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Artigo de método

In vitro Cultura para células T de pato específicas para H5N1 e detecção de respostas imunes usando o método de coloração de citocinas intracelulares

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DOI:

10.3791/68291

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30 de maio de 2025

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1National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control, Guangdong Provincial Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control, College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, 2National Avian Influenza Para-Reference Laboratory, 3UK-China Centre of Excellence for Research on Avian Diseases

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

O protocolo descreve um método para cultivar células T aviárias in vitro , isolando células T de memória de patos infectados, permitindo a geração de células T específicas de pato altamente purificadas. Além disso, um método de coloração de citocinas intracelulares (ICS) foi estabelecido para medir com precisão a secreção de IFN-γ em células T de pato.

Resumo

A cultura in vitro de células T é um método crítico para estudar respostas imunes, infecções virais e possíveis estratégias terapêuticas. No entanto, nenhum protocolo estabelecido para a cultura de células T aviárias in vitro foi relatado até o momento. Neste estudo, apresentamos um protocolo pela primeira vez, utilizando o vírus H5N1 da influenza aviária de alta patogenicidade (HPAIV) como modelo. Aqui, patos de 4 semanas de idade foram infectados com o vírus e os linfócitos T de memória foram isolados 28 dias após a infecção para cultivar linfócitos T de pato específicos para H5N1, permitindo a investigação da resposta imune específica ao vírus H5N1. As principais etapas do protocolo incluem isolar células mononucleares do sangue periférico de memória (PBMCs) de patos infectados, ativar células apresentadoras de antígenos (APCs) com uma multiplicidade ideal de infecção (MOI = 5) por 6 h e preparar meios de cultura de células T suplementados com IL-2 recombinante e outros aditivos específicos. A proliferação de células T, a secreção de citocinas e a atividade citotóxica foram monitoradas de perto durante todo o processo. Além disso, estabelecemos um protocolo de coloração de citocinas intracelulares para quantificar a secreção de IFN-γ em células T de pato. Isso envolveu a geração de uma linha celular de hibridoma expressando anticorpos IgG3κ específicos para IFN-γ pato, seguido por uma purificação bem-sucedida de anticorpos. O anticorpo purificado foi diluído 1:10 e aplicado em citometria de fluxo para medir com precisão a secreção de IFN-γ. Este método oferece uma ferramenta confiável para avaliar as respostas das células T do pato e estabelece as bases para futuras investigações sobre imunologia viral aviária.

Introdução

O processo de ativação, proliferação, diferenciação e conversão de células T em células T de memória é central para as respostas imunes específicas do antígeno1. Inicialmente, as células T são ativadas quando seus receptores de células T (TCR) reconhecem peptídeos antigênicos apresentados na superfície das células apresentadoras de antígenos (APCs) por moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) 2,3. Esse processo de ativação requer não apenas a ligação do TCR às moléculas de MHC, mas também a coordenação de sinais co-estimulatórios, que são cruciais para a ativação total das funções das células T4. Uma vez ativadas, as células T entram rapidamente na fase de proliferação, gerando vários clones que compartilham a mesma especificidade de antígeno que a célula T original. Durante esta fase de proliferação, as células T se diferenciam ainda mais com base em sua função, principalmente em células T CD8+ e células T CD4+ 5. Essas células diferenciadas medeiam a morte citotóxica e auxiliam nas respostas imunes, respectivamente. Após a infecção inicial, uma parte das células T ativadas se transforma em células T de memória de longa duração6. Essas células T de memória podem persistir no sistema imunológico por longos períodos, respondendo rapidamente ao mesmo patógeno após a reexposição. Como resultado, eles geram uma resposta imune mais forte e eficiente, fornecendo proteção imunológica de longo prazo para o hospedeiro7. Todo esse processo é fundamental para o design de vacinas de células T, pois ajuda a melhorar a eficácia e a durabilidade da vacina8.

Nesse contexto, o cultivo de células T antígeno-específicas in vitro torna-se essencial. Este protocolo foi desenvolvido com base em métodos consagrados para cultivo in vitro de células T humanas, com adaptações necessárias para o sistema imunológico aviário9. Ao cultivar essas células fora do corpo, os pesquisadores podem estudar a resposta das células T em diferentes estados imunológicos, como ativação, proliferação, diferenciaçãoe formação de memória. Essa abordagem in vitro é inestimável para entender os papéis que as células T desempenham nas respostas imunes. Além disso, em condições de cultivo in vitro, a secreção de citocinas (como IFN-γ) pelas células T pode ser monitorada11,12. Esse monitoramento é crucial para avaliar a qualidade, intensidade e persistência das respostas imunes, bem como estudar as interações entre as células T e outras células imunológicas. Além disso, a expansão in vitro de células T específicas do antígeno permite o enriquecimento em larga escala, aumenta a sensibilidade de detecção e melhora a avaliação dos níveis de resposta das células T13. Assim, o cultivo in vitro de células T específicas do antígeno serve como uma ferramenta poderosa para entender melhor o papel das células T de aves nas respostas imunes, o que aumenta a sensibilidade de detecção e melhora a avaliação dos níveis de resposta das células T. Embora métodos in vitro semelhantes tenham sido bem estabelecidos em sistemas de mamíferos, a aplicação de tais técnicas em espécies aviárias permanece limitada. Isso é especialmente relevante na imunologia avícola, onde as ferramentas para analisar as respostas das células T são subdesenvolvidas. Os patos, em particular, servem como reservatórios naturais para vários vírus da gripe aviária, mas pouco se sabe sobre sua imunidade de células T específicas do antígeno. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo padronizado de cultura de células T in vitro adaptado aos sistemas aviários é essencial para o avanço da pesquisa básica e da imunologia aplicada em aves.

Uma citocina-chave envolvida nesses processos é o IFN-γ, um interferon tipo II produzido principalmente por células T CD8+, células T CD4+ tipo 1 e células NK14. O IFN-γ desempenha um papel crucial na inibição da replicação viral e na regulação das respostas imunes15. O nível de expressão de IFN-γ reflete o estado imunológico e serve como um marcador para a ativação de células T, permitindo que os pesquisadores avaliem os níveis de resposta das células T por meio de sua expressão16,17. Um método comum para detectar a expressão de citocinas em células imunes é a coloração intracelular de citocinas (ICS)18,19. No entanto, devido a limitações em materiais e técnicas experimentais, a pesquisa em patos ficou atrás da dos mamíferos5. Atualmente, muitos pesquisadores contam com qPCR para medir os níveis de expressão de IFN-γ, embora esse método tenha certas limitações11. Em nosso laboratório, desenvolvemos com sucesso um anticorpo para IFN-γ de pato que é compatível com citometria de fluxo. Com base nesse sucesso, neste estudo, estabelecemos um método ICS para detectar a expressão da proteína IFN-γ em células T de pato, fornecendo uma ferramenta confiável para estudos adicionais sobre as respostas das células T de pato.

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Protocolo

Todos os experimentos com todos os vírus da gripe aviária A (H5N1) disponíveis foram realizados em um laboratório de nível 3 de biossegurança animal e biotânica de acordo com os protocolos da Universidade Agrícola do Sul da China (CNAS BL0011). Todos os projetos de pesquisa com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (código de identificação 2021f154, 29 de julho de 2021) da Universidade de Agricultura do Sul da China. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos e diretrizes estabelecidos por este comitê e padrões internacionais para o bem-estar animal. Os animais utilizados neste estudo foram patos-reais domésticos (Anas platyrhynchos domestica) com 4 semanas de idade, incluindo machos e fêmeas, com pesos corporais variando de 500 a 600 g.

1. Isolamento de PBMCs de pato e preparação de uma suspensão de célula única

  1. Colete 2 mL de sangue heparinizado da veia jugular de cada pato e transfira para tubos contendo EDTA para evitar a coagulação de cada pato individual
  2. Dilua o sangue usando o diluente de amostra fornecido do kit de isolamento de linfócitos ou PBS. Misture delicadamente pipetando com uma pipeta Pasteur. A proporção de diluição usual é de 1:1 para o sangue para o diluente.
  3. Transfira um volume igual de solução de separação de linfócitos para um tubo de centrífuga como o sangue diluído. Coloque cuidadosamente a suspensão de sangue em cima da solução de separação de linfócitos. Centrifugar a mistura a 400 x g, 25 °C durante 15 min, regulando a aceleração de descida para 1.
    NOTA: A quantidade de solução de separação de linfócitos não deve ser inferior a 4 mL. Os componentes do kit de solução de separação de linfócitos podem ser encontrados na Tabela de Materiais.
  4. Após a centrifugação, observe as quatro camadas distintas no tubo da centrífuga de cima para baixo. A camada superior é o diluente da amostra, seguida pela camada de linfócitos brancos leitosos anulares, depois a solução de separação e a camada inferior consiste em glóbulos vermelhos.
  5. Use cuidadosamente uma pipeta para coletar a segunda camada, a camada anular de linfócitos brancos leitosos, e transfira-a para um novo tubo de centrífuga. Adicione 10 mL de solução de limpeza para misturar com as células.
  6. Centrifugue a amostra a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e, em seguida, ressuspenda o pellet celular em 10 mL de meio RPMI 1640 para contagem de células.
  7. Opcional) Para purificar ainda mais a amostra, após centrifugar a 440 x g por 5 min, use tampão de lise de glóbulos vermelhos para remover quaisquer células sanguíneas misturadas restantes.

2. Cultura de células T específicas para H5N1 AIV in vitro

  1. Compre patos-reais saudáveis de 2 semanas (Sheldrake) de uma fazenda de patos e abrigue-os em isoladores de pressão negativa. Confirme se os patos são negativos para AIV usando ensaios de inibição da hemaglutinação (HI) antes do experimento. Infecte patos de 4 semanas com H5N1 AIV 1 x 106, com dose infecciosa de 50% de ovo [EID50] / 0,2 mL por via intranasal.
  2. Isole PBMCs de memória de patos infectados com H5N1 28 dias após a infecção, seguindo o método descrito na etapa 1. Conte as células usando um hemocitômetro. Dilua a suspensão celular na proporção de 1:1 com 0,08% de azul de tripano e conte as células viáveis (não coradas) manualmente sob um microscópio óptico.
    NOTA: Conforme apoiado por nosso estudo publicado anteriormente20, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) isoladas 28 dias após a infecção são consideradas enriquecidas em células T de memória. Nesse estágio, a fase efetora diminuiu e as populações de células de memória são predominantes.
  3. Defina a concentração para 3 x 106 células/mL, garantindo que 1 mL de meio seja adicionado a cada poço da placa de 48 poços.
  4. Co-infectar os PBMCs isolados com o vírus da gripe aviária H5N1 (AIV) para servir como APCs. A dose viral é MOI = 5. Co-cultura dos PBMCs com o vírus por 1 h a 37 ° C. Agite suavemente com a mão a cada 15 min.
  5. Após 1 h de infecção, lave as células 2x com PBS para remover as partículas virais não ligadas. Ressuspender as PBMCs lavadas em 1 ml de meio de cultura de células T e incubar as células suspensas a 37 °C durante 5 h.
  6. Centrifugue as células a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente. Em seguida, ressuspenda as células apresentadoras de antígenos incubadas (APCs) em 100 μL de meio de cultura de células T e adicione-as às células efetoras. A proporção de células apresentadoras de antígenos para células efetoras deve ser de 1:5.
  7. Incubar as células numa atmosfera de CO2 a 5% a 37 °C durante 14 dias. A cada 2 dias, substitua metade do sobrenadante da cultura de células por meio de células T frescas, pipetando cuidadosamente para garantir uma distribuição uniforme. Descarte metade do meio que contém as células e adicione um volume igual de novo meio.
  8. No dia 7, observe as células sob um microscópio óptico a 100x.
  9. Use PBMCs de memória tratados com PBS como o grupo de controle não estimulado.

3. Éster succinimidílico de diacetato de fluoresceína carboxina (CFSE) para monitorar a proliferação de células T

  1. Ajuste a densidade celular para 0,5-1 x 107 células / mL e ressuspenda as células com 5 mL de PBS após centrifugação a 440 x g por 5 min.
  2. Diluir o estoque de 10 mM para 1 μM CFSE com 5 mL de PBS pré-resfriado; operar no escuro.
  3. Inclinar os dois tubos de centrífuga a 45°, adicionar a diluição CFSE à suspensão de células com uma pipeta Pasteur, misturar bem e colocar em banho-maria a 37 °C durante 15 min no escuro.
  4. Lave as células diluindo-as em 10 volumes de PBS pré-resfriado contendo 5% de FBS, sedimento por centrifugação a 440 x g por 5 min e descarte o sobrenadante. Repita a lavagem 2x.
  5. Estimule as células marcadas com CFSE in vitro conforme a etapa 2. Na conclusão do ensaio de proliferação, colher células e analisar por citometria de fluxo.

4. Análise por citometria de fluxo para proliferação de células T CD8+ e T CD4+

  1. Após 7 dias de cultura, coletar todas as células de cada poço e dividi-las em dois tubos de fluxo para análise.
  2. Transfira as células para um novo tubo de centrífuga, centrifugue a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
  3. Adicione 100 μL de coquetel de anticorpos (camundongo anti-pato CD8, 1:50 ou camundongo anti-pato CD4, 1:50) e incube as células por 30 minutos no escuro a 4 °C.
  4. Transfira as células para um novo tubo de centrífuga, centrifugue a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
  5. Adicione 100 μL de coquetel de anticorpos (Goat-Conjugated FITC-Rat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) e incube as células por 30 min no escuro a 4 ° C.
  6. Lave as células uma vez com 1 mL de PBS centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Analise os dados usando o software FlowJo. A estratégia de gating é mostrada na Figura 1 suplementar.

5. Resposta de células T por ensaios de expressão gênica de assinatura usando qPCR

  1. Conte as células no final da cultura de células T, colete em tubos de centrífuga de 1,5 mL e centrifugue a 400 x g por 5 min. Rejeitar cuidadosamente o sobrenadante.
  2. Extração de RNA
    NOTA: A extração pode ser realizada em uma capela ou bancada ultralimpa para evitar a contaminação por RNA.
    1. Lise as células usando o tampão de lise fornecido no kit de acordo com as instruções do fabricante. Transferir a amostra lisada para colunas de filtro de gADN (pré-colocadas em tubos de recolha), centrifugar a 13.400 x g durante 30 s, rejeitar as colunas e recolher o filtrado. Adicionar 0,5 volume de etanol absoluto ao filtrado. Homogeneizar.
      NOTA: Uma solução turva ou precipitado após a adição de etanol é normal. Agite e prossiga para a próxima etapa.
    2. Transferir a mistura para colunas de ARN, centrifugar a 13.400 x g durante 30 s. Descarte o filtrado, adicione 700 μL de tampão RW1 e centrifugue novamente.
    3. Rejeitar o filtrado, adicionar 700 μL de tampão RW2 (com etanol absoluto) e centrifugar. Rejeitar o filtrado, adicionar 500 μL de tampão RW2 (com etanol absoluto) e centrifugar durante 2 min. Remova cuidadosamente a coluna do tubo para evitar contaminação do filtrado. Certifique-se de que todas as soluções de enxágue sejam removidas para evitar interferência nas reações a jusante.
    4. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta sem RNase, adicione 50-200 μL de ddH2O livre de RNase, deixe descansar em temperatura ambiente por 1 min e, em seguida, centrifugue a 13.400 x g por 1 min para eluir o RNA. Meça a pureza e a concentração do RNA.
      NOTA: Pré-aqueça ddH2O sem RNase a 65 °C para aumentar o rendimento e execute uma segunda eluição, se necessário.
  3. Sintetize o cDNA seguindo as instruções do kit. Sintetize a fita de cDNA de acordo com as instruções do fabricante, adicionando 5x a quantidade de transcriptase reversa. Transcreva inversamente a 37 °C durante 15 min, depois a 85 °C durante 5 s e arrefecer a 4 °C.
  4. Configure a reação de PCR de acordo com o protocolo do fabricante.
    1. Em um tubo de qPCR, combine 10 μL de mistura enzimática de reação 2x PCR, 0,4 μL de primer 1, 0,4 μL de primer 2, 1 μL de molde de cDNA e 8,2 μL de ddH2O para fazer uma mistura de 20 μL.
    2. Execute a PCR no instrumento de PCR quantitativo em tempo real com o seguinte programa:
      Estágio 1: 95 °C por 30 s, Rep x 1
      Estágio 2: 95 °C por 3 s, 60 °C por 30 s, Rep x 35
      Estágio 3: 95 °C por 15 s, 60 °C por 60 s, 95 °C por 15 s, Rep x 1

6. Coloração de citocinas intracelulares (ICS)

NOTA: Este protocolo foi desenvolvido para avaliar a resposta efetora de células T CD8+ específicas para H5N1, detectando secreção intracelular de IFN-γ em patos.

  1. Cultura de células T específicas para H5N1 in vitro seguindo o procedimento descrito na etapa 2. Colha todas as células (de cada poço) após 7 dias do início da cultura.
  2. Incube as células apresentadoras de antígenos (APCs) conforme descrito na etapa 2. Adicione os APCs incubados e Brefeldin A (1:1.000) às células efetoras e co-incube por 6 h em uma incubadora a 39 °C.
  3. Transfira as células para um novo tubo de centrífuga, centrifugue a 440 x g por 5 min em temperatura ambiente e descarte o sobrenadante.
  4. Adicione 100 μL de coquetel de anticorpos (camundongo anti-pato CD8, 1:50) às células e incube por 30 minutos no escuro a 4 ° C.
  5. Lave as células centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 ° C e ressuspenda-as em 1 mL de PBS. Adicione um coquetel de anticorpos (Goat-Conjugated Goat Anti-Mouse IgG2b, 1:50) e incube por 30 min no escuro a 4 ° C.
  6. Lavar novamente as pilhas centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 100 μL de tampão de fixação e incube por 20-25 min no escuro a 4 ° C.
  7. Lavar as células mais uma vez centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Adicione 1 mL de tampão de permeabilização 1x e lave as células 2x por centrifugação a 440 x g por 5 min a 4 °C.
  8. Descarte o sobrenadante, ressuspenda as células em 100 μL de tampão de permeabilização e adicione o anticorpo (Mouse Anti-Duck IFN-γ, 1:10) às células. Após fixação e permeabilização da membrana, incubar a mistura célula-anticorpo durante 30 min na obscuridade, agitando ocasionalmente durante a incubação a 4 °C.
    NOTA: A solução de permeabilização/lavagem é uma solução estoque 10x e deve ser diluída com PBS antes do uso.
  9. Lave as células mais uma vez com 1 mL de PBS centrifugando a 400 x g por 5 min a 4 ° C. Adicione 100 μL de coquetel de anticorpos (Goat Anti-Mouse IgG3 conjugado com PE, 1:250) e incube por 30 min no escuro a 4 ° C.
  10. Analise os dados usando o software FlowJo. A estratégia de gating é mostrada na Figura 1.

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Resultados

Este protocolo foi desenvolvido com base em um estudo anterior sobre a detecção de respostas efetoras de células T específicas do antígeno em patos20. A primeira etapa do experimento envolve o cultivo in vitro de células T específicas do vírus, que servem como base para estudos subsequentes de resposta efetora. Inicialmente, as APCs foram incubadas e co-cultivadas com células efetoras. As observações morfológicas revelaram que, após a proliferação, as células exibiram crescimento de clust...

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Discussão

Este protocolo fornece um método eficiente para o cultivo in vitro de células T específicas do antígeno do pato e também estabelece um protocolo de coloração de citocinas intracelulares para patos, que pode ser usado para avaliar as respostas efetoras das células T. Atualmente, não há relatos publicados sobre protocolos de cultivo in vitro para células T de pato. Referenciamos principalmente protocolos para células T específicas de antígenos humanos, mas estamos comprom...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32473060 e 32461120064) (para MD e ML); Projeto de Pesquisa Básica e Aplicada de Guangzhou (2025A04J5445) (para MD); o Programa de Jovens Acadêmicos do Rio Yangtze (2024, Manman Dai); e o Young Peal River Scholar do "Plano de Apoio Especial de Guangdong" (2024, Manman Dai). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.

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Materiais

2
Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos de MICRO-Centrífuga de 1,5 mLBiosharpCat#BS-15-M
Tubos de centrífuga de 15 mLLabselectCat#CT-002-15A
2-mercaptoetanol (55 mM)Sigma-AldrichCat#M6250-100ML
Placa de cultura de tecidos de 48 poços (não tratado, fundo plano)BiofilCat#TCP000048
Tubos de centrífuga de 50 mLLabselectCat#CT-002-50A
Placas qPCR sem rodapé de 96 poçosLabselectCat#PP-96-NS-0100
BD Kit Cytofix/Cytoperm BDBioscienceCat#BD 554714
Brefeldin A (BFA)BD BioscienceCat#347688
Thermo FisherHeracell 150i GP
Kit de rotulagem Eppendorf5810R
CFSEAbcamCat#ab113853
ChamQ SYBR qPCR Master MixVazymeCat#Q341-02
Kit de isolamento de linfócitos do sangue periférico de patoTbdscienceCat#LTS1090D
Evo M-MLV RT PremixBiotecnologia PrecisaCat#AG11706
FastPure Isolamento Total de RNA de Células/Tecidos Kit V2VazymeCat#RC112-01
Soro Fetal BovinoGibcoCat#10437-028
Citômetro de fluxoBeckman CoulterBA43347
Tubo de FluxoBeyotimeCat#FFC005
FlowJo v10.8.1Tree Starhttps://www.flowjo.com
Goat Anti-Mouse 488, diluição 1:50AbbkineCat#A23210
IgG2b Anti-Rato de Cabra, FITC, diluição 1:50Southern BiotechCat#1091-31
IgG3 Anti-Rato de Cabra, PE, diluição 1:250Southern Biotech Cat#1100-09S
GraphPad prisma 8.0.2Software GraphPadhttps://www.graphpad-prism.cn
H5N1 AIV cepa DK383Laboratório de Engenharia Conjunta Nacional e Regional para Medicamen de Prevenção e Controle de ZoonosesA/Duck/Guangdong/383/2008
L-glutamina (200 mM)GibcoCat#25030081
MicroscópioMoticAE2000
Mouse Anti-Duck CD4, diluição 1:50Bio-RadCat#MCA2478
Mouse Anti-Duck CD8α, diluição 1:50GeneTex Cat#GTX41834
Mouse Anti-Duck IFN-γ mAb, diluição 1:10Preparado em nosso laboratório NA
NanoDrop One EspectrofotômetroThermo FisherAZY1603209
NEAA (não essencialGibcoCat#11140-050
PBSGibcoCat#10010023
PCR TermocicladorBiometraBiometra Tone 96G
Solução de penicilina-estreptomicinaGibcoCat#15070063
Sistema de PCR em tempo realApplied BiosystemsABI7500
IL-2 humana recombinante (10 μ g)USCNKCat#RPA111Ga01
Tampão de lise de glóbulos vermelhosTbdscienceCat#NH4CL2009
RPMI 1640GibcoCat#11875-119
Piruvato de sódio (100 mM)GibcoCat#11360-070
Trypan BlueSigma-AldrichCat#93595
Patos selvagens de duas semanas (Sheldrake)uma fazenda de patos em GuangzhouNA
Incubadora de CO

Referências

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