Artigo de investigação

Avaliação multimodal do efeito protetor do gentiopicrosídeo na lesão celular HepG2 induzida por CDCA

DOI:

10.3791/68320

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25 de julho de 2025

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1School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2TCM Regulating Metabolic Diseases Key Laboratory of Sichuan Province, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Internal Medicine of Traditional Chinese Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 4Institute of High Altitude Multimorbidity/TCM-Integrated High Altitude Medicine Center, Hospital of Chengdu University of TCM, 5Chengdu Tianxing Zhiyuan Biotechnology Co., Ltd.

Neste artigo

Resumo

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Este estudo demonstrou que o gentiopicrosídeo pode tratar a lesão hepática colestática, controlando a produção e o metabolismo de ácidos biliares e lipídios e prevenindo o estresse oxidativo e as respostas inflamatórias.

Resumo

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O principal componente ativo da Swertia chirayita, o gentiopicrosídeo (GPS), demonstrou proteger o fígado em casos de colestase. A fim de elucidar o mecanismo protetor do GPS na lesão hepática colestática, as células HepG2 foram tratadas com ácido quenodesoxicólico (CDCA) para simular o ambiente de colestase in vitro, e o método CCK-8 foi usado para determinar o efeito protetor do GPS nas células HepG2. Usando um kit biológico, foram detectados os conteúdos intracelulares de TBA, T-CHO, TG, ALP, ALT, AST, GSH, IL-1β, IL-6, TNF-α, SOD e MDA. A microscopia confocal a laser foi usada para confirmar o nível de ROS. As expressões das células HepG2 de SHP-2, Tgr5, CYP7A1 e NTCP foram avaliadas usando imunofluorescência e análise de Western blot. O software Autodock foi então usado para verificar o docking molecular de seus principais ingredientes ativos. Os resultados demonstraram que o GPS evitou significativamente os danos que o CDCA causou às células HepG2. Esse efeito protetor pode ter sido alcançado controlando a produção e o metabolismo de ácidos biliares e lipídios dentro da célula e prevenindo o estresse oxidativo e as respostas inflamatórias.

Introdução

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O local metabólico do sistema digestivo do corpo é o fígado. A secreção biliar é um mecanismo chave no processo de catabolismo de gordura do sistema hepatobiliar. Os constituintes primários da bile, os ácidos biliares, são liberados pelas células do fígado e são cruciais para preservar o equilíbrio do metabolismo da gordura. Tanto para indivíduos saudáveis quanto para casos doentes, os processos fisiológicos e patológicos do fígado dependem do equilíbrio de ácidos biliares livres e conjugados no fígado. Se esse equilíbrio for perturbado, a circulação de ácidos biliares não funcionará normalmente, o que pode levar à colestase intra-hepática e subsequente dano hepático1. De acordo com pesquisas já realizadas, a lesão hepática colestática (CLI) é uma condição ligada a distúrbios metabólicos, desequilíbrio da microbiota intestinal e necrose das células hepáticas2. É causada por uma obstrução do fluxo biliar e pelo acúmulo de ácidos biliares nas células do fígado para CLI. Casos graves de CLI podem progredir para cirrose hepática, fibrose hepática e insuficiência hepática3. Atualmente, o mecanismo subjacente à CLI ainda é um tanto obscuro e complexo, e a maioria dos pacientes recebe baixa eficácia da terapia medicamentosa4 , juntamente com efeitos colaterais significativos5. Como resultado, uma das questões mais urgentes que a comunidade médica enfrenta hoje é a busca por medicamentos CLI eficazes.

A pesquisa atual demonstrou a importância de alguns receptores nucleares no metabolismo do ácido biliar6. Entre estes, o receptor de ácido biliar é um receptor regulador crucial do ácido biliar que pode se ligar aos BAs e ativar a proteína tirosina fosfatase (SHP)7. Por outro lado, o acúmulo excessivo de ABs nos hepatócitos que resulta em colestase inibiria negativamente o receptor SHP e ativaria o receptor CYP7A1 (citocromo P450 7A1), o que levaria à produção de ácido biliar8. Além disso, bloqueou o receptor de ácido biliar acoplado à proteína G TGR5 de secretar BAs e estimulou o receptor polipeptídico cotransportador de taurocolato de sódio (NTCP) a transportar BAs. Faz com que os ácidos biliares se acumulem nas células do fígado, o que danifica o fígado9. Consequentemente, pesquisas adicionais sobre esse mecanismo podem lançar luz sobre opções de tratamento de CLI mais viáveis.

Com uma longa história de uso na medicina, Swertia chirayita é uma medicina tradicional tibetana chinesa. É considerado o melhor Tida e é freqüentemente usado pelos habitantes locais para tratar doenças da vesícula biliar e do fígado10. É frequentemente usado para tratar cálculos biliares, colecistite, cirrose, hepatite e outras doenças hepáticas11. Pesquisas recentes revelaram que alguns componentes químicos iridóides do Swertia, bem como seus ingredientes ativos, têm um bom efeito terapêutico em doenças hepáticas, como fibrose hepática e lesão hepática aguda 12,13,14. Os ingredientes ativos da Swertia chirayita aliviam a doença hepática, diminuindo a inflamação15 e suas propriedades antioxidantes16. Nossa pesquisa preliminar demonstrou que a fórmula composta da medicina tibetana com Swertia chirayita como ingrediente principal exibe um efeito terapêutico favorável no CLI, sugerindo que Swertia chirayita tem potencial como tratamento para CLI17. O principal ingrediente ativo extraído e purificado da Swertia chirayita é o GPS (Gentiopicrosídeo)18, que possui uma série de ações farmacológicas, como proteção do fígado19, regulação do metabolismo da glicose20, melhora do microbioma intestinal21 e propriedades antitumorais22. Pesquisas anteriores demonstraram que o GPS melhora o dano hepático em condições colestáticas e diminui a colestase intra-hepática ao regular positivamente a expressão de transportadores de ácidos biliares23,24. Semelhante a isso, pesquisas realizadas in vivo e in vitro demonstraram que o GPS pode diminuir os danos ao fígado, aumentando o metabolismo lipídico, reduzindo a inflamação e reduzindo o estresse oxidativo25,26.

As células HepG2 são frequentemente utilizadas em estudos in vitro de doenças hepáticas porque exibem atividade enzimática metabólica dos hepatócitos27. Enquanto isso, os hepatócitos podem secretar mais bile quando expostos a uma das quatro formas de ácidos biliares livres, que incluem o CDCA28. Como resultado, o CDCA pode ser empregado para criar um modelo celular de lesão hepática colestática e imitar o ambiente colestático in vitro. Dado que a lesão de hepatócitos induzida por CDCA é criticamente mediada por estresse oxidativo e vias inflamatórias e considerando os efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios documentados do GPS em outros contextos hepáticos26, levantamos a hipótese de que o GPS pode conferir proteção contra lesão hepática colestática, aliviando a citotoxicidade induzida por CDCA em células HepG2. Este trabalho investigou o efeito protetor do GPS na CLI e seu mecanismo molecular usando um modelo de dano induzido por CDCA às células HepG2.

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Protocolo

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Cultura e tratamento celular
As células HepG2 e o meio MEM foram adquiridos de um fornecedor comercial. As células HepG2 foram cultivadas em meio MEM suplementado com 10% de FBS, 1% de penicilina 100 U/mL e 100 U/mL de estreptomicina, a 37 °C e 5% de CO2 atmosfera. Após a adesão celular, os meios de cultura foram alterados. As células foram cultivadas na proporção de 1:3 após 2-3 dias e foram utilizadas no experimento quando a cultura de células atingiu 80% de confluência.

Ensaio de viabilidade celular
No dia 1, as células foram semeadas em 2 x 104 células HepG2 (2 x 105 células/mL, 100 μL por poço) em uma placa de 96 poços em seis repetições29. No dia 2, após 24 h de inoculação, as células foram tratadas com CDCA em diferentes concentrações de CDCA (0, 20, 40, 60, 80, 100 μM) por 12 h. A viabilidade celular foi detectada pelo método CCK-8. Após 24 h de semeadura celular inicial, as células foram tratadas com CDCA em diferentes concentrações de GPS (0, 25, 50, 100, 200, 400 e 800 μM) por 24 h. No dia 3, a viabilidade celular foi detectada pelo método CCK-8. No dia 4, 2 x 104 células HepG2 (2 x 105 células/mL, 100 μL por poço) foram semeadas em uma placa de 96 poços em seis repetições por 24 h. No dia 5, as células são separadas em seis grupos: Controle, Modelo, Ácido Ursodesoxicólico (UDCA) e GPS: 25 μM, 50 μM e 100 μM. Excluindo o grupo controle, a solução de CDCA 60 μM foi adicionada a todos os grupos por 12 h. Em seguida, a solução UDCA (60 μM) e a solução GPS (25 μM, 50 μM e 100 μM) foram adicionadas por 24 h, ao UDCA e aos 3 grupos GPS, respectivamente. No dia 6, a viabilidade celular foi detectada pelo método CCK-8.

Ensaio de citocinas
De acordo com a literatura relatada, os kits TNF-α, IL-6 e IL-1β foram usados para detectar os níveis de fatores inflamatórios em células HepG2 após diferentes tratamentos30. Após 24 h de intervenção CDCA ou CDCA+GPS, descartar o meio de cultura e enxaguá-lo com PBS. Centrifugar a suspensão celular a 69 x g durante 10 min, rejeitar o sobrenadante e retirar o precipitado celular. Adicione a solução de PBS e homogeneize em condições de banho de água gelada para preparar homogeneizados de células. Após centrifugação de 10 min a 10.005 x g e 4 °C, o sobrenadante foi removido e a técnica de BCA foi utilizada para medir a proteína total no conteúdo celular. De acordo com as instruções do fabricante, os níveis de TNF-α, IL-6 e IL-1β no sobrenadante celular foram determinados por ELISA. A absorbância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas multifuncional.

Detecção de TBA, TG e T-CHO
Os testes TBA, TG e T-CHO foram utilizados de acordo com as instruções do kit para identificar o metabolismo de ácidos biliares e lipídios das células HepG231. TBA, TG e T-CHO foram adquiridos comercialmente. Depois que os precipitados celulares foram quebrados por ultrassom em banho de água gelada, o homogeneizado celular foi preparado adicionando lisado RIPA por 30 min. A absorbância foi medida a 450 nm usando um leitor de microplacas multifuncional. Após a adição de soluções de trabalho BCA a cada poço e a homogeneização das células, a absorbância foi medida a 562 nm usando um enzimoleter, e o período de incubação foi de 30 min A absorbância do produto padrão foi usada para construir a curva padrão, e a seguinte fórmula foi usada para obter o valor de absorbância:
Conteúdo de TBA (μmol/gprot) = (Umaamostra-A em branco)/(Umpadrão -Aem branco)×C calibração/Cpr
T-CHO, conteúdo de TG (mmol/gprot) = (Umaamostra-A em branco)/(Umpadrão-A em branco)×C padrão/Cpr

Avaliação da função hepática
A função hepática foi avaliada usando ALT, AST e ALP. ALT, AST e ALP foram comprados comercialmente. Após duas rodadas de limpeza do tampão PBS nas células coletadas, as células foram centrifugadas por 10 min a 69 x g, o sobrenadante foi removido, as células foram precipitadas, o tampão PBS foi adicionado e o homogeneizado foi criado por esmagamento ultrassônico em banho de água gelada. Os orifícios de teste e controle foram então definidos. A mesa de operação foi seguida enquanto adicionava o reagente, agitando e misturando suavemente a placa do orifício e deixando-a descansar em temperatura ambiente por 15 min. O valor OD de cada furo foi determinado usando um enzimoleter com comprimento de onda de 505 nm. O valor absoluto de DO foi então inserido na curva padrão e uma análise quantitativa adicional foi realizada usando a fórmula.

Determinação das atividades SOD, MDA, GSH
A atividade de SOD, o teor de MDA e o conteúdo de GSH foram avaliados de acordo com as instruções do fabricante, respectivamente. SOD, MDA e GSH foram comprados comercialmente. Para resumir, uma placa de seis poços foi usada para inocular as células. Após o tratamento, as células foram submetidas a pré-tratamento (coleta e quebra) de acordo com as instruções experimentais do kit. As soluções de trabalho apropriadas foram então despejadas na placa de detecção de células após a configuração de furos em branco, furos padrão e furos de medição de acordo com as etapas de operação das instruções. Posteriormente, as células são cultivadas na temperatura e duração mencionadas nas instruções do kit. Um kit de detecção de BCA foi então usado para quantificar o teor de proteína. Por fim, a absorbância foi determinada no comprimento de onda apropriado e uma análise quantitativa mais completa do índice de estresse oxidativo foi realizada.

Detecção de alterações em ROS em células HepG2 usando sonda DCFH-DA
Foi realizada cultura de rotina para contagem de células. Células HepG2 com densidade de 1 x 105 células/mL foram inoculadas em placas com fundo de vidro a 1,5 mL cada e cultivadas de acordo com o método acima. Após o cultivo, o meio foi descartado e as células foram lavadas com PBS. O DCFH-DA foi diluído a uma concentração de 1:1000, adicionado a 1,5 mL de diluente por poço e incubado por 20 min. Após a incubação, as células foram enxaguadas 3x com solução de cultura básica MEM. Em seguida, 100 μL de meio de montagem antidesbotamento com DAPI foram adicionados a cada prato. Um microscópio confocal de fluorescência foi usado para visualizar e tirar fotos a 488 nm para excitação e 525 nm para emissão32.

Imagem de imunofluorescência
As células foram lavadas 3x com tampão PBS após a incubação. Após serem fixadas por 30 min com paraformaldeído a 4%, as células foram limpas com tampão PBS em mesa vibratória. O diluente foi adicionado e, em seguida, refrigerado a 4 ° C longe da luz durante a noite. Em seguida, as células foram revestidas com diluente fluorescente e incubadas longe da luz por 1 h a 37 °C. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com tampão PBS. Após fixação com paraformaldeído a 4% por 30 min, as células foram enxaguadas com tampão PBS em agitador rotativo. Posteriormente, 150 μL de diluente de anticorpo primário foram adicionados e incubados durante a noite a 4 ° C sob condições de proteção contra a luz. O diluente primário de anticorpos foi recuperado, seguido pela adição de um volume adequado de tampão PBS e agitação por 5 min; Este procedimento de lavagem foi repetido três vezes. Cada placa recebeu 150 μL de diluente de anticorpo secundário fluorescente e foi incubada a 37 ° C por 1 h em uma incubadora protegida contra luz. Um volume apropriado de tampão PBS foi adicionado a cada prato e lavado em um agitador rotativo por 8 min, repetido por três ciclos. Finalmente, as células foram cobertas com solução de coloração DAPI suficiente por 10 min, montadas com meio de montagem antifade e fotografadas usando um sistema de imagem de super-resolução33.

Análise de Western blot
Após vários tratamentos, toda a proteína das células HepG2 foi extraída usando lisado RIPA, e a concentração de proteína foi determinada usando a técnica de BCA. Após isolar a proteína alvo usando 10% de SDS-PAGE, ela foi transferida para uma membrana de PVDF de 0,45 μm. Em seguida, a membrana foi selada por 1,5 h a 25 °C com 5% de BSA. Anticorpos primários contra SHP-2 (1:1000), CYP7A1 (1:1000), Tgr5 (1:1000), NTCP (1:1000) e β-actina (1:1000) foram incubados durante a noite a 4 ° C. Em seguida, a membrana foi incubada com anticorpo secundário anti-imunoglobulina G de cabra (1:10000) conjugado com peroxidase de rábano por 2 h a 25 °C. As bandas revestidas com peroxidase foram então vistas usando uma solução quimioluminescente de ECL de sensibilidade ultra-alta, e as fotos foram tiradas usando um sistema de imagem34.

Acoplamento molecular
Conforme relatado, o processo de docking molecular foi realizado de acordo com os seguintes procedimentos35. A estrutura da droga small molecule.mol2 foi baixada da plataforma ChemicalBook, e a estrutura da proteína ligante .sdf foi baixada das plataformas Uniprot e RCSBPDB. As moléculas de ligante e água foram removidas pelo software Pymol, e a proteína ligante foi importada para o software AutoDock para hidrogenação e detecção. A saída final está no formato .pdbqt. As análises da caixa de encaixe, RunAutoGrid, RunAutoDock e AutoDock Tools foram realizadas no software AutoDock, e a energia mínima de ligação de cada grupo de resultados de encaixe foi salva. A conformação com a menor energia de ligação livre de cada grupo foi selecionada, e sua conformação ligante-receptor foi visualizada pelo software Pymol.

Análise estatística
Os dados acima mencionados foram classificados estatisticamente usando o GraphPad Prism 9.2, e todos os resultados experimentais foram relatados como Média ± DP. Para comparar estatisticamente os dados entre os grupos, foi empregada a ANOVA One-way. A diferença entre os dois grupos foi considerada significativa quandop < 0,05.

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Resultados

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A concentração de CDCA foi definida para gradiente de concentração de 0 μM, 20 μM, 40 μM, 60 μM, 80 μM e 100 μM para experimentos. Quando a concentração de CDCA foi de 60 μM, a atividade celular foi significativamente diferente da do grupo Controle e, finalmente, 60 μM foi usada como concentração de CDCA (Figura 1A). Os resultados mostraram que após a incubação por 24 h após a administração do medicamento, não houve diferença significativa na atividade celular entre cada grupo e o grupo Cont...

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Discussão

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A CLI é uma doença hepática causada pela obstrução da formação, secreção ou excreção da bile. Manifesta-se clinicamente como prurido, osteoporose e evolui até mesmo para fibrose hepática, cirrose e outras doenças, que colocam seriamente em risco a vida e a saúde 36,37,38. O UDCA é reconhecido como o medicamento mais comumente utilizado no tratamento da CLI39. No entanto, ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho é apoiado pela Fundação de Ciências Naturais da Província de Sichuan (2024NSFSC0697), Projeto do Fundo Conjunto de Inovação da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Chengdu (LH202402015).

Contribuição do autor:
Caitong Wu: Metodologia, análise formal, curadoria de dados, redação do rascunho original e redação e edição. Yang Xiao: Conceituação, investigação, visualização e validação. Fuhan Fan: Validação e edição. Zhangli Lei, Xianhua Zhou e Xianli Meng: Edição e tradução. Yong Zeng, Hou Ya e Peng Shen: Conceituação, metodologia, validação, investigação, revisão e correção do rascunho e supervisão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
ALP Nanjing Jiancheng Instituto de BioengenhariaA059-2-2
ALTNanjing Jiancheng Instituto de BioengenhariaC009-2-1
ASTNanjing Jiancheng Instituto de BioengenhariaC010-2-1
BCABoster Biological Technology Co., LtdAR0146
CDCAChengdu Medesheng Technology Co., Ltd474-25-9
pilha que conta o kit-8Boster Biological Technology Co., LtdAR1160-500
Anticorpo do citocromo P450 7A1Abmart Shanghai Co., Ltd.
DAPIBeyotime BiotechnologyC1005
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
IgG anti-coelho de cabra (H & L)Chengdu Zen-Bioscience Co., Ltd.
cabra anti-coelho IgG AF488Abmart Shanghai Co., Ltd.
GPSChengdu Medesheng Technology Co., LtdRP210717
GSHNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA006-2-1
HepG2 célulasProcell Life Science & Technology Co., LtdCL-0103
HRP IgG Anti-Coelho para Cabras Wuhan  ABclonal  Biotechnology Co., Ltd. AS014
IL-1βElabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0149c
IL-6Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H6156
MDANanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA003-1-2
MEM base médiaProcell Life Science & Technology Co., LtdPM150410
PBSBoster Biological Technology Co., LtdPYG0021
Buffer de transferência rápida (20 vezes;)NCM BiotechWB4600
RIPABoster Biological Technology Co., LtdBL651A
ROSBeyotime BiotechnologyS0033S
SHP2 Coelho pAbWuhan  ABclonal  Biotechnology Co., Ltd. A12486
SLC10A1 AnticorpoAbmart Shanghai Co., Ltd.
SODNanjing Jiancheng Instituto de BioengenhariaA001-3-1
TBANanjing Jiancheng Instituto de BioengenhariaE003-2-1
T-CHONanjing Jiancheng Instituto de BioengenhariaA111-1-1
TGNanjing Jiancheng Instituto de BioengenhariaA110-1-1
TGR5 Anticorpo PoliclonalEmpresa de biotecnologia ImmunoWayYT4636
TNF-&alfa;Elabscience Biotechnology Co., LtdE-EL-H0109c
Solução de tripsina (0,25%)Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd40126ES60
UDCAChengdu Lemetian Medical Technology Co., LtdDSTDX007601
β-Actin Rabbit mAbWuhan  ABclonal  Biotechnology Co., Ltd. AC026
TD2612S511202M21012MPU276166S

Referências

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