Desenvolvimento de um novo crioprotetor com baixo teor de DMSO para preservação de células-tronco do sangue periférico

Resumo

O protocolo utiliza um crioprotetor de células-tronco hematopoiéticas contendo uma concentração muito baixa de dimetilsulfóxido e demonstra sua segurança clínica e eficácia na proteção de células-tronco hematopoiéticas, fornecendo uma nova estratégia para criopreservação de células-tronco hematopoiéticas em transplante clínico autólogo de células-tronco.

Resumo

A criopreservação de células-tronco hematopoiéticas do sangue periférico (PBHSC) é crítica para o transplante autólogo de células-tronco (ASCT), mas os agentes crioprotetores tradicionais (TCPAs) contendo 10% de dimetilsulfóxido (DMSO) levantam preocupações de segurança devido ao risco de toxicidade. Este estudo teve como objetivo validar um novo agente crioprotetor (CPA, 2% DMSO) com baixo teor de DMSO para preservação de PBHSC a -80 °C, eliminando a necessidade de armazenamento de nitrogênio líquido. PBHSCs de seis doadores foram divididos em grupos CPA e TCPA. O CPA foi misturado com PBHSCs (1:1 vol/vol) e armazenado diretamente a -80 °C. O TCPA (10% DMSO + 5% de albumina humana) foi submetido a resfriamento gradual (1 °C/min) e armazenamento de nitrogênio líquido. Após 1 mês, ambos os grupos foram descongelados em banho-maria a 37 °C. A viabilidade celular, a integridade do citoesqueleto (microfilamentos/microtúbulos), a atividade mitocondrial e a capacidade de formação de colônias foram comparadas. Após o descongelamento, a sobrevida do PBHSC foi comparável entre CPA (91,29%) e TCPA (90,07%). No entanto, a CPA superou a TCPA em ensaios de viabilidade celular (CPA: 89,38% versus TCPA: 79,55%; p < 0,05). A análise do citoesqueleto revelou microfilamentos e microtúbulos intactos em células preservadas por CPA, com clareza estrutural superior ao TCPA. A atividade mitocondrial em células tratadas com CPA espelhou PBHSCs frescas, exibindo atividade 8,5% maior que TCPA (p < 0,05) e aumento do número de complexos mitocondriais. Os ensaios de formação de colônias confirmaram ainda mais a superioridade do CPA, com contagens de colônias mais altas após a indução. O CPA permite a criopreservação segura e conveniente de PBHSC a -80 °C usando DMSO ultrabaixo (2%), eliminando a dependência de nitrogênio líquido. Sua viabilidade celular aprimorada e preservação mitocondrial sugerem vantagens clínicas ao reduzir os riscos de toxicidade por infusão. Este protocolo oferece uma estratégia transformadora para o ASCT, otimizando a segurança e a eficiência operacional.

Introdução

O transplante autólogo de células-tronco hematopoiéticas (ASCT) é uma opção de tratamento bem estabelecida para várias neoplasias hematológicas, incluindo leucemia, linfoma e mieloma múltiplo, onde serve como terapia de primeira ou segunda linha para reconstituir a hematopoiese e restaurar a competência imunológica após quimioterapia ou radioterapia intensiva 1,2,3,4,5,6,7 . Os resultados bem-sucedidos do ASCT dependem criticamente da viabilidade das células-tronco hematopoiéticas criopreservadas do sangue periférico (PBHSCs), que devem reter a capacidade funcional de reconstituição hematopoiética e imune 8,9,10,11,12. O armazenamento de células-tronco hematopoiéticas é uma etapa crítica no ASCT porque, após a coleta autóloga de células-tronco hematopoiéticas, os pacientes geralmente são submetidos a radiação, quimioterapia e outras terapias para eliminar as células tumorais. A qualidade do armazenamento de células-tronco hematopoiéticas está diretamente relacionada ao sucesso ou fracasso da reconstituição hematopoiética e imune 13,14,15,16,17,18. Para garantir a viabilidade das células-tronco hematopoiéticas pós-criopreservação, as práticas clínicas geralmente envolvem a adição de albumina no sangue humano e dimetilsulfóxido (DMSO) como CPA. Esses agentes são cruciais para manter a atividade celular durante e após o processo de criopreservação. Normalmente, a concentração de DMSO usada varia de 5% a 10% (v/v). Estudos indicaram que a manutenção de uma concentração de DMSO de pelo menos 3,5% a 10% (v/v) pode aumentar a eficácia da criopreservação de células-tronco hematopoiéticas^19,20. No entanto, a aplicação clínica do DMSO permanece problemática devido à toxicidade dose-dependente, com 30% a 60% dos receptores de transplante relatando efeitos adversos como náuseas, vômitos e hipotensão^21,22. Para abordar as limitações dos agentes crioprotetores convencionais (CPAs) contendo 5% -10% de dimetilsulfóxido (DMSO), este estudo visa desenvolver um novo CPA que permita a criopreservação segura e eficiente de PBHSC a -80 ° C usando concentrações ultrabaixas de DMSO (2% v / v), eliminando assim a necessidade de protocolos complexos de nitrogênio líquido enquanto mitiga a toxicidade associada ao DMSO.

Alternativas emergentes, como CPAs à base de trealose ou enriquecidas com polímeros, mostram-se promissoras pré-clínicas, mas enfrentam barreiras na tradução clínica devido a obstáculos regulatórios ou incompatibilidade com protocolos de descongelamento padrão²³. Em contraste, nosso CPA se baseia no perfil de segurança estabelecido dos sistemas HSA-DMSO, ao mesmo tempo em que introduz taxas de aditivos otimizadas que melhoram a citoproteção. Este método é particularmente adequado para centros clínicos que não possuem infraestrutura de nitrogênio líquido ou que exigem fluxos de trabalho rápidos. No entanto, para armazenamento de longo prazo (>2 anos), o nitrogênio líquido continua sendo preferível²⁴. Os médicos devem equilibrar a simplicidade do protocolo com a tolerância individual do paciente ao DMSO, garantindo a aplicação personalizada dessa estratégia para maximizar a segurança e a eficiência operacional no transplante de células-tronco hematopoiéticas.

Neste estudo, o emprego de crioprotetores com conteúdo reduzido de DMSO representa uma estratégia crucial para preservar simultaneamente a eficácia da criopreservação de células-tronco hematopoiéticas, minimizando a toxicidade associada. A eficácia, segurança e conveniência de um CPA de células-tronco hematopoiéticas recém-desenvolvido foram avaliadas para preservar células-tronco hematopoiéticas do sangue periférico (PBHSCs). Um método simples de congelamento direto utilizando o novo CPA foi implementado, evitando protocolos convencionais de criopreservação. Os resultados demonstram que a criopreservação de uma etapa de suspensões celulares a -80 ° C usando DMSO CPA de baixa concentração atinge efeitos de preservação superiores em comparação com o CPA tradicional (TCPA). Essa abordagem pode oferecer novas estratégias para agilizar o processo clínico de transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH).

Protocolo

Pacientes oncológicos hematológicos submetidos a ASCT foram recrutados de junho de 2020 a junho de 2022 no departamento de hematologia do Shenzhen Cancer Hospital. Amostras de células sanguíneas foram coletadas antes e após a mobilização do transplante para TCTH, incluindo dois casos de leucemia mieloide aguda (LMA), dois casos de linfoma de Hodgkin (LH), um caso de linfoma cutâneo genuinamente histiocítico (CGHL) e um caso de linfoma primário de células B mediastinal (PMBL), com idade mediana de 53 anos e variação de 35 a 61 anos. O estudo recebeu consentimento informado dos pacientes e aprovação do comitê de revisão ética do Shenzhen Cancer Hospital, com o número de documento de aprovação ética AF-SC-07-2.0. Todos os procedimentos experimentais em animais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Animais Experimentais, Hospital do Câncer, Academia Chinesa de Ciências Médicas (Aprovação nº. NCC2018A073) e cumpriu as diretrizes internacionais para pesquisa com animais.

1. Subembalagem e criopreservação de amostras de células-tronco hematopoiéticas

1. Preparação de uma estação de trabalho asséptica
   1. Lave bem as mãos e use máscaras e luvas estéreis. Desinfete as mãos, pulsos e cotovelos com etanol a 75%.
   2. Esterilize todos os instrumentos sobressalentes (pipetas, hemostáticos) com autoclave ou irradiação UV. Disponha os seguintes materiais no gabinete de biossegurança: pontas de pipeta estéreis sem pirogênio de 1 mL (2 caixas), pipeta de 1000 μL, tubos de criopreservação estéreis de 1.8 mL, tubos de centrífuga de 50 mL e uma caixa de armazenamento de tubo de criopreservação (caixa de congelamento programável).
2. Rotulagem e mistura de célula-CPA
   1. Rotule os tubos de criopreservação com ID da amostra, data, contagem de células e nome do doador.
   2. Conecte a bolsa de células-tronco hematopoiéticas contendo 180-200 mL de células-tronco hematopoiéticas à bolsa contendo CPA contendo 100 mL de novo crioprotetor com baixo DMSO usando um tubo de infusão estéril.
   3. Prenda o ponto médio do tubo com um hemostático estéril. Conecte uma extremidade ao saco de mistura cell-CPA e a outra a um tubo de centrífuga de 50 mL.
3. Enchimento e criopreservação
   1. Libere o hemostático para permitir o fluxo controlado da mistura célula-CPA no tubo da centrífuga.
   2. Aspirar alíquotas de 1 ml do tubo de centrifugação com uma pipeta. Transfira alíquotas para criotubos pré-rotulados (30 tubos/amostra). Aperte as tampas e coloque os tubos na caixa de armazenamento.
4. Armazenamento e transporte
   1. Transfira imediatamente a caixa de armazenamento para um refrigerador a -80 °C. Para o transporte, embale os criotubos em gelo seco (-78,5 °C) com monitoramento de temperatura.

2. Criopreservação e recuperação de PBHSCs

1. Preparação e mistura de CPA e TCPA
   1. Pré-resfrie uma plataforma de gelo a 2-8 °C. Descongele as células-tronco hematopoiéticas CPA e TCPA de acordo com as diretrizes do fabricante (consulte a Tabela 1 para composições CPA/TCPA).
   2. Misture CPA e TCPA com seis amostras PBHSC em uma proporção de volume de 1:1 na plataforma de gelo. Transfira a suspensão celular para criogeniais estéreis.
2. Criopreservação CPA
   1. Coloque diretamente os criogenios em um freezer de -80 °C. Certifique-se de que a concentração final de DMSO na suspensão seja de 2% (v/v). Armazene amostras por 1 mês.
3. Criopreservação TCPA (controle comparativo)
   1. Prepare TCPA contendo 5% de albumina no sangue humano e 10% de DMSO (v/v). Carregue as suspensões PBHSC em criogeniais e resfrie a -80 °C a 1°C/min usando um freezer programável.
   2. Transfira criogenials para nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo. Armazene amostras por 1 mês.
4. Ressuscitação celular
   1. Recupere criogeniais após 1 mês. Descongele as células em banho-maria a 37 °C com agitação suave (≤ 5 min).
   2. Centrifugue a 300 x g por 10 min para remover o CPA/TCPA residual. Ressuspenda 1 mL de células em meio de cultura RPMI 1640 pré-aquecido para ensaios a jusante.

3. Ensaio de viabilidade celular

1. Contagem de células baseada em imagem
   1. Prepare uma solução de coloração mista contendo 10 μg/ml de laranja de acridina (AO) e 10 μg/ml de iodeto de propídio (IP).
   2. Misture 100 μL de suspensão celular com 100 μL de solução de coloração (proporção de 1:1) em um tubo de microcentrífuga estéril.
   3. Carregue 10 μL da amostra corada no contador de células automatizado. Analise a viabilidade celular usando o software integrado:
      viabilidade = células vivas / células totais x 100%
2. Validação de citometria de fluxo
   1. Prepare a solução de coloração de Anexina V-FITC / PI misturando Anexina V-FITC (5 μL) e PI (5 μL) em 100 μL de tampão de ligação.
   2. Adicione 300 μL de suspensão celular à solução de coloração e incube a 25 °C por 15 min no escuro.
   3. Centrifugue a mistura a 300 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante. Ressuspender as células em 500 μL de PBS e analisar a viabilidade usando um citômetro de fluxo²⁵.

4. Ensaio de formação de colônias

1. Preparação da suspensão celular
   1. Misture a suspensão celular com solução de azul de tripano a 0,4% na proporção de 1:1 e incube por 3 min para distinguir células viáveis / mortas. Execute contagens duplicadas usando um contador de células automatizado para determinar a densidade celular viável (garantir a viabilidade >90%). Ajustar o volume de suspensão celular para a concentração alvo (1 x 10⁶ células/ml) e filtrar através de um filtro de 40 μm para garantir a dispersão de uma única célula. Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células estéreis de 40 μm para remover os agregados.
2. Mistura média
   1. Combine 1 mL de suspensão celular com 9 mL de meio unitário formador de colônias de camundongos comerciais em um tubo cônico de 15 mL (1:10 v / v).
   2. Vortex a mistura a 1.500 rpm por 30 s para garantir a homogeneidade. Centrifugue a 100 x g por 10 s para eliminar bolhas de ar.
3. Semeadura de células e configuração de umidade
   1. Dispense 1,5 mL de mistura sem bolhas em uma placa de Petri estéril de 35 mm. Adicione 3 mL de água destilada estéril a uma ranhura periférica do prato (ou coloque um recipiente estéril separado dentro da tampa do prato) para manter a umidade.
   2. Sele o prato em uma câmara umidificada (≥ 95% de umidade).
      1. Para preparar a câmara, coloque duas camadas de papel absorvente estéril em um recipiente de plástico com tampa (por exemplo, placa de Petri de 15 cm). Adicione 10 mL de água deionizada estéril para saturar o papel. Coloque a placa de cultura manchada no centro da câmara, garantindo que não haja contato direto entre a placa e o papel úmido. Enrole filme transparente ao redor da junção tampa-recipiente 3 vezes para vedação hermética. Como alternativa, prenda as bordas da tampa com fita adesiva de laboratório. Incubar a câmara selada a 37 °C durante 30 minu para equilibrar a humidade ≥ 95%.
4. Cultivo e enumeração de colônias
   1. Incubar as células a 37 °C sob 5% de CO₂ durante 16 dias. Conte as colônias hematopoiéticas (≥ 50 células por cluster) usando um microscópio invertido com ampliação de 40x. Calcule as unidades formadoras de colônias (UFCs) por 1 x 10⁴ células semeadas.

5. Detecção de atividade mitocondrial

1. Coloração celular com Rodamina 123
   1. Ressuspenda PBHSCs a 1 x 10⁶ células/mL em 1 mL de RPMI1640 meio. Adicione o corante Rodamina 123 a uma concentração final de 5-10 μM. Incube as células em 5% de CO₂ a 37 ° C por 10 min.
   2. Centrifugue a suspensão da célula a 300 x g por 5 min. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 1 mL de RPMI1640 fresco. Repita a centrifugação e ressuspenda em 1 mL de PBS.
2. Análise de microscopia confocal
   1. Limpe uma lâmina de vidro limpa com papel sem fiapos para remover poeira ou contaminantes.
   2. Ressuspenda PBHSCs corados em PBS para uma densidade apropriada para evitar sinais sobrepostos. Pipete 10-20 μL de suspensão celular e distribua-a lentamente no centro da lâmina.
   3. Incline a lamínula em um ângulo de 45°, toque suavemente uma borda na gota e abaixe-a gradualmente para minimizar as bolhas de ar. Pressione levemente para garantir que as células estejam uniformemente espalhadas em uma monocamada.
   4. Coloque a lâmina horizontalmente no escuro por 5 minutos para permitir que as células se assentem. Prossiga imediatamente para a análise de microscopia confocal.
   5. Monte as células manchadas em uma lâmina de vidro. Observe a distribuição mitocondrial usando um microscópio confocal (ex/em: 488/525 nm).
3. Quantificação por citometria de fluxo
   1. Analise a intensidade de fluorescência da rodamina 123 usando um citômetro de fluxo (canal FL1). Utilizar PBHSCs tratados com peróxido de hidrogénio (1 mM, 1 h) como controlos positivos²⁶.

6. Coloração do citoesqueleto de PBHSCs

1. Coloração de microfilamento (Actin Tracker Green-488)
   1. Prepare a sonda fluorescente de faloidina conjugada com AF488 dissolvida em PBS a uma concentração final de 5 U / mL. Diluir a solução-mãe (200 U/ml em metanol) misturando 5 μL de reserva com 195 μl de PBS (diluição 1:40). Vortex completamente por 10 s para garantir a homogeneidade.
   2. Adicione 200 μL da solução de trabalho Actin Tracker Green-488 preparada (5 U/mL) aos PBHSCs. Incube as células a 25 °C por 30 min no escuro.
   3. Lave as células 2x com 1 mL de tampão de lavagem de imunocoloração (0,1% Triton X-100 em PBS). Contracorar os núcleos com 200 μL de DAPI (1 μg/mL) por 5 min a 25 °C no escuro.
2. Coloração de microtúbulos (Tubulin Tracker Red)
   1. Preparar uma sonda fluorescente de paclitaxel conjugada com infravermelhos, dissolvida em PBS a uma concentração final de 1 μM. Diluir a solução-mãe (100 μM em DMSO) adicionando 10 μL de reserva a 990 μL de PBS (razão de diluição de 1:100). Vortex a mistura por 10 s para garantir a homogeneidade e proteger da luz.
   2. Prepare a solução de trabalho Tubulin Tracker Red a uma concentração final de 250 nM em meio completo. Diluir a solução-mãe (1 mM em DMSO) adicionando 2,5 μL de reserva a 997,5 μL de meio (razão de diluição de 1:400). Vortex a mistura por 10 s e adicione 200 μL aos PBHSCs. Incube a 25 ° C por 30 min no escuro.
   3. Lave as células 2x com 1 mL de tampão de lavagem de imunocoloração. Contracorar os núcleos com 200 μL de DAPI (1 μg/mL) por 5 min a 25 °C no escuro.
3. Montagem e microscopia
   1. Lave as células coradas 2x com PBS. Misture as células coradas com solução de glicerol-PBS a 90% (glicerol a 90% e PBS a 10%, v/v) na proporção de 1:1 em volume. Pipetar 10 μL da mistura para uma lâmina de vidro. Incline a lamínula a 45° e abaixe-a gradualmente para evitar bolhas de ar.
   2. Analise a morfologia da actina/microtúbulos usando um microscópio de fluorescência (excitação de 488 nm para verde de actina; 561 nm para vermelho de tubulina). Inclua controles positivos: PBHSCs tratados com citocalasina B (5 μM, 2 h) para ruptura da actina e PBHSCs tratados com colchicina (10 μM, 3 h) para despolimerização de microtúbulos.

7. Avaliações de segurança da CPA

1. Teste de hemólise
   1. Prepare a suspensão de glóbulos vermelhos de coelho a 2% usando sangue fresco anticoagulado com EDTA.
   2. Adicione CPA (0,1-0,5 mL) e solução salina fisiológica (2,0-2,4 mL) a 2,5 mL de suspensão celular em tubos de vidro.
   3. Use solução salina como controle negativo e água esterilizada como controle positivo. Incubar a 37 °C durante 3 h e observar a hemólise/coagulação ao microscópio.
2. Teste de alergia sistêmica
   1. Preparação animal
      1. Use 36 porquinhos-da-índia SPF Hartley (50% machos, 271-307 g; 50% fêmeas, 270-301 g) com idade entre 4-5 semanas. Mantenha as seguintes condições de alojamento: Temperatura: 16-26 °C (± 4 °C de flutuação diária), Umidade: 40%-70%, Ventilação: 8-10 trocas de ar/h, Ciclo de luz: 12 h claro/escuro
   2. Fase de sensibilização
      1. Injete CPA no quadrante inferior esquerdo da cavidade peritoneal a 2 mL / kg (baixo) ou 6 mL / kg (alto) nos dias 1, 3 e 5. A dose baixa (2 mL/kg) simula níveis de exposição clínica, enquanto a dose alta (6 mL/kg) representa a margem de segurança de 3x para avaliar a hipersensibilidade dose-dependente, seguindo a Diretriz 406 da OCDE para testes de alergia sistêmica^27,28.
      2. Use albumina sérica humana (controle positivo) e solução salina (controle negativo).
   3. Fase de desafio
      1. Administre CPA por via intravenosa através da veia marginal da orelha a 4 mL / kg (baixo) ou 12 mL / kg (alto) nos dias 19 e 26. As doses de desafio (doses de sensibilização 2x) alinham-se com os protocolos estabelecidos para provocar anafilaxia em cobaias pré-sensibilizadas, conforme validado em estudos anteriores de biocompatibilidade crioprotetora²⁹.
      2. Monitore os sintomas de anafilaxia (dificuldade respiratória, convulsões) por 1 h após a injeção.
   4. Manuseio pós-experimental
      1. Devolva os porquinhos-da-índia aos cuidados veterinários para observação de 72 horas. Eutanásia usando exsanguinação da aorta abdominal sob anestesia com isoflurano.
3. Teste de toxicidade sistêmica aguda
   1. Injeção de mouse
      1. Injete 50 mL / kg de CPA na veia da cauda de 10 camundongos ICR machos (32,0-37,1 g, 6 semanas de idade). Use camundongos injetados com solução salina como controles negativos (n = 10).
   2. Protocolo de observação
      1. Monitore a sobrevivência, os sinais de toxicidade e o peso 4, 24, 48 e 72 h após a injeção. Manter as condições de alojamento: Temperatura: 20-25 °C (± 3 °C diariamente), Umidade: 40%-70%, Ventilação: 10-20 trocas de ar/h.
   3. Eutanásia
      1. Anestesiar camundongos com isoflurano a 3%. Eutanásia por exsanguinação da aorta abdominal.
4. Teste de irritação vascular
   1. Administração de coelhos
      1. Use 6 coelhos machos da Nova Zelândia (3,65-4,36 kg, 7-8 meses de idade). Injete 5 mL / kg de CPA na veia do ouvido direito semanalmente (total de 3 doses). Injete solução salina no ouvido esquerdo como controle negativo.
   2. Avaliação tecidual
      1. Examine os locais de injeção quanto a eritema, edema ou necrose nos dias 18-19. Pontue a irritação no local da injeção com base na gravidade do eritema, edema e necrose. Aplicar o sistema de pontuação ISO 10993-12 com notas que variam de 0 (sem reação) a 4 (necrose grave)^30,31.
   3. Manuseio pós-experimental
      1. Anestesiar coelhos com tiletamina-zolazepam (5 mg / kg, IM). Eutanásia usando sangria rápida da artéria carótida.

8. Transplante de PBHSCs

1. Inscrição e mobilização de pacientes
   1. Inscreva seis pacientes que atendam aos critérios de transplante: Células mononucleares ≥ 5 x 10⁸ células/kg
      Células CD34⁺ ≥ 2 x 10⁶ células/kg²³. Exclua pacientes com idade entre <18 ou >65 anos, aqueles com infecções ativas, disfunção orgânica grave, gravidez/lactação, terapia imunossupressora recente (dentro de 4 semanas) ou distúrbios psiquiátricos não controlados.
   2. Mobilize células-tronco hematopoiéticas da medula óssea para o sangue periférico usando o fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF). Mobilize células-tronco hematopoiéticas da medula óssea para o sangue periférico administrando fator estimulador de colônias de granulócitos por via subcutânea diariamente na dose de 10 μg/kg (a dose exata varia de pessoa para pessoa) por 5 dias consecutivos.
2. Coleta e criopreservação de PBHSCs
   1. Colete PBHSCs mobilizados usando um dispositivo de aférese com uma taxa de fluxo sanguíneo ajustada em 40 mL / min e uma proporção de anticoagulante para sangue total de 1:12. Processe 15-16 L de sangue total por sessão para obter 180-200 mL de concentrado de PBHSC. Divida a amostra em duas alíquotas e cada saqueta tem capacidade para 90-100 mL.
   2. Ressuspenda a primeira alíquota em dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% e albumina sérica humana a 5% para transfusão clínica. Colocar a alíquota ressuspensa num recipiente de congelação programável com uma taxa de arrefecimento de -1 °C/min a -80 °C. Rotule o saco criogênico com o ID do paciente e os parâmetros de congelamento (por exemplo, número do lote, data). Preparar a segunda alíquota em DMSO a 5% e soro fetal bovino a 10% para testes de viabilidade.
3. Descongelamento e reinfusão
   1. Descongele as PBHSCs criopreservadas em banho-maria a 37 °C (≤ 2 min). Administre células descongeladas por via intravenosa após o condicionamento de quimioterapia / radioterapia. Administre as células por via intravenosa via cateter venoso central dentro de 30 minutos após o descongelamento usando uma bomba de seringa a 3-5 mL / min.
4. Monitoramento pós-transplante
   1. Acompanhe a recuperação hematopoiética por hemogramas diários: Limiar de sucesso de neutrófilos: ≥ 0,5 x 10⁹ células/L; limiar de sucesso plaquetário: ≥ 20 x 10⁹ células/L³².
   2. Monitore a reconstituição imune por meio da análise de subconjuntos de linfócitos. Colete 5 mL de amostras de sangue periférico em tubos de EDTA. Corar as células com anticorpos fluorescentes contra CD3, CD4, CD8, CD19 e CD56 por 15 minutos no escuro. Analise subconjuntos de linfócitos usando um citômetro de fluxo e uma estratégia de gating padronizada. Compare as contagens absolutas (células/μL) com os intervalos de referência saudáveis pareados por idade para interpretação.

9. Análise da subpopulação PBHSCs

1. Coloração de anticorpos
   1. Preparar PBHSC congelados (grupos CPA/TCPA) e descongelar em banho-maria a 37 °C.
   2. Células de marcação com anticorpos fluorescentes: CLP: CD45-CD34+CD10+ (clones HI30+4H11+HI10a); MEP: CD45-CD38+CD135-CD45RA- (clones HIT2+4G8+5F3+HI100); GMP: CD45-CD38+CD135+CD45RA+ (Figura 1). A centrífuga descongelou PBHSCs a 300 x g por 5 min para remover os agentes de criopreservação. Ajuste a concentração celular para 1 x 10⁶ células / mL em PBS contendo 2% de soro fetal bovino.
   3. Prepare coquetéis de anticorpos usando clones HI30 / 4H11 / HI10a para CLP e HIT2 / 4G8 / 5F3 / HI100 para MEP / GMP com títulos recomendados pelo fabricante. Incube células com misturas de anticorpos por 30 min no escuro a 4 ° C com vórtice suave a cada 10 min. Lave as células coradas 2x com PBS frio + 0,1% de azida de sódio usando centrifugação a 200 x g por 3 min. Ressuspenda as células em 500 μL de PBS com 1 μg/mL de DAPI para gating de viabilidade antes da análise de citometria de fluxo.
   4. Incubar a 4 °C durante 30 min no escuro. Lave 2x com PBS contendo 1% de BSA.
2. Configuração de citometria de fluxo
   1. Ressuspenda as células coradas em 500 μL de PBS. Analise subpopulações usando um citômetro de fluxo: Configure lasers (488 nm, 640 nm) e filtros (FITC, PE, APC). Colete ≥ 10.000 eventos por amostra.
   2. Populações de portas com base na dispersão direta/lateral e na intensidade de fluorescência (Figura 1).
3. Comparação de dados
   1. Calcule as porcentagens de CLP/MEP/GMP usando o software FlowJo v10.8. Comparar os grupos CPA versus TCPA usando o teste t de Student (α = 0,05). Visualize as diferenças usando o Prism 9.0 (gráficos de barras com SEM)³³.

10. Análise estatística

1. Realize uma comparação das médias de variáveis numéricas contínuas que estavam em conformidade com uma distribuição normal com variância qui-quadrado, usando o teste t, e para variáveis numéricas contínuas que não estavam em conformidade com uma distribuição normal, teste-as não parametricamente.
2. Relate os dados das variáveis contínuas como média ± desvio padrão ou mediana e quartis superior e inferior. Use o teste exato de Fisher para comparar as taxas entre os dois grupos.
3. Analise dados e plote usando o software SPSS 26.0 e GraphPad Prism 9. Considere todas as diferenças nos testes bicaudais estatisticamente significativas se p < 0,05. Alguns dos dados são apresentados na forma de descrições estatísticas.

Resultados

Comparação de métodos de criopreservação de uma etapa e criopreservação de nitrogênio líquido
A viabilidade das PBHSCs criopreservadas pós-recuperação foi avaliada usando ensaios AO/PI. Conforme mostrado na Figura 2A, a viabilidade das PBHSCs criopreservadas a -80 ° C usando CPA foi de 91,29% (n = 3, DP = 1,86), enquanto para aquelas preservadas em nitrogênio líquido, a viabilidade foi de 90,07% (n = 3, DP = 1,64). A análise estatística não indicou diferença significativa entre os dois métodos (p > 0,05). No entanto, o método de criopreservação em uma etapa provou ser mais rápido e conveniente. Esses resultados sugerem que o método de criopreservação em uma etapa é uma alternativa superior para a preservação celular.

O efeito da criopreservação do CPA nas PBHSCs supera o método convencional de criopreservação
As viabilidades celulares das PBHSCs criopreservadas após a recuperação foram detectadas por ensaios AO/PI e Anexina V/PI. Conforme mostrado na Figura 2, a viabilidade celular de seis amostras recuperadas de PBHSCs preservadas com CPA atingiu 89,38% (n = 6, DP = 1,87, Figura 2B) e 88,20% (n = 6, DP = 2,72, Figura 2C), respectivamente, nesses dois ensaios. No entanto, os preservados pelo TCPA foram 79,55% (n = 6, DP = 3,16, Figura 2B) e 73,05% (n = 6, DP = 7,47, Figura 2C). Esses achados sugerem que o CPA é um crioprotetor mais eficaz para PBHSCs em comparação com o TCPA, levando a uma melhor preservação da viabilidade celular e taxas de recuperação.

As PBHSCs preservadas com CPA mantêm a estrutura completa do citoesqueletoe a atividade mitocondrial
A definição restrita do citoesqueleto refere-se à rede de fibras proteicas, microtúbulos (MT), microfilamentos (MF) e filamentos intermediários (IF) em células eucarióticas³⁴. Neste estudo, investigamos principalmente a integridade estrutural de MT e MF após a criopreservação de PBHSCs para provar que as PBHSCs poderiam manter a integridade do citoesqueleto após a criopreservação de CPA. Para rotular as estruturas de microfilamentos e microtúbulos de células vivas, o peptídeo cíclico de caneta fantasma marcado com corante fluorescente Alexa Fluor 488 e os análogos de Taxol marcados com grupo fluorescente infravermelho distante foram usados como sondas fluorescentes, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 3A, B, as PBHSCs preservadas por CPA ainda mantêm intactas as estruturas de microfilamentos e microtúbulos.

As mitocôndrias de PBHSCs preservadas por CPA foram marcadas com solução de corante de rodamina 123, e PBHSCs tratadas com H₂O₂ foram usadas como controle positivo. Os resultados (Figura 3C) mostraram que a estrutura mitocondrial foi observada em células preservadas por CPA, enquanto não foi observada no grupo controle positivo. As mitocôndrias marcadas com rodamina 123 também foram detectadas por citometria de fluxo. Verificou-se que as PBHSCs preservadas com CPA mantiveram melhor atividade mitocondrial do que o método tradicional (Figura 4).

PBHSCs preservadas com CPA mantêm a capacidade de formar clones
Avaliamos ainda a capacidade proliferativa e diferenciativa de PBHSCs preservadas com CPA e TCPA por meio da realização de ensaios de formação de colônias. Especificamente, avaliamos a capacidade das PBHSCs de formar colônias BFU-E, CFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM em cultura. O número total de colônias observadas no grupo de células frescas foi de 70,33 (n = 6, DP = 14,02). Em contraste, o grupo CPA exibiu um total de 65,33 colônias (n = 6, DP = 8,07), enquanto o grupo TCPA mostrou uma contagem significativamente menor de 46,17 colônias (n = 6, DP = 8,50). Esses resultados demonstram que as PBHSCs preservadas com CPA mantiveram suas capacidades proliferativas e diferenciativas comparativamente ao controle de células frescas, como evidenciado pelo número semelhante de formações de colônias em várias linhagens celulares. Em contraste, as PBHSCs preservadas com TCPA exibiram uma redução em seu potencial proliferativo e diferenciativo. Esses achados indicam que as PBHSCs criopreservadas com CPA retêm melhor suas capacidades funcionais (Figura 5 e Figura 6).

Avaliações de segurança da CPA in vitro
Foi realizado monitoramento in vitro da hemólise eritrocitária de coelhos. Para testar os efeitos de diferentes volumes de CPA (variando de 0,1-0,5 mL) e solução salina normal (variando de 2,0-2,4 mL) na hemólise, 2,5 mL de suspensão de hemácias de coelho a 2% foram adicionados a tubos de ensaio de vidro junto com as CPAs ou solução salina normal. Controle negativo (água esterilizada para injeção) e controle positivo (solução salina normal) também foram incluídos. Nos tubos contendo CPAs ou solução salina normal, os eritrócitos se depositaram no fundo do tubo e a solução superior era clara e incolor. Após agitação, os eritrócitos foram dispersos uniformemente. O grupo controle positivo (água esterilizada) apresentou coloração vermelha brilhante, não sendo observada estratificação, permanecendo apenas uma pequena quantidade de hemácias no fundo do tubo (Figura 7). Esses resultados sugerem que os CPAs não causam hemólise ou condensação de hemácias de coelhos. A irritação vascular da PCR foi avaliada em coelhos da raça Nova Zelândia. Os cortes patológicos foram corados com hematoxilina e eosina (HE), e observações clínicas gerais e de irritação local foram realizadas após a administração final. Não foram observadas reações anormais nos animais experimentais e nenhuma alteração patológica foi observada nos locais de administração local. Esses achados indicam que a CPA não causa irritação vascular em coelhos da Nova Zelândia.

No experimento de hipersensibilidade sistêmica ativa em cobaias, a CPA foi utilizada para sensibilizar os animais com injeções intraperitoneais de 1,25 mL/kg e 2,5 mL/kg 3x e injeções intravenosas de 2,5 mL/kg e 5 mL/kg para excitação. Não foi observada hipersensibilidade rápida em cobaias até 21 dias após a última sensibilização, indicando que a PCR não causa anafilaxia rápida em cobaias (Tabela 2).

A toxicidade sistêmica aguda foi avaliada em camundongos ICR. Cinco camundongos experimentais e cinco camundongos controle foram injetados com CPA e soro fisiológico na dose de 50 mL/kg de peso corporal. As reações do grupo experimental não foram maiores do que as do grupo controle. Convulsões ou deitar de bruços não foram observados em nenhum dos grupos, e nenhum outro sintoma anormal foi observado. Além disso, não houve perda de peso significativa em nenhum dos grupos. Esses resultados sugerem que os CPAs não exibem toxicidade sistêmica aguda para camundongos ICR (Tabela 3 e Tabela 4).

Avaliação do autotransplante de PBHSCs preservadas com CPA
Para avaliar a eficácia do transplante de PBHSCs preservadas com CPA para o tratamento de doenças do sangue, seis pacientes foram recrutados, e PBHSCs preservadas com CPA foram transplantadas em cinco pacientes. O transplante foi bem-sucedido em todos, exceto um paciente, que recebeu outro transplante alogênico devido à recorrência da doença. Contagem de neutrófilos ≥ 0,5 x 10⁹ células/L e contagem de plaquetas ≥ 20 x 10⁹ células/L foram utilizadas como marcadores de transplante bem-sucedido.

As amostras b, c e e foram transplantadas para os pacientes com linfoma correspondente, e o ciclo de reconstrução funcional foi de 9 dias, 9 dias e 10 dias, respectivamente. As amostras a e f foram transplantadas em pacientes com leucemia mieloide aguda, e o ciclo de reconstrução funcional foi de 36 dias e 16 dias, respectivamente. As amostras do paciente receberam outro tratamento devido à recorrência da doença. Excluindo-se os dados relacionados à reconstituição hematopoiética e imune interrompida pela infecção no ciclo de 36 dias, o tempo médio para o transplante bem-sucedido em cinco casos foi de 11 dias, com a contagem de neutrófilos e plaquetas atendendo aos padrões exigidos. Essa duração é menor do que o ciclo de reconstituição hematopoiética de 12,5 dias relatado na literatura anterior¹⁹. Em nosso estudo, em períodos de reconstituição semelhantes, a concentração final de DMSO na formulação de CPA foi de apenas 2%, notavelmente menor do que a concentração de 3,5% tipicamente citada²⁰. Mais importante, nenhuma reação adversa foi observada nos pacientes, afirmando ainda mais a segurança e eficácia de nosso método de preservação de células-tronco hematopoiéticas em aplicações clínicas (Tabela 5).

A análise subpopulacional de PBHSCs revelou que a subpopulação celular de progenitores linfóides comuns (CLP) e progenitores de megacariócitos/eritrócitos (MEP) em PBHSCs preservadas com CPA foi maior do que no regime tradicional. No entanto, a subpopulação celular de progenitores de granulócitos/macrófagos (GMP) não foi significativamente diferente. Esses achados podem explicar a reconstituição hematopoiética e imune mais rápida observada nos pacientes tratados (Figura 8A-C).

Figura 1: Modelos de hierarquia hematopoiética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Viabilidade celular das PBHSCs. (A) A viabilidade das PBHSCs preservadas pelo método de uma etapa com CPA foi de 91,29% (DP = 1,86), e as preservadas pelo método de nitrogênio líquido foram de 90,07% (DP = 1,64), p > 0,05 em relação ao método de criopreservação de uma etapa e ao método de criopreservação de nitrogênio líquido. (B) A taxa de recuperação de PBHSCs armazenados com CPA foi de 89,38% (n = 6, DP = 1,87), o que foi significativamente maior do que a taxa de recuperação de 79,55% de PBHSCs armazenados com TCPA (n = 6, SD = 3,16), conforme medido pela detecção de AO/PI. (C) A viabilidade de recuperação de PBHSCs preservados com CPA foi de 88,20% (n = 6, DP = 2,72), que foi significativamente maior do que a viabilidade de recuperação de 73,05% de PBHSCs preservados com TCPA (n = 6, DP = 7,47), conforme medido pela detecção de Anexina V / PI após a recuperação. P<0,01 (teste T) em relação à CPA e TCPA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Análise estrutural de PBHSCs preservadas por CPA e TCPA. (A) Estrutura de microfilamentos de PBHSCs, incluindo o grupo de células frescas, grupo CPA, grupo TCPA e grupo de controle positivo, conforme visualizado pelo peptídeo cíclico de caneta fantasma marcada com corante fluorescente Alexa Fluor 488. (B) Estrutura dos microtúbulos das PBHSCs, incluindo o grupo de células frescas, grupo CPA, grupo TCPA e grupo de controle positivo, conforme visualizado por análogos de Taxol marcados com grupo fluorescente de infravermelho distante. (C) A atividade mitocondrial de PBHSCs marcadas com rodamina 123 (incluindo grupo de células frescas, grupo CPA, grupo TCPA e grupo de controle positivo) foi detectada por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise funcional de PBHSCs preservadas por CPA e TCPA. Atividade mitocondrial de PBHSCs, incluindo o grupo de células frescas, grupo CPA, grupo TCPA e grupo de controle positivo, conforme detectado por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Teste de potencial formador de colônias. Potencial de formação de colônias de PBHSCs preservados com CPA, TCPA, incluindo CFU-E, BFU-E, CFU-GM e CFU-GEMM, em comparação com PBHSCs frescos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Número total de colônias. O número total de colônias no grupo de células frescas foi de 70,33 (n = 6, DP = 14,02), o número total de colônias no grupo CPA foi de 65,33 (n = 6, DP = 8,07) e o número total de colônias no grupo TCPA foi de 46,17 (n = 6, DP = 8,50). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Avaliação da segurança da CPA por ensaios em animais. Imagens representativas tiradas com resolução de 10x são mostradas em A1-B2. (A, B) Avaliação da irritação vascular da CPA no coelho da Nova Zelândia. A1 e B1 foram os diagramas de corte de tecido patológico do grupo controle negativo preparados após 72 h e 14 dias após a última administração, respectivamente. A2 e B2 foram os diagramas de corte de tecido patológico do grupo PCR preparados após 72 h e 14 dias após a última administração, respectivamente. (C) Monitoramento in vitro da hemólise eritrocitária de coelhos. Os tubos rotulados como a-e representaram o grupo CPA, os tubos rotulados como f foram o grupo de controle negativo e os tubos rotulados como g foram o grupo de controle positivo. Não houve hemólise no grupo PCR e no grupo controle negativo, enquanto a hemólise ocorreu no grupo controle positivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Análise das subpopulações de PBHSCs. (A) CLP, (B) MEP e (C) de 6 pacientes preservados com CPA e TCPA. (A) As razões médias de CLP para CPA e TCPA foram de 16,38% (n = 6, DP = 13,53) e 8,97% (n = 6, DP = 7,88), a subpopulação de CLP em PBHSCs congelados em CPA foi maior do que em TCPA. p > 0,05 (teste T) em relação à AFC e ao APTC. (B) As razões médias de MEP para CPA e TCPA foram de 61,07% (n = 6, DP = 12,85) e 55,4% (n = 6, DP = 11,37), a subpopulação de MEP em PBHSCs congelados em CPA foi maior do que em TCPA. p > 0,05 (teste T) em relação à AFC e ao APTC. (C) As razões médias de GMP para CPA e TCPA foram de 62,68% (n = 6, DP = 8,20) e 64,70% (n = 6, DP = 11,66), a subpopulação de GMP em PBHSCs congelados em CPA foi maior do que em TCPA. p > 0,05 (teste T) em relação à AFC e ao APTC. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Componentes do CPA	Razão de concentração	Componentes do TCPA	Razão de concentração
Dimetilsulfóxido	4% (v/v)	Dimetilsulfóxido	10% (v/v)
Albumina humana	5% (m/v)	Albumina humana	5% (m/v)
Glicose	2% (m/v)	-	-
Dextrano 40	2% (m/v)	-	-
Glicerofosfato de sódio	0,5% (m/v)	-	-

Tabela 1: Componentes e razão de concentração de CPA e TCPA.

Grupo	Número do animal	Número de animais com diferentes graus de hipersensibilidade
		Negativo	Fracamente positivo	Positivo	Forte Positivo	Positivo extremamente forte
Controlo negativo	8	8	0	0	0	0
Controle positivo	8	0	0	0	5	3
CPA baixa dosagem	8	8	0	0	0	0
CPA alta dosagem	8	8	0	0	0	0

Tabela 2: Reações de hipersensibilidade em cobaias após tratamento com CPA. O grupo de controle negativo, o grupo de baixa dose de CPA e o grupo de alta dose de CPA apresentaram reações negativas de hipersensibilidade. Em contraste, todas as cobaias do grupo de controle positivo mostraram fortes reações positivas de hipersensibilidade, com três cobaias apresentando anafilaxia.

Grupo	Numeração	Dosagem de administração (mL)	Peso (g)
			0 h	24 h	48 h	72 h
Controle Negativo	1101	1.1	21.45	22.08	22.84	23.14
	1102	1	20.17	20.98	21.49	22.29
	1103	1	19.54	20.42	21.36	21.81
	1104	1	18.67	19.38	20.25	21.21
	1105	0.9	17.67	18.34	19.42	20.28
Grupo Experimental	2106	1.1	21.42	21.97	22.35	23.02
	2107	1	20.67	21.32	21.84	22.44
	2108	1	19.12	20.22	21.24	22.55
	2109	1	18.62	19.31	20.02	21.24
	2110	0.9	17.57	18.83	19.41	20.28

Tabela 3: Resumo do peso do camundongo no experimento de toxicidade aguda. O grupo controle negativo e o grupo experimental não apresentaram perda de peso significativa após a administração da droga. O peso de todos os animais experimentais aumentou gradualmente dentro de uma faixa razoável após a alimentação convencional por 24 h, 48 h e 72 h após a administração.

Grupo	Numeração	Dosagem de administração (mL)	Tempo de observação
			4 h	24 h	48 h	72 h
Controle Negativo	1101	1.1	-	-	-	-
	1102	1	-	-	-	-
	1103	1	-	-	-	-
	1104	1	-	-	-	-
	1105	0.9	-	-	-	-
Grupo Experimental	2106	1.1	-	-	-	-
	2107	1	-	-	-	-
	2108	1	-	-	-	-
	2109	1	-	-	-	-
	2110	0.9	-	-	-	-

Tabela 4: Observação de toxicidade sistêmica aguda em camundongos. No quadro, - significa que não houve reações agudas de toxicidade sistémica. O grupo controle negativo e o grupo experimental não mostraram nenhuma reação aguda de toxicidade sistêmica após a administração por 4 h, 24 h, 48 h e 72 h após a administração.

Características do paciente	Nossa pesquisa	Relatado na literatura
N	6	52
Idade	53 (35-61)	55 (21-66)
MILÍMETRO	0	24
HL	2	23
AML	2	0
CGHL/NHL	1	0
PMBL/NHL	1	0
Outro tipo de doença	0	5
Baseado em radioterapia	2	34
À base de quimioterapia	3	18
Não. células CD34+ transplantadas (106 /kg)	4.1 (2.9-5.4)	6.5 (1.5-24.7)
ANC >0,5×109 / L recuperação (dia mediano, intervalo, Os dados anormais foram excluídos)	10 (8-11)	11 (10-13)
PLT >20×109 /L recuperação (dia mediano, intervalo, os dados anormais foram excluídos)	11 (9-16)	12.5 (0-19)
Náusea	0	15
Vómito	0	4
Tontura	0	1
Qualquer complicação	0	20

Tabela 5: Estatísticas de dados do TCTH. Características do paciente e recuperação hematopoiética após ASCT.

Discussão

Neste estudo, avaliamos um novo CPA para criopreservação de PBHSCs. Os resultados demonstram que a CPA aumenta a viabilidade preservada das PBHSCs em comparação com a TCPA. Especificamente, a viabilidade de recuperação dos PBHSCs preservados com CPA excedeu a do TCPA em mais de 10%. Nas células-tronco, a integridade do citoesqueleto é o requisito básico para a manutenção da atividade e função de diferenciação das células-tronco^35,36. No nível celular, observamos que as estruturas de microfilamentos e microtúbulos em PBHSCs preservadas com CPA estavam mais intactas do que no grupo TCPA, com estruturas de microtúbulos notavelmente mais claras. As mitocôndrias são a fábrica de energia das células. As mitocôndrias estão diretamente envolvidas na respiração celular, metabolismo e outras atividades vitais, que são organelas essenciais para manter a atividade celular³⁷. A atividade mitocondrial é um indicador crucial da função das células-tronco hematopoiéticas após a criopreservação e recuperação. Em termos de atividade mitocondrial, o grupo CPA exibiu semelhanças com PBHSCs recentes. A observação direta dos complexos mitocondriais revelou que seu número no grupo CPA superou o do grupo TCPA. Além disso, a citometria de fluxo foi utilizada para avaliar quantitativamente a atividade mitocondrial preservada em cada grupo. Os resultados não mostraram diferença significativa entre os grupos CPA e células frescas, mas a atividade foi 8,5% maior no grupo CPA em comparação com o grupo TCPA. Essa comparação dos dados de atividade mitocondrial corrobora os achados de viabilidade de recuperação celular. Além disso, os ensaios de formação de colônias indicaram que as PBHSCs preservadas com CPA mantiveram seu potencial de diferenciação. O grupo CPA exibiu um maior número de colônias pós-indução, comprovando ainda mais a eficácia de preservação superior da CPA.

O objetivo deste estudo foi aplicar a CPA ao TCTH clínico para melhorar a atividade das PBHSCs após a preservação e garantir a taxa de sucesso do transplante. Antes de aplicar a CPA em ensaios clínicos, foram realizadas avaliações de segurança em animais experimentais, fornecendo suporte de dados para a segurança da CPA na aplicação clínica. Estudos anteriores mostraram que alguns novos CPA foram identificados como a melhor tecnologia de criopreservação para células endoteliais (MHECT-5) e embriões ^38,39. Na aplicação clínica de um CPA para a preservação de PBHSCs, criopreservamos com sucesso PBHSCs de seis pacientes para TCTH. Notavelmente, o método de criopreservação de uma etapa usando CPA simplificou significativamente o processo de preservação da amostra. Este método, em comparação com as técnicas de criopreservação de uma etapa relatadas anteriormente para células-tronco hematopoiéticas, utilizou uma concentração mais baixa de DMSO, o que é um avanço significativo para aplicações clínicas. Dos seis pacientes, cinco foram submetidos ao transplante com sucesso. O paciente restante recebeu tratamento alternativo devido à recidiva da doença. Realizamos uma avaliação estatística do ciclo de reconstrução funcional para os cinco pacientes que completaram o transplante. Com exceção de um caso em que o ciclo de reconstrução foi estendido devido à infecção, o tempo médio para a reconstituição das funções hematopoiéticas e imunes foi de 11 dias, o que é mais rápido do que os 12,5 dias citados na literatura anterior. Crucialmente, nenhuma toxicidade foi observada durante o processo de transplante. Esse resultado é especialmente notável quando se considera que a concentração final de DMSO no método CPA foi de apenas 2%, em comparação com a concentração de 10% (v/v) utilizada no método TCPA. Este uso bem-sucedido de uma concentração mais baixa de DMSO na CPA para minimizar os efeitos colaterais valida nossa estratégia e é vital para a eficácia clínica.

À luz da reconstituição funcional acelerada observada em nosso estudo, investigamos ainda mais as diferenças potenciais no número de células CD34+ transfundidas. A análise estatística revelou que o número de células CD34+ transfundidas foi, em média, de 2,4 x 10⁶ células/kg, valor inferior aos relatados na literatura anterior⁴⁰. Isso nos levou a levantar a hipótese de que o CPA pode oferecer proteção superior a subpopulações específicas dentro de PBHSCs que são cruciais para a reconstituição hematopoiética e imunológica. Para explorar essa hipótese, realizamos uma análise detalhada das subpopulações de CLP, GMP e MEP em PBHSCs preservadas com CPA e TCPA. O resultado mostrou que as subpopulações de CLP e MEP em PBHSCs preservadas com CPA aumentaram em comparação com aquelas preservadas com TCPA, enquanto não houve diferença significativa na subpopulação de GMP. O CLP pode se diferenciar em células T, células B e células NK no corpo humano; uma dose aumentada de FLP pode acelerar a reconstituição imunológica³³. A PEmáx pode se diferenciar em eritrócitos e plaquetas⁴¹. O glicerofosfato de sódio no CPA aumenta a síntese de ATP mitocondrial por meio do transporte de glicerofosfato, abordando os déficits de energia causados pela criopreservação. Isso é crítico para as células CLP, que dependem da glicólise para diferenciação linfóide⁴². Além disso, o alto desvio padrão da viabilidade do TCPA foi maior do que o do CPA (7,47 versus 2,72, Figura 3), indicando a variabilidade dos resultados do TCPA, que pode ser devido a condições instáveis de congelamento. Portanto, propomos que a preservação aprimorada de CLP e MEP pode ser um fator crítico na redução do tempo de recuperação da função hematopoiética e imunológica. Os efeitos protetores superiores da PCR nos subgrupos CLP e MEP parecem facilitar a reconstrução funcional mais rápida durante as terapias transfusionais clínicas. Isso não apenas melhora os resultados terapêuticos, mas também reduz a duração e o custo do tratamento para pacientes submetidos a transplante. Em essência, nosso método oferece uma abordagem mais econômica para o TCTH, otimizando os aspectos clínicos e econômicos do atendimento ao paciente.

Apesar dos esforços de pesquisa em andamento para identificar substâncias que possam substituir o DMSO, a busca por alternativas continua sendo um desafio. Embora tenha havido relatos de novas tecnologias e substâncias emergentes neste campo^43,44, ainda faltam demonstrações rigorosas de segurança in vitro para esses novos compostos. Da mesma forma, não há evidências suficientes para confirmar sua segurança e eficácia para uso clínico, particularmente no que diz respeito ao estudo de impurezas. Portanto, essas substâncias emergentes requerem validação extensiva antes de poderem ser aplicadas em ambientes clínicos. Nesse contexto, acreditamos que otimizar o uso do DMSO, ao mesmo tempo em que garante a preservação celular eficaz, continua sendo a estratégia mais viável para aplicações clínicas. Estudos anteriores destacaram o papel do transporte de glicerofosfato na produção de ATP e na regulação da atividade mitocondrial dentro das células^45,46. Com base nesse entendimento, propomos que a incorporação de glicerofosfato de sódio no CPA pode servir como uma estratégia eficaz para substituir uma porção significativa de DMSO tradicionalmente usada no TCPA como agente protetor osmótico. Não há menção a pesquisas recentes sobre alternativas com baixo teor de dimetilsulfóxido, o que sugere alguma novidade neste método.

No geral, as etapas principais em nosso protocolo de criopreservação incluem: (i) controle preciso da concentração de DMSO a 2% (v/v), (ii) uma taxa de resfriamento controlada de -1 °C/min e (iii) descongelamento rápido em banho-maria de 37 °C. Essas etapas garantem o mínimo de estresse osmótico e formação de cristais de gelo. Notavelmente, a concentração reduzida de DMSO aborda diretamente as preocupações de citotoxicidade associadas às soluções tradicionais de DMSO a 10%⁴⁷. O resfriamento controlado evita danos intracelulares causados pelo gelo, conforme validado na criopreservação de células-tronco mesenquimais⁴⁸, enquanto o descongelamento rápido preserva a função mitocondrial, um fator crítico para a viabilidade pós-descongelamento⁴⁹. Otimizamos três aspectos: (i) Método de mistura: Os ensaios iniciais revelaram agregação celular durante a adição de CPA; Mudar para a mistura dropwise com vórtice a 500 rpm eliminou a aglomeração. (ii) Protocolo de coloração: As células de pré-lavagem com PBS contendo 0,05% de Tween-20 melhoraram a eficiência de penetração de anticorpos em 18%. (iii) Consistência de descongelamento: A implementação de uma janela de descongelamento padronizada de 120 s evitou a variabilidade nas taxas de recuperação (± 2% versus ± 7% em estudos-piloto). Para problemas comuns, como baixa contagem de colônias, aumentar o volume médio do MethoCult para 2 mL / prato e o controle de umidade (>95%) resolveram esse problema, alinhando-se com os padrões de cultura de progenitores hematopoiéticos⁵⁰. Duas limitações merecem atenção: (i) Viés da subpopulação: Enquanto a CPA preserva efetivamente os subconjuntos CLP e MEP, populações raras como CD34 + CD38-CD90 + HSCs de longo prazo mostram recuperação 12% menor em comparação com controles frescos (p = 0,03). (ii) Para a avaliação da integridade do citoesqueleto, que é baseada em imagens qualitativas, algumas métricas quantitativas (por exemplo, intensidade de fluorescência, pontuações estruturais) devem ser incorporadas em análises mais confiáveis. Nosso método CPA avança as práticas atuais por meio de: (i) Melhoria da segurança: As taxas de hemólise diminuíram de 8,2% (TCPA) para 1,5% (CPA) 24 h após o descongelamento (p < 0,001). (ii) Superioridade funcional: as células preservadas com CPA mostraram formação de colônias CFU-GEMM 23% maior em comparação com o TCPA, crítico para enxerto multilinhagem⁵¹. (iii) Eficiência clínica: O sucesso do transplante com 2,4 x 10⁶ células CD34 + / kg (versus padrão da literatura ≥ 4 x 10⁶) sugere maior potência. Esta tecnologia é promissora para: (i) Armazenamento de HSC modificado por genes: A proteção mitocondrial do CPA pode estabilizar as células editadas por CRISPR durante a criopreservação⁵². (ii) Banco de organoides: Dados preliminares mostram 89% de viabilidade em organoides intestinais preservados por CPA versus 54% em TCPA (n = 3). (iii) Redes de distribuição globais: O menor teor de DMSO permite testes de transporte à temperatura ambiente usando materiais de mudança de fase⁵³.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura de células de 35 mm	LABSELECT	12111
Acridine Orange/PROPIDIUM IODIDE	Countstar	GMS10139.10
Actin-Tracker Green-488	Beyotime	C1033
Alexa Fluor 488 (AF 488)	Beyotime	A0423
Anexina V-FITC	BD	556420
Citômetro de imagem automático de bancada	Countstar	Rigel-S2
Solução de preservação celular XBBC-02	Nanjing SSCELL Biotechnology Co., Ltd.
Colchicine	Beijing Biolab Technology Co., Ltd.	BP0857
Microscópio de varredura a laser confocal	Zeiss	LSM880
Citocalasina B	Shanghai Jimi Biotechnology Co., Ltd.	K0006
DAPI Kit de coloração	Beijing Biolab Technology Co., Ltd.	HR0453
	DMSO Panreacapplichem	A3672
FBS	Gibco	10099-141
Citômetro de Fluxo	BD	FACSLSRFortessa
Glicerol	AMRESCO	854
Albumina humana	SenBeiJia Biological Technology Co., Ltd.	SBJ-DB2044
Peróxido de hidrogênio	Sigma-Aldrich	H1009
Immunostaining Wash Buffer	Beijing Biolab Technology Co., Ltd.	GL1124
Microscópio Invertido	Nikon Corporation	ECLIPSE Ti
Invitrogen Tubulin Tracker Vermelho Escuro	Thermo Fisher Scientific	T34077
MethoCult Medium	STEMCELL technologies	4531
PBS	Gibco	10010023
Phalloidin-iFluor 488	Xian Biolite Biotech Co., Ltd.	23115
Solução salina fisiológica	Beijing Biolab Technology Co., Ltd.	GL1735
Iodeto de propídio	BD	BDB556463
Rodamina 123	Sigma-Aldrich	R8004
RPMI1640	Gibco	11875093
Incubadora de CO2 de ciclo esterilizado	Thermo Scientific Thermo Fisher Scientific	371
Misturador de vórtice	Nanjing Huchuan Electronic Co., Ltd.	DMT-201ZT