza o choque osmótico adicionando 125 μL de solução de glicose a 300 mM.
    2. Deixe os sGUVs em choque osmótico descansarem por 3-4 h. Nesse caso, os cGUVs são obtidos com maior condutividade nas regiões externa e interna do que na região anular na extremidade.
  2. Realize a eletrodeformação de cGUVs aplicando um potencial elétrico CA de 7,5 Vpp a 100 kHz usando um gerador de função em uma câmara de eletrofusão que contém eletrodos de fio espaçados de 500 μm.
  3. Após a aplicação de um campo elétrico CA, capture o vídeo a 10 quadros/s e observe a deformação da forma oblato das vesículas externas e a deformação da forma prolata das vesículas internas, confirmando maior condutividade nas regiões externa e interna do que na região anular nos domínios cGUV.

5. Análise microscópica de cGUVs

  1. Imagem de microscópio invertido: Realize contraste de interferência diferencial (DIC) e microscopia de epifluorescência usando um microscópio invertido e acoplado a uma câmera monocromática. Use DIC e microscopia de epifluorescência com lentes objetivas Plan fluor, ELWD 20x/0.45 e Plan fluor, ELWD 40x/0.60 para observar as transições de forma dos sGUVs. Use um filtro verde (EX 510-560, DM 575, BA 590) para a bicamada de coloração vermelha do Nilo para o estudo de epifluorescência.
    NOTA: As imagens DIC fornecem informações valiosas sobre o status do pescoço conectado, confirmando se ele permanece intacto ou sofre fusão para formar cGUVs.
  2. Use o software ImageJ para inserir uma barra de escala e cortar imagens de microscopia. Para adicionar uma barra de escala, vá para Analisar | Defina Escala para calibrar a imagem e vá para Analisar | Ferramentas | Barra de escala para inserir a barra de escala.
  3. Microscopia confocal para morfologia: Para obter uma compreensão mais clara da morfologia do cGUV, um microscópio confocal de varredura a laser é empregado para varredura do eixo z com um tamanho de passo de 1 μm. Imagem com microscópio confocal: use um microscópio confocal de varredura a laser com uma lente objetiva DIC de óleo Plan-Apochromat 40x/1.3 para obter imagens dos cGUVs. Imagem cGUVs corados com vermelho do Nilo ou rodamina-PE usando um modo vermelho de canal único, com um comprimento de onda de excitação de 561 nm e uma faixa de emissão de 561-695 nm.
  4. Para modificar e extrair o arquivo .czi da imagem no software vinculado ao microscópio, insira gráficos como uma barra de escala e ative a visualização 2D, 3D e vá para Processamento | Preparação | Parâmetros e clique em Aplicar para obter uma imagem no formato JPG.
  5. Preparação para microscopia confocal: encha uma solução aquosa contendo cGUVs em uma câmara personalizada modificada (vidro inferior substituído por vidro de lamínula) para imagens confocais. Deixe a amostra intacta por 10-15 min para permitir que os cGUVs se estabeleçam para imagens confocais; carregue a mistura de cGUVs na lâmina da cavidade e sele com uma lamínula para interromper os movimentos dos cGUVs. Em seguida, analise os cGUVs por meio de microscopia confocal e z-scanning com intervalos de 1 μm.

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Resultados

Os sGUVs foram sintetizados pelo método de eletroformação (conforme mostrado na Figura 1) e colhidos da câmara por meio de seringa. Os sGUVs colhidos foram inicialmente visualizados em microscópio invertido e submetidos a um choque osmótico para induzir sua transformação em forma de estomácito. Após mais remodelação da membrana, este estomatócito é transformado em uma estrutura vesícula em vesícula chamada Vesícula Unilamelar Gigante composta (cGUV) (

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Discussão

A composição e os tipos de lipídios determinam em grande parte as propriedades mecânicas da bicamada que constitui um GUV. Uma bicamada composta de DMPC/Chol exibe transições de forma únicas quando submetida a choque osmótico. Sob um forte choque osmótico hipertônico, o fluido aquoso dentro do sGUV é expelido, levando à deformação da bicamada GUV. As transições de forma observadas são influenciadas principalmente pelo fluxo externo de água e pela rigidez de flexão da bicamada. Essas defo...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Rupesh Kumar agradece ao Ministério do Desenvolvimento de Recursos Humanos (MHRD), Governo da Índia, pela bolsa PMRF e subsídio de contingência. Reconhecemos com gratidão o microscópio confocal de varredura a laser da Central Facility, IRCC, IIT Bombaim.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cholesterol (Sigma grade, 99%)Avanti Polar Lipids, Inc.C8667Para a síntese de sGUV
CholoroformMerck Life Science Pvt. Ltd.DA2P711602usado como solvente para a preparação da solução de estoque de lipídios
DMPCAvanti Polar Lipids, Inc.850345CPara a síntese de sGUV
EthanolHaymanF204325Para limpeza de lâminas de ITO
FITC-DEXTRAN (4 Kda-MW)Sigma-Aldrich466994Para encapsulação dentro das vesículas internas de cGUV
GlucoseSigma-AldrichG-7021Para preparação da solução de glicose, usada para choque osmótico em sGUV suspenso na solução de sacarose
Liss Rhod PESigma-Aldrich810150C-1MGPara colorir moléculas de lipídio
Nile redSigma-Aldrich72485Para coloração da membrana de cGUV e sGUV
Sodium chloride (NaCl)Sigma-Aldrich1936060521Para preparação da solução de estoque de sal, para alterar a condutividade  dos compartimentos cGUV
SucroseSigma-AldrichS9378Para solução de sacarose como meio hidratante da câmara de eletroformação
Equipamentos
Cavitly slidesBlue starsuspensão de cGUV colocada para observação microscópica
cMOS pco.edge 4.2 cameraExcelitas61009524Para imagens monocromáticas fluorescentes e imagens DIC
Cover slip (22 x 60 mm)Blue starPara cobertura de lâminas de cavidade
Eppendrof Electrofusion chamberSigma-Aldrichsuspensão de sGUV colocada na câmara para observação osmótica e microscópica, qualquer outra câmara simples também pode ser usada
Function generator (Dual channel)TektronixAFG3022CGerador de função usado para fornecer campo elétrico AC para a câmara de eletroformação 
Incubatorlocal customisedcâmara de eletroformação colocada a 40?
ITO slidesSigma-Aldrich576352-10PAKLâminas de ITO usadas no método de eletroformação
Nikon Eclipse inverted microscopeNikonTE2000-UPara visualização de sGUV e cGUV
Silicone sheet (3 mm  thickness)Sigma-AldrichGF49463141Para espaçamento na câmara de eletroformação
Syringe (2 mL)Becton Dickinson India Pvt Ltd.300844Usada para injetar um meio hidratante e colher o sGUV da câmara de eletroformação
Zeiss confocal microscopy setupCentral facility of IIT Bombay

Referências

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