Artigo de método

Alterações dinâmicas na função pulmonar e no fluxo sanguíneo durante a progressão do adenocarcinoma pulmonar em camundongos por pletismografia de corpo inteiro e ultrassom Doppler

DOI:

10.3791/68306

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10 de junho de 2025

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1School of Clinical Medicine, Chengdu University of TCM, 2Chengdu Xinjin District Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3China Civil Affairs University, 4Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Neste artigo

Resumo

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Este protocolo utiliza a função pulmonar de camundongos e a ultrassonografia com Doppler como técnicas investigativas, oferecendo um método não invasivo, simples e eficiente para o estudo do adenocarcinoma de pulmão.

Resumo

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O adenocarcinoma de pulmão (LUAD) é um tumor pulmonar maligno comum, e sua progressão leva a alterações na ventilação e no fluxo sanguíneo, destacando as características funcionais distintas do pulmão em condições patológicas. O sistema não invasivo de pletismografia de corpo inteiro (WBP) permite o monitoramento em tempo real da função pulmonar e da capacidade de resposta das vias aéreas em camundongos acordados, evitando a interferência da traqueotomia e da anestesia. O ultrassom Doppler (DU) de pequenos animais, utilizando tecnologia de imagem de alta frequência, captura de forma não invasiva estruturas microvasculares e alterações na velocidade do fluxo sanguíneo pulmonar, oferecendo suporte crucial para investigar anormalidades de ventilação e perfusão associadas ao LUAD. Neste estudo, um modelo LUAD foi estabelecido em camundongos A/J usando 100 mg/kg de 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK). WBP combinada com DU foi empregada para monitorar a função pulmonar e os parâmetros hemodinâmicos em camundongos. Os resultados revelaram um declínio significativo (p < 0,05) nas principais métricas, incluindo 50% de fluxo expiratório (FE50), ventilação minuto (VM), pico de fluxo expiratório (PFE), pico de fluxo inspiratório (PIF), pausa aumentada (Penh) e volume corrente (VC), bem como uma redução acentuada na velocidade do fluxo sanguíneo arterial pulmonar (p < 0,05) no grupo modelo durante a progressão do tumor. Essa abordagem combinada captura efetivamente as interrupções funcionais que ocorrem durante o desenvolvimento patológico do LUAD em camundongos, fornecendo um método não invasivo e eficiente para o avanço da pesquisa em doenças respiratórias.

Introdução

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O adenocarcinoma de pulmão (LUAD) é o subtipo mais comum de câncer de pulmão de células não pequenas1. Com o aumento da poluição ambiental, do uso de tabaco e do envelhecimento da população, a prevalência global de DAU tem aumentado anualmente 2,3,4. Estudos atuais indicam que os pacientes experimentam declínios progressivos na função pulmonar e distúrbios hemodinâmicos à medida que o LUAD avança 5,6,7,8. O desenvolvimento de métodos não invasivos, eficientes e econômicos para rastrear e avaliar a função pulmonar e as flutuações do fluxo sanguíneo da artéria pulmonar pode fornecer evidências críticas para o manejo clínico do LUAD.

Pesquisas existentes demonstram que o crescimento do tumor LUAD obstrui progressivamente as vias aéreas, reduz a capacidade pulmonar e a ventilação9 e desencadeia a secreção de citocinas inflamatórias que exacerbam a estenose das vias aéreas por meio de inflamação crônica localizada10. Consequentemente, a diminuição da função pulmonar leva a agravamento da hipóxia e anormalidades do fluxo sanguíneo11,12. Essas alterações patológicas geralmente se manifestam clinicamente como dispneia progressiva e aperto no peito. Embora a TC não consiga capturar anormalidades dos parâmetros de função pulmonar em tempo real ou alterações hemodinâmicas induzidas pela progressão do LUAD, as tomografias repetidas de curto prazo também aumentam a exposição à radiação13. Em contraste, a pletismografia de corpo inteiro (WBP) e a fluxometria de ultrassom Doppler servem como abordagens complementares não invasivas, fáceis de operar e reprodutíveis para monitoramento dinâmico. A integração dessas técnicas para monitorar a função pulmonar e a hemodinâmica pode melhorar a avaliação da progressão da doença e a tomada de decisões terapêuticas.

Neste estudo, utilizamos 4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona (NNK) em camundongos A/J para modelar a iniciação e progressão do LUAD. A função pulmonar e as alterações hemodinâmicas foram monitoradas longitudinalmente por meio de WBP e ultrassonografia com Doppler (DU) nas semanas 4, 10 e 20. Esta abordagem visa fornecer novos insights sobre a fisiopatologia e as estratégias terapêuticas do LUAD.

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Protocolo

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Todos os experimentos com animais descritos neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Bem-Estar Animal da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu e foram conduzidos em conformidade com as leis e padrões relevantes para ética em pesquisa animal (20240616IV). Camundongos fêmeas endogâmicos A/JGpt (7-8 semanas de idade) foram mantidos a 20-24 °C e umidade relativa de 40%-70%. Ao longo do ciclo claro-escuro de 12 horas, os camundongos receberam ração animal padrão e água purificada. Os animais foram aclimatados a esse ambiente 7 dias antes do início dos experimentos.

1. Criação e preparação do modelo animal

  1. Dissolva o NNK em solução salina normal para preparar uma solução de reserva com uma concentração de 10 mg/ml.
  2. Meça a função pulmonar usando WBP nas semanas 4 (dia 28 após a modelagem), 10 (dia 70 após a modelagem) e 20 (dia 140 após a modelagem). A velocidade do fluxo sanguíneo arterial pulmonar foi medida usando DU na semana 20 (dia 140 após a modelagem). Antes de cada medição, coloque os ratos em um ambiente apropriado para minimizar o estresse.

2. Teste de função pulmonar não invasivo

NOTA: O sistema WBP mede a função respiratória em animais acordados e em movimento livre usando uma câmara de medição especialmente projetada. A câmara é equipada com telas de pneumotac, que permitem que o ar entre e saia da câmara. A resistência do ar criada pelas telas de pneumotacômetro causa pequenas mudanças de pressão na câmara em relação ao ar ambiente. Um transdutor de pressão sensível é conectado para medir essas mudanças de pressão dentro da câmara, a partir do qual o fluxo pode ser derivado (chamado fluxo de caixa). O software fornece parâmetros respiratórios, como fluxo e volume, juntamente com relatórios em tempo real.

  1. Obtenha os seguintes componentes principais: controlador WBP, transformador de potência do controlador, barra de console, cabo de barra de console longo e cabo de barra de console curto, coluna do calibrador, pletismógrafo WBP, transdutor de fluxo, sonda de temperatura e umidade, cabeça do nebulizador (roxo), filtro de fluxo de polarização e tubulação, PC.
  2. Monte o hardware conforme descrito abaixo.
    1. Execute a conexão do painel traseiro conforme descrito abaixo.
      1. Conecte a unidade controladora ao computador usando um cabo USB 2.0 e certifique-se de que a conexão esteja estável.
      2. Encha a coluna com água da torneira até a linha de enchimento de água, conecte-a à porta na parte traseira do controlador e certifique-se de que a linha esteja seca.
      3. Conecte o transformador de energia na parte traseira do controlador, certificando-se de que esteja bem conectado.
      4. Dependendo de onde a régua de console é colocada, escolha um cabo de régua de console longo ou curto para conectar à parte traseira do controlador.
      5. Empurre a unidade controladora no lugar e organize a coluna de calibração e o transformador de potência.
    2. Execute a conexão do painel frontal conforme descrito abaixo.
      1. Conecte cada sensor de fluxo na porta identificada como Sensor. Conecte cada filtro de fluxo de polarização e tubulação na porta do controlador identificada como Bias Flow no painel frontal. Conecte um resistor de isolamento de fluxo de polarização à extremidade aberta do tubo de fluxo de polarização.
    3. Execute a conexão da câmara conforme descrito abaixo
      1. Coloque a câmara na frente da unidade controladora, certificando-se de que ela seja colocada em uma superfície sólida e estável, livre de vibrações.
      2. Conecte o sensor de fluxo à câmara e oriente o sensor de forma que o sinal DSI fique voltado para cima.
      3. Conecte a tubulação de fluxo de polarização (com resistor de isolamento) à porta inferior do pletismógrafo.
      4. Remova o plugue na parte superior do pletismógrafo e substitua-o por uma cabeça nebulizadora (roxa).
  3. Configure o software conforme descrito abaixo.
    1. Inicie o software do programa de controle e faça login. Na página inicial do controlador, clique em Configuração de hardware. Inicie o assistente de configuração clicando em Nova configuração, selecione WBP (número de série: DEMO-061) e clique em Avançar.
    2. No menu suspenso Espécies, selecione Mouse. Defina a taxa de fluxo para os valores padrão. Selecione 4 locais (cada local corresponde a uma câmara, com um máximo de 4 câmaras por sessão). Certifique-se de que a taxa de fluxo de polarização para todos os sites ativos seja consistente. Combine os sites no software com as portas reais no controlador WBP. Por fim, clique em Concluir para concluir a configuração.
  4. Recolha de dados
    1. Abra o programa principal e calibre as câmaras, pois esta etapa é crítica. Passe o mouse sobre o hardware para exibir um ícone de ferramenta amarelo. Clique no ícone para entrar na interface de calibração e, em seguida, clique em Todos para calibrar as câmaras para todos os quatro animais simultaneamente.
    2. Crie o protocolo de estudo necessário selecionando o Estudo de Resposta à Dose em Criar Opções de Estudo. Defina a configuração do GLP para não seguir o GLP.
    3. Para configurar parâmetros de medição e sequências de tarefas, clique em Novo parâmetro para abrir o Construtor de parâmetros e adicionar os parâmetros a serem medidos. Use as configurações padrão para a sequência de tarefas.
    4. Para iniciar a coleta de dados, navegue até a página Meu Laboratório na estação de trabalho e arraste e solte o protocolo de estudo preparado no WBP para mouse.
    5. Clique no botão triângulo vermelho de cada site para iniciar a aquisição de dados. Para iniciar todos os quatro sites simultaneamente, clique em Sessão > Confirmar todos os sites. Depois de iniciar a aquisição, a estação de trabalho abrirá a página Configurar aquisição e a usará para editar as informações de cada mouse nos sites de aquisição.
    6. Clique sequencialmente em Sessão > Confirmar todos os Sites para iniciar a coleta de dados. Para garantir que os resultados experimentais sejam verdadeiros e confiáveis, estabilize os camundongos experimentais em uma sala silenciosa por 30 minutos antes.
    7. Coloque os mouses silenciosos no frasco de teste completamente lacrado. Clique na opção Iniciar no sistema para coletar dados. O sistema coleta dados a cada 2 s, portanto, colete pelo menos 10 min. Intercepte 4 minutos de dados no meio. Aqui, cinco animais foram testados em cada grupo, e o teste foi repetido 3x.
    8. Clique em Criar Relatório na página Estudo e selecione o tipo de relatório. Salve os dados experimentais em formato de planilha. Neste experimento, a taxa de pico de fluxo expiratório (PFE), a taxa de pico de fluxo inspiratório (PIF), a pausa aumentada (Penh) e o volume corrente (VC) foram usados para avaliar a função pulmonar de camundongos.

3. Medição da velocidade do fluxo sanguíneo arterial pulmonar

  1. Preparação animal
    1. Coloque o camundongo em uma câmara de indução de anestesia e anestesie com isoflurano a 5% (fluxo: 1 L/min). Prenda o mouse em uma plataforma de manuseio de animais, mantendo a temperatura da plataforma em 35-37 °C para preservar a temperatura corporal.
    2. Posicione a boca e o nariz do mouse em uma máscara de anestesia. Mantenha a anestesia com 1%-2% de isoflurano (taxa de fluxo: 0,6-1 L/min). Quando o camundongo mantém uma posição supina estável com frequência cardíaca estável e ritmo respiratório regular, relaxamento muscular completo, ausência de movimento dos membros, sem resposta de contração das vibrissas, desaparecimento do reflexo de retirada do pedal, membranas mucosas rosadas e sem dilatação pupilar, considera-se que atingiu uma profundidade de anestesia adequada.
    3. Nesta fase, aplique 2-3 mg de pomada veterinária no saco conjuntival inferior usando um cotonete estéril. Acaricie suavemente as pálpebras superiores e inferiores para promover o fechamento sem comprimir o globo ocular, garantindo uma distribuição uniforme da pomada pela superfície da córnea.
  2. Preparação da área de imagem
    1. Remova os pelos do peito usando creme depilatório e um dispositivo depilatório. Limpe a área tratada com uma gaze úmida ou lenço umedecido e, em seguida, aplique o agente de acoplamento pré-aquecido a 37°C uniformemente com um cotonete para obter uma espessura uniforme de 0,3 mm, garantindo a ausência de bolhas de ar visíveis.
  3. Ultrassonografia com Doppler
    1. Use uma sonda de ultrassom Doppler de 40 MHz para medir a velocidade do fluxo sanguíneo arterial pulmonar a partir da visão do eixo longo paraesternal. Incline a sonda 45° para a esquerda e a mesa de operação 15° para a direita. Abaixe a sonda do lado direito do tórax e ajuste os eixos X e Y para localizar o ventrículo direito e a artéria pulmonar, guiados por suas relações espaciais anatômicas, características morfológicas e direção do fluxo hemodinâmico.
    2. Pressione o botão CF para alternar para o modo Doppler. Visualize o sinal azul do fluxo sanguíneo arterial pulmonar. Posicione a linha de amostragem na artéria pulmonar e pressione o botão PW para exibir o espectro do fluxo sanguíneo arterial pulmonar.
    3. Pressione o botão Congelar para congelar a imagem e, em seguida, pressione o botão Medir e selecione a opção Velocidade na tela sensível ao toque. Coloque a linha de medição no pico do espectro para obter a velocidade máxima do fluxo sanguíneo arterial pulmonar.
  4. Aquisição de dados
    1. Use o software de análise off-line para selecionar os dados do Doppler pulsado da artéria pulmonar. Acesse o pacote de medidas do Pacote Cardíaco, selecione a função VD e PV e emita a velocidade do fluxo sanguíneo arterial pulmonar e as imagens salvas.

4. Análise dos dados

  1. Use R4.4.2 e GraphPad Prism 9.5.1 para análise de dados e plote os dados. As comparações intergrupos dos dados de função pulmonar foram realizadas usando o teste t de amostras independentes, enquanto as comparações intragrupos utilizaram ANOVA de medidas repetidas. As comparações da velocidade do fluxo arterial pulmonar entre os grupos foram analisadas com o teste t de amostras independentes, com significância estatística fixada em p < 0,05.

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Resultados

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Para validar a viabilidade, acurácia e reprodutibilidade da metodologia de avaliação da função pulmonar e do fluxo sanguíneo arterial pulmonar, plotamos as curvas médias minuto a minuto de PIF, PFE e fluxo expiratório a 50% da capacidade vital (FE50, 10x ampliado) durante o período de monitoramento da 4ª semana no grupo em branco (Figura 1A). Como mostrado neste painel, as três curvas correspondentes exibem um alto grau de conformidade na forma. Apesar das mudanças absolutas mínimas, particu...

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Discussão

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Neste estudo, NNK combinado com camundongos A/J foi selecionado para fazer um modelo de adenocarcinoma de pulmão de acordo com relatórios anteriores. Estudos relevantes mostraram que NNK combinado com camundongos A/J pode começar a ter formação tumoral mínima na10ª semana e formação tumoral estável na16ª a20ª semana18,19. Portanto, selecionamos o teste na4ª semana após a injeção para ob...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos ao professor Cong Huang, da Escola de Ciências Médicas Básicas da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu, por seu apoio. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Ciência e Tecnologia de Sichuan (Número de Aprovação do Projeto: 2024YFFK0173)

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Camundongos A/JGemPharmatech LLC.
tubos EDTA de 0,5mlLabshark 
1-Butanona,4-(metilnitrosoamino)-1-(3-piridinil)Gu Shi Gong Yuan Medical Equipment Co.
75% de etanolChengDu Chron Chemicals Co,. Ltd2023052901
Câmara de indução de anestesiaShanghai Tawans Intelligent Technology Co., Ltd.MZ-MR
Depilatory creamShanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.
Dispositivo depilatórioShanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.3180
IsofluranoShanghai Duma Biotechnology Co., Ltd.DM-M9462
Fita médicaBeijing Lanbokangs Technology Co., Ltd.19-5023
MedChemexpress69652
PBS, Ltd.A-RY5256
Solução salina (medicina)Beijing Biolabs Technology Co.GL1736‌
Agente de acoplamento de ultrassomQisheng (Shanghai) Medical Equipment Co., Ltd.
N000018130201070N589770Fornecedor verificado - 20230623 solução médica Shanghai Fusheng Co. do tampão de 20212060273

Referências

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