Artigo de método

Mutagênese semi-aleatória induzível por luz azul em DNA exógeno específico em Escherichia coli BL21 Strain

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DOI:

10.3791/68283

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20 de junho de 2025

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1Central Laboratory, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, 2Department of Emergency Medicine, Mount Sinai Hospital, 3NNHS, 2024 International Genetically Engineered Machine Team, Luoyang Central Hospital, 4USC Alfred E. Mann School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of Southern California

Neste artigo

Resumo

O protocolo descrito descreve métodos simplificados para reconhecer qualquer DNA exógeno enquanto gera mutações apenas nesses DNAs exógenos em Escherichia coli.

Resumo

As tecnologias de mutagênese têm sido amplamente utilizadas na criação de variações, evolução dirigida e engenharia de proteínas. No entanto, a maioria dos métodos só pode induzir mutações aleatórias no DNA genômico que são incontroláveis, levando a deformidades ou mesmo efeitos letais. Aqui, aproveitando a fusão de três sistemas: editor de base de citosina (CBE), elementos p-Mag / n-Mag induzíveis por luz azul e RNA polimerase T7 dividida, este método delineado incorpora um sistema de mutagênese semi-aleatório controlável por luz azul, específico da região de DNA e semi-aleatório.

Este sistema pode mutar citosina em timina em DNAs começando no promotor T7 e terminando no terminador T7. Qualquer gene exógeno a jusante do promotor T7 pode ser potencialmente mutado. Essas ferramentas também foram projetadas em duas partes para tornar o sistema controlável por luz azul. A primeira parte foi criada pela fusão de CBE com n-Mag e o gene N-terminal-T7 RNA polimerase. A segunda parte envolveu a fusão de p-Mag com a RNA polimerase C-terminal-T7. Sob luz azul, essas duas partes foram montadas para funcionar como um gerador de mutação em DNAs entre o promotor T7 e o terminador T7. Sem luz azul, o p-Mag é separado do n-Mag, liberando o CBE da edição do DNA.

O objetivo deste protocolo é gerar mutações aleatórias específicas da região em Escherichia coli com controle de luz azul e validar ainda mais os plasmídeos mutados. O sistema pode ser adaptado a um sistema de evolução in vivo onde a função do gene de interesse pode ser selecionada e as mutações desejadas podem ser coletadas para estudos posteriores.

Introdução

A mutação aleatória e a seleção natural são as principais forças que impulsionam a evolução, o que gerou grande variação genética entre as espécies. O processo evolutivo tem sido utilizado como uma ferramenta poderosa para projetar proteínas com funções otimizadas ou novas1. As taxas de mutação natural da replicação do DNA foram estimadas em cerca de uma em 109 bases por divisão celular em vários procariontes e eucariotos2. Baixas taxas de mutação natural tornam impraticável gerar grande diversidade genética em laboratórios. Os estudos se concentraram no desenvolvimento de métodos que aumentam as taxas de mutação para cobrir o maior número possível de locais em um determinado gene dentro de um período de tempo razoável.

Múltiplos sistemas foram desenvolvidos para atingir taxas de mutação mais altas em estudos de evolução laboratorial 3,4,5,6,7,8,9,10. Os sistemas de evolução in vitro aproveitam a PCR propensa a erros, a mutagênese de saturação dirigida ao local ou o design de bibliotecas computacionais para introduzir mutações em genes de interesse1. As bibliotecas de DNA são transformadas em células hospedeiras, onde os produtos proteicos são selecionados ou selecionados. As etapas de mutagênese e seleção na evolução in vitro não estão acopladas, limitando a eficiência e a escala das populações que podem ser geradas11. Os sistemas de evolução in vivo superaram as limitações introduzindo sistemas de mutação nas células e acoplando as etapas de mutagênese e seleção para permitir a evolução contínua. Anteriormente, os métodos de mutagênese in vivo empregavam mutagênicos químicos 3,4 e cepas mutadoras 5,6. No entanto, esses métodos sofrem de baixas taxas de mutação, falta de controle e espectro mutacional estreito ou desigual12. Estudos recentes desenvolveram novos e aprimorados sistemas de evolução in vivo, representados pelo OrthoRep, um sistema de replicação de DNA propenso a erros ortogonais 7,8; MutaT7, uma fusão de citidina desaminase com T7 RNA polimerase9; e EvolvR, uma fusão da nickase Cas9 com a DNA polimerase10 propensa a erros. Esses métodos têm diferentes células hospedeiras, contexto de destino e facilidade de implementação.

A RNA polimerase T7 (T7 RNAP), um componente-chave do sistema MutaT7, tem sido extensivamente estudada e projetada no campo da biologia sintética. Fragmentos de T7 RNAP foram co-expressos em diferentes níveis em diferentes pontos de tempo para construir um alocador de recursos13. Um RNAP T7 dividido com fragmentos C-terminal de diferentes especificidades do promotor foi construído para criar a porta lógica AND14. A capacidade dos fragmentos de RNAP T7 de se reunirem para reconstituir uma polimerase funcional levou ao desenvolvimento de biossensores ativados por luz e pequenas moléculas, onde a dimerização de parceiros de interação fundidos a cada um dos terminais N e C de T7 RNAP gera saída transcricional15. O RNAP T7 dividido também foi fundido aos domínios n-Mag e p-Mag para construir o controle da expressão gênica induzível por luz em Escherichia coli16. Após a ativação da luz azul, os domínios magnéticos dimerizam, aproximando espacialmente dois domínios do RNAP T7 dividido para realizar a função da polimerase. Este sistema permite o controle espaço-temporal preciso da expressão gênica com baixa expressão basal e uma grande faixa dinâmica.

Este artigo apresenta um protocolo para construir um sistema de mutagênese semi-aleatória in vivo controlável por luz azul (Figura 1). É construído em rAPOBEC1 desaminase fundida a n-Mag-N-T7 RNAP. A co-expressão de p-Mag-C-T7 RNAP do mesmo plasmídeo permite o controle de luz azul das atividades de edição de polimerase e base. O sistema combina a capacidade de edição básica do rAPOBEC1 com o RNAP T7 dividido controlado por luz. Foi validado em E. coli usando proteína fluorescente verde (GFP) como gene alvo, onde sua intensidade é selecionada por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS). Comparado ao sistema MutaT7 original, nosso sistema controlado por luz azul introduz mutações semi-aleatórias no gene alvo, modulando o intervalo de luz. Em vez de converter toda a citosina em bases de uracila no gene alvo, ele gera um perfil de mutação maior editando um subconjunto dos nucleotídeos por meio do controle de luz. O sistema pode ser facilmente adaptado a um sistema de evolução in vivo , onde a GFP pode ser substituída por outros genes de interesse e a função pode ser selecionada pela aptidão ou sobrevivência celular.

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Protocolo

O protocolo a seguir descreve como realizar o projeto de mutagênese de DNA exógeno usando o sistema de mutagênese da polimerase CBE-Mag-T7 (Etapa 1). Uma vez que o plasmídeo de DNA exógeno é construído, as etapas de transformação dos dois plasmídeos são descritas para expressar a mutagênese da polimerase CBE-Mag-T7 na cepa E. coli BL21 adicionando isopropila β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) e seguida por irradiação com luz azul iniciando a mutagênese (Etapas 2-9.2). As etapas de controle de qualidade para avaliar quantas mutações foram geradas em GFP ou DNA exógeno foram realizadas usando o sequenciamento de Sanger (Etapas 9.3-11.2).

1. Projetar DNA exógeno e construir o sistema de mutagênese da polimerase CBE-Mag-T7

  1. Encontre o DNA exógeno ou o sequenciamento de cDNA usando ferramentas online (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene ou https://www.uniprot.org/).
    NOTA: Aqui, usamos a sequência GFP como um DNA exógeno para mutagênese de citosina.
  2. Substitua o DNA gfp pelo DNA de interesse usando um kit de clonagem apropriado.
    NOTA: Usamos NheI para remover o DNA gfp no plasmídeo original no kit de montagem de colônias de DNA. Uma alternativa é trabalhar com empresas para a síntese de DNA. Consulte o Arquivo Suplementar 1 para obter a sequência de plasmídeos.
  3. Sintetize todos os genes junto com o sistema de mutagênese da polimerase CBE-Mag-T7 e incorpore-os ao esqueleto pET-11a com resistência à ampicilina.
    NOTA: Trabalhamos com uma empresa de síntese de DNA para construir este plasmídeo e obtivemos bactérias de estoque de glicerol contendo nosso plasmídeo alvo.

2. Ativação da cepa bacteriana

  1. Pipete 10 μL das bactérias estoque de glicerol na borda de uma placa de ágar LB contendo 100 μg / mL de ampicilina. Listre as bactérias deste ponto através da placa usando uma alça estéril.
  2. Incubar a placa de cabeça para baixo a 37 °C durante a noite numa incubadora bacteriana.

3. Amplificação de plasmídeo

  1. Pegue uma única colônia da placa e inocule-a em um tubo cônico de 50 mL com 15 mL de meio LB contendo 100 μg / mL de ampicilina.
  2. Colocar a cultura numa incubadora agitável a 37 °C, 180 rpm durante 14-16 h.

4. Extração de plasmídeo

  1. Pegue 5-15 mL da cultura bacteriana durante a noite e transfira-a para um tubo de centrífuga. Centrifugue a 18.894 × g por 1 min.
  2. Colete o pellet bacteriano e remova cuidadosamente todo o sobrenadante. Ressuspenda o sedimento bacteriano em 500 μL de tampão de ressuspensão por vórtice ou pipetagem.
  3. Adicione 500 μL de tampão de lise ao tubo, misture delicadamente invertendo o tubo 8-10x e deixe-o descansar em temperatura ambiente por 5 min para lisar as células.
    NOTA: Confirme a lise completa, certificando-se de que nenhum material floculante branco visível permaneça.
  4. Adicione 200 μL de tampão de equilíbrio à coluna de rotação colocada em um tubo de coleta. Centrifugar a 18,894 × g durante 2 min e rejeitar o escoamento. Coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
  5. Adicione 500 μL de tampão de neutralização ao lisado bacteriano, misture delicadamente invertendo o tubo 8-10x até que apareça um precipitado branco e deixe descansar em temperatura ambiente por 5 min.
  6. Centrifugar a 18,894 × g durante 5 min e transferir o sobrenadante para uma coluna de filtragem. Centrifugar a 18,894 × g durante 1 min para filtrar a solução.
  7. Adicione 0,3x o volume de isopropanol à solução filtrada, misture invertendo. Transfira a mistura para a coluna de centrifugação equilibrada.
  8. Centrifugue a 18.894 × g por 1 min, descarte o fluxo e coloque a coluna de volta no tubo de coleta.
  9. Lave a coluna com 750 μL de tampão de lavagem, centrifugue a 18.894 × g por 1 min e descarte o fluxo.
  10. Centrifugue novamente a coluna a 18,894 × g por 1 min para remover o tampão de lavagem residual.
  11. Coloque a coluna de centrifugação em um novo tubo de centrífuga. Adicione 100-200 μL de tampão de eluição ao centro da membrana da coluna. Deixe descansar em temperatura ambiente por 2-5 min e centrifugue a 18.894 × g por 2 min. Armazenar o ADN do plasmídeo a -20 °C.

5. Transformação de plasmídeo (células quimicamente competentes de E. coli BL21)

  1. Tome 50 μL de células BL21 quimicamente competentes descongeladas no gelo. Adicione 2 μL de DNA de plasmídeo da etapa 4.11 e misture suavemente. Incubar no gelo por 30 min.
  2. Choque térmico a 42 °C por 45 s e, em seguida, transfira imediatamente o tubo de volta para o gelo por 2 min.
  3. Adicione 500 μL de meio LB estéril a cada tubo. Incubar a 37 °C, 180 rpm durante 1 h para permitir a recuperação.
  4. Centrifugue a 1.000 × g por 5 min, descarte o excesso de sobrenadante, deixando aproximadamente 100 μL. Ressuspenda as células e a placa em ágar LB contendo 100 μg / mL de ampicilina. Incubar de cabeça para baixo a 37 °C durante a noite.

6. Expressando o gerador de mutação da polimerase CBE-Mag-T7 (forma inativa)

  1. Siga as etapas 5.1-5.4. Antes de espalhar as células, aplique uniformemente 1 mM IPTG na superfície do ágar LB com ampicilina. Use água deionizada como controle para comparar com os grupos tratados com IPTG.
  2. Depois que todas as colônias estiverem cultivadas, escolha 10-20 colônias para cultivar em 5 mL de meio LB contendo 1 mM IPTG em tubos de vidro de fundo redondo de 100 mL com tampa de rosca fenólica e revestimento de borracha a 16 ° C, 180 rpm por 8 h.
    NOTA: Todas as colônias podem ser armazenadas a 4 ° C para armazenamento de curto prazo antes de prosseguir para a etapa 7.

7. Ative o gerador de mutação da polimerase CBE-Mag-T7

  1. Colete as bactérias em tubos de vidro de fundo redondo de 100 mL com tampa de rosca fenólica e revestimento de borracha e centrifugue a 18.894 × g por 2 min.
  2. Altere o meio para o meio LB sem nenhum IPTG.
    NOTA: Esta etapa é importante para garantir que o gerador de mutação da polimerase CBE-Mag-T7 não possa se editar. Projetamos o sistema lacI/O para proteger os clusters de genes da polimerase CBE-Mag-T7.
  3. Irradiar a placa com um irradiador de luz azul (470 nm, 4 mW/cm2) durante a cultura a 37 °C durante o tempo predeterminado. Realize o sequenciamento de Sanger para verificar as mutações e verificar se uma exposição mais longa aumenta a frequência da mutação.
    NOTA: Aqui, definimos a exposição à luz azul para 0, 8, 16 e 24 h.

8. Seleção de mutações para aumento da função proteica e mutagênese contínua

NOTA: Aqui, usamos o gene gfp como um DNA exógeno para mutagênese e estamos procurando mutações que possam aumentar a intensidade fluorescente da proteína GFP.

  1. Escolha as colônias, rotule a posição em uma placa e inocule as colônias coletadas em 100 μL de ddH2O.
  2. Transfira os 100 μL de suspensão bacteriana para uma placa de 96 poços e leia a intensidade da GFP em Ex/Em = 488/510 nm.
  3. Repita as etapas 6.3 a 9.2 até que algumas colônias óbvias possam ser identificadas.

9. Pare a mutagênese e verifique as mutações

  1. Depois de realizar várias horas de irradiação de luz azul, mova todas as bactérias de volta para um local escuro a 4 °C por mais 15 minutos.
  2. Siga as mesmas etapas de extração de plasmídeo descritas na etapa 4.
  3. Projete os primers direto e reverso para o sequenciamento Sanger.
    NOTA: Aqui, usamos ATGGTGAGCAAGGGCGAGCTGT como um primer direto e TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG como um primer reverso para sequenciamento de Sanger.

10. Análise de dados e cálculo da frequência de mutação

  1. Visualize a mutação abrindo o arquivo .ab1 e verifique os picos manualmente.
  2. Analise a frequência de mutação usando ferramentas online (por exemplo, ferramenta Mutation Surveyor).
  3. Carregue o arquivo de dados Sanger para a ferramenta online e inicie a análise da taxa de mutação.

11. Preparação de estoque de glicerol bacteriano

  1. Inocular uma única colónia num tubo contendo 5 ml de LB médio com 100 μg/ml de ampicilina. Incubar a 37 °C, 180 rpm durante 12-16 h.
  2. Misture a cultura bacteriana com 50% de glicerol na proporção de 1:1. Alíquota em tubos de centrífuga de 1,5 mL. Conservar a -80 °C.

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Resultados

Os métodos descritos neste protocolo são para a criação de mutações no DNA exógeno usando um gerador de mutação de RNA polimerase CBE-Mag-T7 dividido. Os genes para construir o sistema de mutação da RNA polimerase CBE-Mag-T7 e o gene alvo para mutagênese são todos incorporados ao esqueleto do plasmídeo pET-11a. A transformação bem-sucedida e a irradiação de luz azul foram realizadas sem qualquer dano ao DNA genômico bacteriano, mostrado por meio de números de colônias normais e comparáveis em LB-ágar (

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Discussão

A ferramenta de edição de base guiada pela polimerase foi criada pela primeira vez por Cravens et al. em 2021, usando uma estratégia de fusão de proteínas17. Mutações em quatro nucleotídeos de DNA foram incorporadas com sucesso a taxas superiores a 10-4 mutações por pb. No entanto, uma vez que as mutações foram continuamente introduzidas entre o promotor T7 e o terminador sem controle adicional pelos pesquisadores18, as mutações ...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de centrífuga cônicos de 50 mLFalcãoCLS352070
AmpicilinaProdutos Químicos TermocientíficosJ60977.14
Irradiador de luz azulThorlabsLIU470A
Kit de Clonagem de Montagem de DNA NEBE5520S
Síntese de DNA/PrmersGenômica BGI
Kit Midi EndoFree Plasmid CWBIOCW2106STampão P1: tampão de ressuspensão, Tampão P2: tampão de lise, Tampão E3: tampão de equilíbrio, Tampão PS: tampão de neutralização, Tampão PW: tampão de lavagem, Tampão Endo-Free EB: tampão de purificação de DNA, RNase A Endo-Removedor FM: tampão de remoção de endotoxinas, Colunas de Rotação DM com Tubos de Coleta
GlicerolFisher QuímicaG33-4
Agitador incubadoThermo CientíficoSK2001CPKG
IPTG (isopropiltio-β-galactosídeo)Invitrogen15529019
Leitor de microplacasThermo CientíficoVarioskan LUX
Microscópio LeicaDMI 4000B
Multiskan FCProdutos Químicos Termocientíficos
One Shot BL21 (DE3) E. coli quimicamente competenteInvitrogenC600003
Kit de purificação de plasmídeo midi de baixa endotoxina PureLink FastInvitrogenResposta A36227
Pyrex  Tubos de centrífuga de fundo redondo para serviço pesado, com tampa de rosca fenólica e revestimento de borrachaCorning  8422CLS8422100

Referências

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